專利名稱:一種枯草芽孢桿菌氨肽酶在酵母抽提物制備中的應用的制作方法
技術領域：
一種食品級枯草芽孢桿菌固體氨肽酶在酵母抽提物制備中的應用，屬于酶制劑、食品添加劑技術領域：
。
背景技術：
酶制劑是指從生物中提取的具有酶特性的一類物質，已廣泛應用在食品、釀造、制藥、有機酸、淀粉糖、飼料、紡織、皮革、洗滌劑及保健品等各個領域，應用領域越來越廣泛。食品與人們的生活密切相關，因此酶在食品工業(yè)中的應用價值越來越重要，目前在烘焙、奶制品、肉類加工、新型營養(yǎng)食品和蛋白質的水解中得到很大的體現(xiàn)。
隨著科技的發(fā)展，酶制劑的應用越來越廣泛，氨肽酶的應用領域也在不斷拓展。國際上已有諾維信風味蛋白酶Flavorzyme (屬內外切復合酶);AB公司LAP (液體復合酶,只有部分氨肽酶活力)；日本天野公司有系列肽酶ProteAX等，而國內的氨肽酶產品目前尚屬空白。
酵母抽提物是新一代天然高級調味品，含有豐富的蛋白質、游離氨基酸、呈味核苷酸與雜環(huán)化合物，具有強烈的呈味性能，有肉香味，是集營養(yǎng)、調味和保健為一體的優(yōu)良食品調味料。因此酵母抽提物被譽為第三代味精，具有很高的營養(yǎng)價值。
本實驗室自行篩選出了一株產氨肽酶的枯草芽孢桿菌，菌種來源于傳統(tǒng)食品，無安全性風險，提取工藝成熟。這種酶具有與多種內切性蛋白酶復配應用的潛力。將氨肽酶與內切酶復配，應用于酵母抽提物中，可得到較高的水解度，小分子量的肽明顯增加，同時呈味氨基酸的量也有提高，顯著增加鮮味，進一步提高了酵母抽提物的營養(yǎng)價值，復配酶酶解酵母的效果與諾維信風味酶相當，可以代替諾維信風味酶應用在酵母抽提中，減少生產成本。
發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種枯草芽孢桿菌固體氨肽酶在酵母抽提物制備中的應用，制得的酵母抽提物中小分子量肽含量顯著提高，呈味氨基酸含量也有大幅提高，用作食品調味添加劑。
本發(fā)明的技術方案:
枯草芽孢桿菌Zj016的發(fā)酵液冷凍離心、澄清、超濾濃縮、脫鹽、冷凍干燥，得食品級固體氨肽酶(中國專利201010578579.1已公開，公開號CN102078012A，
公開日2011-6-1)。一種枯草芽孢桿菌固體氨肽酶在酵母抽提物制備中的應用，酵母自溶過程經優(yōu)化后，用氨肽酶和中性蛋白酶對酵母進行復配酶解，主要以游離氨基酸含量和谷氨酸含量為依據(jù)，形成酵母抽提物的最佳制備工藝。提取工藝為:
A酵母自溶過程中條件的優(yōu)化
通過單因素實驗考察了酵母自溶時間，自溶促進劑食鹽的添加量，調漿濃度對酵母自溶的影響，以氨基氮含量為依據(jù)，得出酵母自溶的最佳條件:酵母自溶時間為24 26h，自溶促進劑食鹽的添加量為體系濃度2%，調漿濃度為8.5%為佳。
B酶解條件的優(yōu)化
(I)復配酶的選擇:在相同條件下，酵母自溶26h后，分別加入固體氨肽酶(E/S=960U/g )和中性蛋白酶(E/S=36U/g )，固體氨肽酶(E/S=960U/g )和堿性蛋白酶(E/S=36U/g)的復配酶組合，酶解IOh后，95°C滅酶15min,冷卻后5000r/min、4°C離心IOmin,計算氨基氮含量、氨基氮得率以及固形物得率，最佳的復配酶組合是固體氨肽酶和中性蛋白酶的組合。
(2)酶解時間的優(yōu)化:酵母在相同條件下自溶26h后，加入固體氨肽酶和中性蛋白酶，每隔2h取樣測定氨基氮含量，最佳的酶解時間是10h。
(3)復配酶加酶量的優(yōu)化:酵母在相同條件下自溶26h后，加入不同酶量的復配酶，酶解IOh后，95°C滅酶15min，冷卻后5000r/min、4°C離心lOmin，測定上清液中游離氨基酸總量和谷氨酸含量，合適的加酶量為中性蛋白酶加入量為E/S=20-30U/g，固體氨肽酶加入量為E/S=700-800U/g，最佳的加酶量為中性蛋白酶(E/S=28U/g)和氨肽酶(E/S=774U/g)°
(4)諾維信風味蛋白酶加酶量的優(yōu)化:酵母在相同條件下自溶26h后，分別加入E/S=500U/g、E/S=1000U/g、E/S=5000U/g、E/S=10000U/g、E/S=15000U/g、E/S=20000U/g 的風味酶，酶解IOh后，95°C滅酶15min，冷卻后5000r/min、4°C離心lOmin，測定上清液中游離氨
基酸總量和谷氨酸含量，風味酶的最佳加酶量為E/S=1000U/g。
(5)自溶酶解同時進行和先后進行過程的選擇:氨肽酶和中性蛋白酶的復配酶在自溶初始加入，或自溶26h后加入，再酶解IOh后，95°C滅酶15min，冷卻后5000r/min、4°C離心lOmin，測定上清液中游離氨基酸總量和谷氨酸含量，通過比較，兩者的游離氨基酸含量和谷氨酸含量相當。所以選擇自溶酶解同時進行的過程。
(6)自溶酶解同時進行酶解時間的選擇:在4 30h的范圍內，每隔4h取樣，測定上清液中氨基氮的含量，最佳酶解時間為24h。
C在最佳的自溶酶解條件下，單獨自溶、復配酶以及諾維信風味蛋白酶的比較
(I)稱取8.5g活性干酵母粉溶于IOOmL蒸餾水，加入2g食鹽，分別加入E/S=1000U/g的風味酶，或氨肽酶(E/S=774U/g)和中性蛋白酶(E/S=28U/g)的復配酶，以及不加入蛋白酶。在55°C,自然pH條件下,放入搖床中，150rpm振蕩自溶24h。
(2)95°C滅酶15min，冷卻后5000r/min、4°C離心lOmin，測定上清液中游離氨基酸含量和主要呈味氨基酸的含量以及肽分子量分布。
加入諾維信風味酶后，酶解后的上清液中游離氨基酸的總含量為11.5494mg/mL,主要呈味氨基酸:谷氨酸的含量為1.8412 mg/mL，甘氨酸的含量為0.4896mg/mL，天冬氨酸的含量為0.4515mg/mL，丙氨酸的含量為1.3726mg/mL，上清液中分子量小于500Da的肽占總肽量的84.67%。
加入復配酶后，酶解后的上清液中游離氨基酸的總含量為11.7325mg/mL，主要呈味氨基酸:谷氨酸的含量為1.7204mg/mL，甘氨酸的含量為0.5254mg/mL，天冬氨酸的含量為0.5363mg/mL，丙氨酸的含量為1.4345mg/mL，上清液中分子量小于500Da的肽占總肽量的 81.56%ο
單獨自溶后(不加酶)，酶解后的上清液中游離氨基酸的總含量為5.1831mg/mL,主要呈味氨基酸:谷氨酸的含量為0.8513mg/mL，甘氨酸的含量為0.2444mg/mL，天冬氨酸的含量為0.3181mg/mL，丙氨酸的含量為1.0830mg/mL。
固體氨肽酶的酶活
LNA法測定。測定時，首先配Tris-HCl緩沖液，取6.075gTris溶于900mL蒸餾水，用濃HCl調至pH8.5，然后定容至1L。以L-亮氨酸對硝基苯胺L-leu-pNA作為底物，取0.1g底物溶于ImL酒精，然后用Tris-HCl緩沖液定容到100mL。取0.1g固體氨肽酶粉用Tris-HCl緩沖液定容到IOOmL作為待測酶液。加入2mL的Tris-HCl緩沖液和ImL底物(L-亮氨酸對硝基苯胺L-leu-pNA)，一個加入ImL酶液，另一個加入ImL Tris-HCl緩沖液作為對照，在50°C水浴反應IOmin后，405nm比色測定酶活。
酶活公式:酶活=ΑΧ105.7X4Xn/10
其中:A為待測酶液的吸光度；n為待測酶液的稀釋倍數(shù)。
酶活力定義:50°C，每分鐘分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產生I微摩爾的對硝基苯胺所需酶量即為一個酶活單位。
甲醛滴定法測定氨基氮含量。
上清液固形物含量的測定:離心后取一定重量的自溶上清液烘干至恒重，測其固形物含量。
氨基氮得率=(自溶后上清液氨基氮含量/自溶前酵母干重)X 100%
固形物得率=[(自溶后上清液總重X上清液固形物含量一外加物質干重)/自溶前酵母干重]χιοο%，式中:外加物質指所加入的破壁酶、蛋白酶、自溶促進劑等。
酶解酵母后酶解液中游離氨基酸的測定。氨基酸分析液相色譜儀(AgllOO)復配酶酶解后上清液中游離氨基酸的總含量從5.1831mg/mL提高到11.7325mg/mL,主要呈味氨基酸丙氨酸的含量從1.0830mg/mL提高到1.4345mg/mL,甘氨酸的含量從0.2444mg/mL提高到0.5254mg/mL,天冬氨酸的含量從0.3181mg/mL提高到0.5363mg/mL,谷氨酸的含量從
0.8513mg/mL 提高到 1.7204mg/mL,結果如圖1。
酶解酵母酶解液中肽分子量分布的測定。Waters 600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器和Empower工作站)。自制復配酶酶解后酶解液中分子量小于500Da的肽占總肽量的81.56%，如圖4。諾維信風味蛋白酶酶解液中分子量小于500Da的肽占總肽量的84.67%，如圖5。
本發(fā)明的有益效果:實驗所用的枯草芽孢桿菌固體氨肽酶是本課題組自行研制的，通過固體氨肽酶和中性蛋白酶復配酶解酵母后，酶解所得上清液中游離氨基酸的含量顯著增加，呈味氨基酸的量也有大幅提高，鮮味增加，同時酶解后小分子量的肽含量增加，進一步提高了酵母抽提物的營養(yǎng)價值，經優(yōu)化后，形成酵母抽提物的最佳制備工藝，比較后發(fā)現(xiàn)，中性蛋白酶和氨肽酶復配后的酶解效果與諾維信風味蛋白酶的酶解效果相當，具備在高端酵母抽提物制備工藝中應用的潛力。


圖1添加復配酶的酵母酶解抽提液中游離氨基酸圖譜；
圖2添加諾維信風味蛋白酶的酵母酶解抽提液中游離氨基酸圖譜；
圖3酵母未加酶自溶后酶解抽提液中游離氨基酸圖譜；[0039]圖4添加復配酶的酵母酶解抽提液中肽分子量分布圖譜；
圖5添加諾維信風味蛋白酶的酵母酶解抽提液中肽分子量分布圖譜；
圖6酵母抽提物制備中蛋白酶復配加入工藝段示意圖。
具體實施方式
實施例1
將枯草芽孢桿菌Zj016發(fā)酵液在4°C，6000rpm離心IOmin收集2.5L發(fā)酵液，在4°C下加入(NH4)2SO4 500 g (邊加邊攪拌)，4°C，6000rpm離心lOmin，收集澄清液2.5L，選用50kDa的超濾膜進行濃縮到0.85L，流速30mL/min ;選用30kDa的超濾膜脫鹽后0.85L，流速40 mL/min，將濃縮脫鹽液冷凍干燥后得到固體氨肽酶。得到的固體氨肽酶的酶活為7X105U/g。稱取8.5g活性干酵母粉溶于IOOmL蒸餾水，加入2g食鹽，用中性蛋白酶和固體氨肽酶復配進行酶解，其中 中性蛋白酶加入量為E/S=28U/g，固體氨肽酶加入量為E/S=774U/g，在55°C，自然pH條件下，放入搖床中，150rpm振蕩自溶24h。95°C滅酶15min，冷卻后5000r/min、4°C離心lOmin，此時沉淀為酵母菌體，上清液為多肽混合物。酶解后上清液中分子量小于500Da的肽占總肽量的81.56%，并且游離氨基酸的總含量從5.1831mg/mL提高到11.7325mg/mL,主要呈味氨基酸:丙氨酸的含量從1.0830mg/mL提高到1.4345mg/mL,甘氨酸的含量從0.2444mg/mL提高到0.5254mg/mL,天冬氨酸的含量從0.3181mg/mL提高到0.5363mg/mL,谷氨酸的含量從0.8513mg/mL提高到1.7204mg/mL。
實施例2
將枯草芽孢桿菌Zj016發(fā)酵液在4°C，6000rpm離心IOmin收集2.5L發(fā)酵液，在4°C下加入(NH4)2SO4 500 g (邊加邊攪拌)，4°C，6000rpm離心lOmin，收集澄清液2.5L，選用50kDa的超濾膜進行濃縮到0.85L，流速35mL/min ;選用30kDa的超濾膜脫鹽后0.85L，流速40 mL/min，將濃縮脫鹽液冷凍干燥后中得到固體氨肽酶。得到的固態(tài)氨肽酶的酶活為7X105U/g。稱取8.5g活性干酵母粉溶于IOOmL蒸餾水，加入2g食鹽，用中性蛋白酶和固體氨肽酶復配進行酶解，其中中性蛋白酶加入量為E/S=20U/g，固體氨肽酶加入量為E/S=800U/g，在55°C，自然pH值條件下，放入搖床中，150rpm振蕩自溶24h。95°C滅酶15min，冷卻后5000r/min，4°C離心lOmin，游離氨基酸的總含量達到11.0738mg/mL，主要呈味氨基酸:丙氨酸的含量達到1.4015mg/mL，甘氨酸的含量達到0.5184mg/mL，天冬氨酸的含量達到0.5000mg/mL，谷氨酸的含量達到1.7018mg/mL。
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌固體氨肽酶在酵母抽提物制備中的應用，其特征在于: (O稱取8.5g活性干酵母粉溶于IOOmL蒸餾水，加入2g食鹽，用中性蛋白酶和固體氨肽酶復配進行酶解，其中中性蛋白酶加入量為E/S=20-30U/g，固體氨肽酶加入量為E/S=700-800U/g，在55°C，自然pH條件下，放入搖床中150rpm振蕩自溶24 26h ; (2)95°C滅酶15min，冷卻后4°C、5000r/min離心lOmin，此時沉淀為酵母菌體，上清液為多肽混合物，即酵母抽提物產品 ；酶解后上清液中分子量小于500Da的肽占總肽量的80%以上，并且游離氨基酸的總含量提高到llmg/mL以上，主要呈味氨基酸丙氨酸的含量提高到1.4mg/mL以上,甘氨酸的含量提高到0.5mg/mL以上,天冬氨酸的含量提高到0.5mg/mL以上，谷氨酸的含量提高到1.7mg/mL以上。
專利摘要
一種枯草芽孢桿菌氨肽酶在酵母抽提物制備中的應用，屬于酶制劑、食品添加劑技術領域：
。本發(fā)明選擇自溶酶解同時進行的工藝，在一定階段一定條件下將枯草芽孢桿菌Zj016固體氨肽酶與商品中性蛋白酶復配后按一定比例加入酵母待抽提物中，振蕩酶解24小時后，酵母抽提物中分子量小于500Da的肽占總肽量的80%以上，酵母抽提物中游離氨基酸的總含量提高到11mg/mL以上，主要呈味氨基酸含量均有提高，進一步提高了酵母抽提物的營養(yǎng)價值，增加了酵母抽提物的鮮味，能達到與風味酶相當?shù)男Ч?，具有代替諾維信風味酶應用在酵母抽提物中的潛力。
文檔編號A23L1/227GKCN102488176 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201110362653
公開日2013年8月21日 申請日期2011年11月16日
發(fā)明者田亞平, 張靜 申請人:江南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),