專利名稱:以聚肌苷酸－聚胞苷酸為主的佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要關(guān)于佐劑組合物以及使用這些佐劑組合物來(lái)促進(jìn)免疫反應(yīng)的方法，它特定關(guān)于用以促進(jìn)抗原的免疫原性(immunogenicity)的組合物、疫苗和方法。它更特定關(guān)于聚核苷酸佐劑組合物、含有該聚核苷酸佐劑組合物的疫苗，以及利用所述聚核苷酸佐劑組合物和疫苗來(lái)促進(jìn)宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)的方法。
發(fā)明背景1.相關(guān)技術(shù)的敘述免疫系統(tǒng)具有產(chǎn)生特異性和非特異性免疫力。一般而言，B和T淋巴細(xì)胞在他們的細(xì)胞表面上有針對(duì)特定抗原的特定受體，能產(chǎn)生特異性免疫。該免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)各抗原以二種方式特異免疫反應(yīng)1)體液免疫反應(yīng)，涉及刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體或免疫球蛋白、抗原提呈細(xì)胞(APCs)功能及輔助性T細(xì)胞(Th1和Th2)功能，以及2)細(xì)胞免疫反應(yīng)，一般涉及T細(xì)胞、包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)和其它涉及CTL反應(yīng)的產(chǎn)生例如，Th1和/或Th2細(xì)胞以及APCs。
非特異性免疫包含多種細(xì)胞作用機(jī)制，例如巨噬細(xì)胞(macrophages)或顆粒細(xì)胞(granulocytes)的吞噬作用(phagocytosis)以吞噬外來(lái)顆粒或抗原，以及天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)活性等。非特異性免疫力依賴是原來(lái)的免疫機(jī)制，且不會(huì)展現(xiàn)出特異性和記憶性的獲得性特性，該獲得性特性是特異性免疫反應(yīng)的典型特點(diǎn)。特異性和非特異性免疫之間的關(guān)鍵性差異是前者由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)識(shí)別特異性抗原基序，具有記憶功能；而后者沒(méi)有此功能。因此接種疫苗(涉及免疫特異性和記憶性)是一種保護(hù)機(jī)體以對(duì)抗有害病原體的有效機(jī)制。
佐劑是增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫反應(yīng)或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)，當(dāng)它和抗原共同給予時(shí)(與該抗原相混合，或在給予該抗原以前或后給予)會(huì)促進(jìn)或改變對(duì)于該特定抗原的免疫反應(yīng)及免疫反應(yīng)的類型。
常見(jiàn)促進(jìn)免疫反應(yīng)的典型佐劑包括鋁化合物(該佐劑常被通稱為鋁佐劑″Alum″)、水包油乳劑(完全弗氏佐劑CFA是一種水包油乳劑，含有經(jīng)干燥和熱殺滅的結(jié)核桿菌)、皂甙(從皂質(zhì)樹(shù)QuillajaSaponoria皮分離而來(lái)，該佐劑活性成份被稱為Quile A)、CpG ODN(合成寡去氧核苷酸，含有去甲基化的CpG二聚核苷酸)、MPL(從明尼蘇達(dá)Re595沙氏桿菌(Salmonella minnesota Re595)的脂多醣衍生而來(lái))、脂質(zhì)體(通常由如磷脂等可生物降解性材料制成)以及可生物降解性聚合微球體(由如PLGA、聚膦腈(polyphosphazene)和聚酐等多種聚合物制成)。這些物質(zhì)的佐劑性質(zhì)已經(jīng)過(guò)評(píng)估各有優(yōu)缺點(diǎn)。
將佐劑應(yīng)用在人用疫苗，特別是兒童用常規(guī)疫苗的最大挑戰(zhàn)在于大多數(shù)佐劑配方產(chǎn)生毒性和不良反應(yīng)或者佐劑效果不顯著。在疫苗研發(fā)所運(yùn)用的新技術(shù)正朝向純化、亞單位或合成抗原發(fā)展，這些抗原本身具有較弱的免疫原性。開(kāi)發(fā)新佐劑以改善免疫原性/有效性并減低不良副作用是疫苗研發(fā)面對(duì)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)。
聚核苷酸復(fù)合物已在試驗(yàn)用作佐劑等多種用途上。雙鏈RNAs(dsRNAs)是非常有效的生物修飾因子，可在毫微摩爾濃度下對(duì)細(xì)胞引起明顯作用。dsRNA的調(diào)控效應(yīng)包括在分子和細(xì)胞水平上廣泛的作用。
在分子水平上，dsRNAs可誘導(dǎo)如干擾素(interferon)的合成、蛋白質(zhì)激酶的產(chǎn)生、增進(jìn)組織兼容性抗原以及抑制代謝作用等生物效應(yīng)。在細(xì)胞水平上，dsRNA可激發(fā)如熱原性(pyrogenicity)、細(xì)胞分裂(mitogenicity)、巨噬細(xì)胞活化、活化細(xì)胞免疫以及引發(fā)抗病毒等生物效應(yīng)。dsRNAs的巨大前景在于抗微生物治療上的免疫調(diào)控效應(yīng)。美國(guó)專利第4,124,702號(hào)提出dsRNAs在活的動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生。美國(guó)專利第3,906,092號(hào)提出含有聚核苷酸或聚核苷酸復(fù)合物的佐劑型疫苗抗體產(chǎn)生增強(qiáng)。Houston等人建立PICLC(聚肌苷酸聚胞苷酸poly-L-賴氨酸-羧甲基纖維素復(fù)合物)作一種有效的佐劑，藉此增加初級(jí)抗體反應(yīng)而無(wú)需其它佐劑的輔助(參見(jiàn)Houston et al.，Infection andImmunity，14318-9，1976C)。霉病毒型dsRNA(Mycoviral dsRNA)被發(fā)現(xiàn)能顯著地增進(jìn)凝血抗體對(duì)于綿羊紅血球細(xì)胞的反應(yīng)(參見(jiàn)Wrightand Adler-Moore，Biochemical and Biophysical Research Communications，131949-45，1985)。
PIC(聚肌苷酸-聚胞苷酸)用于動(dòng)物時(shí)，在一定劑量下會(huì)引起嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，例如，Phillips等人報(bào)導(dǎo)在2.0mg/kg劑量下亞慢性給予狗PIC會(huì)引起嚴(yán)重的毒性作用。毒性的表現(xiàn)為自發(fā)性活動(dòng)減低、協(xié)調(diào)不良、厭食、嘔吐、體重下降，血液變化反映在降低造血功能、堿性磷酸酶和轉(zhuǎn)胺酶活性升高、胸腺退化、骨髓破壞、肝臟的小葉中心區(qū)竇狀毛細(xì)血管擴(kuò)張、肝細(xì)胞壞死、肝結(jié)構(gòu)崩解以及全身性關(guān)節(jié)炎(參見(jiàn)Phillips et al.，Toxicology and Applied Pharmacology，18220-30，1971)。
作為被研究最多的聚核苷酸復(fù)合物中的一種，PIC在用于猴和人體時(shí)并不有效，這是因?yàn)镻IC在進(jìn)入靈長(zhǎng)類(包括人)體內(nèi)后，會(huì)很快被靈長(zhǎng)類以上動(dòng)物體內(nèi)的核酸酶降解。因此許多方式用來(lái)改進(jìn)PIC的不足，例如，由PIC與poly-L-lysine hydrobromide復(fù)合物對(duì)于胰核糖核酸酶水解的抵抗性較原PIC高約5至15倍，又例如PIC與polyL-lysincarboxymethylcellulose復(fù)合物(簡(jiǎn)稱PICLC)被發(fā)現(xiàn)是非常有效的抗病毒或抗腫瘤劑。PICLC是一種包含有聚核苷酸和聚核糖胞苷酸的合成dsRNA。雖然PICLC是一種有前景的免疫調(diào)控劑，在抗微生物與抗癌治療有很好潛能，但在人體試驗(yàn)中產(chǎn)生嚴(yán)重不良副作用，特別是反復(fù)高劑量用藥時(shí)。有報(bào)導(dǎo)的不良副作用包括發(fā)熱、低血壓、白血球減少(leucopenia)、肢體倦痛(myalgia)、血小板減少(thrombocytopenia)以及多關(guān)節(jié)痛(polyarthralgia)。因此該產(chǎn)品不能用于人體，該產(chǎn)品的毒性和穩(wěn)定性問(wèn)題必須被克服。以使得PICLC能使安全用于用人體。此外PICLC的治療有效性受限于其在活體內(nèi)的穩(wěn)定性。
一種包含有聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)、卡那霉素(kanamycin)和鈣離子(該復(fù)合物簡(jiǎn)稱Av-PICKCa)的抗病毒藥物被用于治療病毒感染。已證實(shí)Av-PICKCa在機(jī)體誘導(dǎo)發(fā)干擾素與白介素-2的產(chǎn)生。單獨(dú)給予Av-PICKCa作為抗病毒藥物會(huì)刺激非特異性免疫反應(yīng)，例如Av-PICKCa直接刺激下非針對(duì)特定抗原干擾素的產(chǎn)生。此種抗病毒反應(yīng)非常不同于當(dāng)佐劑與抗原共同給予時(shí)所產(chǎn)生的抗原特異性免疫反應(yīng)。
更重要的是本案發(fā)明人發(fā)現(xiàn)到Av-PICKCa具有佐劑的性質(zhì)，也就是當(dāng)與抗原共同給予時(shí)增強(qiáng)特異性免疫反應(yīng)的能力。本案發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)與狂犬病及出血熱病毒抗原共同免疫時(shí)，Av-PICKCa是一種有效的佐劑。
Lin等人敘述，Av-PICKCa可用作一種佐劑(參見(jiàn)Lin，et al.，A newimmunostimulatory complex(PICKCa)in experimental rabiesantiviraland adjuvant effects，Arch Virol，131307-19，1993；中國(guó)專利93105862.7號(hào))。中國(guó)專利第93105862.7號(hào)提供由PIC、卡那霉素和鈣離子所構(gòu)成的復(fù)合物(簡(jiǎn)稱PICKCa)在人和哺乳動(dòng)物作為疫苗佐劑用途。
Av-PICKCa樣品在分子大小和重量上是異質(zhì)的。在文獻(xiàn)中，Av-PICKCa是以沉降系數(shù)單位(Svedbergs)S所表示的沉降系數(shù)值的平均值或范圍來(lái)敘述。在一個(gè)實(shí)施例中，抗病毒藥劑Av-PICKCa存在于5S至8S之間劑(來(lái)源A)，請(qǐng)參見(jiàn)Zhung J.C.，Research recollectionof polyinosinic-polycytidylic acid(PIC).The paper of fifth Chineseinterferon conference in clinical application and theory，Xian 1985，pp23-28。在其它的實(shí)施例中，Av-PICKCa的沉降系數(shù)是4S至12S，具有一平均值為6S劑(來(lái)源B)，或者沉降系數(shù)是5S至12S，具有一平均值為7S劑(來(lái)源C)，或者沉降系數(shù)是8S至10S劑(來(lái)源D)，請(qǐng)參見(jiàn)Hu Q.G，Tianjin Av-PICKCa’s laboratory research and clinicalapplication，F(xiàn)ujian Medical Journal，1983.12；(6)28-30以及Hu Q.GChinese Medical and Pharmaceutical Industry Journal，1983(9)3134。
利用換算公式mw＝1,100xS2.2(參見(jiàn)Su B.X.et al；Introduction ofBiochemical Technology，1st Edition，Zhongshan University，1978，356-357)，Av-PICKCa中的異質(zhì)分子的沈降系數(shù)可換算成對(duì)等的分子量(mw，以道爾頓Daltons表示)。下表顯示換算成道爾頓的結(jié)果表AAv-PICKCa的特性
*參考文獻(xiàn)中沒(méi)有提出的數(shù)據(jù)Lin等人將一個(gè)樣品用于以Av-PICKCa作為佐劑的原始研究中，該樣品的分子具有和來(lái)源A相類似的特性，也就是它的沉降系數(shù)是5S至8S，該沉降系數(shù)對(duì)等于位在38,000道爾頓至107,000道爾頓范圍內(nèi)的分子的分子量。(參見(jiàn)Lin et al.，同前)。
一般相信，所有形式的PICKCa均是對(duì)等地安全且有效，因?yàn)锳v-PICKCa基本上是PICKCa的一種形式，且Av-PICKCa在過(guò)去已被用作為抗病毒藥劑。但事實(shí)卻不是如此。本案發(fā)明人所進(jìn)行的研究顯示，當(dāng)PICKCa和抗原組合而被用作為一佐劑時(shí)，PICKCa的有效性和毒性事實(shí)上會(huì)隨著分子量的不同而有變化。本案發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Av-PICKCa作為佐劑時(shí)不能提供最佳的有效性/安全性狀態(tài)，且PICKCa在某些情況下確實(shí)會(huì)引起令人無(wú)法接受的不良副作用。因此，業(yè)界仍然需要一種更適于人類使用并且能提供所需免疫反應(yīng)的安全且有效佐劑。本發(fā)明能滿足這個(gè)需求并提供其它優(yōu)點(diǎn)，參照后述詳細(xì)說(shuō)明即可明暸。
2.文獻(xiàn)相關(guān)參考資料列示于下JP 1093540A2；美國(guó)專利第4,124,702號(hào)美國(guó)專利第3,692,899號(hào)美國(guó)專利第3,906,092號(hào)美國(guó)專利第4,389,395號(hào)美國(guó)專利第4,349,538號(hào)美國(guó)專利第4,024,241號(hào)美國(guó)專利第3,952,097號(hào)Houston et al.，Infection and Immunity，14318-9，1976CWright and Adler-Moore，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，131949-45，1985Phillips et al.，Toxicology and Applied Pharmacology，18220-30，1971Lin，et al.，A new immunostimulatory complex(PICKCa)inexperimental rabiesantiviral and adjuvant effects，Arch Virol，131307-19，1993中國(guó)專利第93105862.7號(hào)Zhung J.C.，Research recollection of polyinosinic-polycytidylic acid(PIC).The paper of fifth Chinese interferon conference in clinicalapplication and theory，Siam 1985，pp23-28Hu Q.G，Tianjin Av-PICKCa’s laboratory research and clinicalapplication，F(xiàn)ujian Medical Joumal，1983.12；(6)28-30Hu Q.G Chinese Medical and Pharmaceutical Industry Journal，1983(9)3134.
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種聚核苷酸佐劑組合物以及用以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法。本發(fā)明亦提供一種免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物和抗原(例如此二種成份位于一疫苗內(nèi))。本發(fā)明的佐劑組合物具有特定的物理性質(zhì)(例如分子量、濃度和pH)，這些性質(zhì)能符合于提供一種誘導(dǎo)增強(qiáng)免疫反應(yīng)和改變免疫反應(yīng)類型的有效且安全的佐劑。本發(fā)明更提供這些佐劑組合物的使用方法，特別是誘發(fā)對(duì)于抗原物的免疫反應(yīng)。
在實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid)(PIC)、一抗生素以及一陽(yáng)離子，其中該抗生素可為卡那霉素，且該陽(yáng)離子可為一個(gè)二價(jià)離子，例如鈣。本發(fā)明亦提供一種免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物以及抗原或疫苗。
本發(fā)明藉由界定一種可安全且有效地用作為一佐劑的新穎組合物，以增進(jìn)及/或改變一動(dòng)物或人類宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)知識(shí)的提升。雖然先前技術(shù)顯示抗病毒藥劑Av-PICKCa可用以作為一種佐劑，但是此種形式的PICKCa和抗原共同給予時(shí)，被觀察到僅能引起有限的特異性免疫反應(yīng)。此外，PICKCa被發(fā)現(xiàn)在某些情況下會(huì)引起令人無(wú)法接受的不良副作用。
本發(fā)明藉由提供一種佐劑組合物來(lái)因應(yīng)這些問(wèn)題，該組合物在此簡(jiǎn)稱為“PIKA”，其可作為一佐劑而最有效且安全地給予動(dòng)物，包括人類。
PIKA是一種組合物，包含一聚核苷酸、一抗生素以及一陽(yáng)離子，該組合物已被特定地研發(fā)成為一種佐劑。本發(fā)明包括數(shù)種組合物，這些組合物具有特殊的產(chǎn)物特性，使這些組合物特別適合使用作為在免疫原組成物內(nèi)的佐劑，以給予動(dòng)物及/或人類。
具體上說(shuō)，本發(fā)明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含一聚核苷酸、一抗生素以及一陽(yáng)離子，其中該聚核苷酸可為聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)；該抗生素是卡那霉素、蒽環(huán)霉素(Anthracycline)、硫酸丁酰苷菌素(butirosin sulfate)、慶大霉素(gentamicin)、潮霉素(hygromycin)、丁胺卡那霉素(amikacin)、雙去氧卡那霉素(dibekacin)、暗霉素(nebramycin)、美它酰胺(metrzamide)、新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、鏈霉素或鏈脲霉素(streptozocin)；以及該離子是鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅。
詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明提供包含有一聚核苷酸、一抗生素以及一陽(yáng)離子的組合物的規(guī)格，包括分子量、濃度和pH，該組合物能滿足對(duì)于引起最大所需免疫反應(yīng)并安全佐劑的需要。
本發(fā)明亦提供一種免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物以及抗原或疫苗。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明呈現(xiàn)一種組合套裝(KIT)的形式，包含該聚核苷酸佐劑以及一免疫原性物質(zhì)。
此外，本發(fā)明提供方法，藉由將該免疫原組成物給予一宿主，以促進(jìn)對(duì)于抗原物質(zhì)的免疫反應(yīng)。該宿主可為人類或動(dòng)物。該給予過(guò)程可經(jīng)由如肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下注射等注射或是藉由經(jīng)呼吸道吸入來(lái)完成。在其它實(shí)施例中，該免疫原組成物可經(jīng)由直腸、陰道、鼻、口、眼、局部、透皮或皮內(nèi)來(lái)傳輸。
據(jù)此，本發(fā)明提供可安全地使用于人體或動(dòng)物體的一種佐劑以及一種免疫原組成物。
據(jù)此，在一方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種聚核苷酸佐劑組合物，包含一聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一抗生素以及一陽(yáng)離子，其中該組合物含有在分子量上為異質(zhì)的佐劑分子，該分子的分子量為約66,000至1,200,000道爾頓。
在相關(guān)實(shí)施例中，該組合物中的聚核苷酸佐劑組合物分子在分子量上是異質(zhì)的，其中該分子量為約300,000至1,200,000道爾頓，或是約66,000至660,000道爾頓，或是約300,000至660,000道爾頓，或是約300,000至2,000,000道爾頓，或是約300,000至to 4,000,000道爾頓，或是約500,000至1,000,000道爾頓，或是約1,000,000至1,500,000道爾頓，或是約1,500,000至2,000,000道爾頓，或是約2,000,000至2,500,000道爾頓，或是約2,500,000至3,000,000道爾頓，或是約3,000,000至3,500,000道爾頓，或是約3,500,000至4,000,000道爾頓，或是約4,000,000至4,500,000道爾頓，或是約4,500,000至5,000,000道爾頓。
在相關(guān)實(shí)施例中，該組合物中的聚核苷酸佐劑組合物分子具有一平均分子量，該平均分子量等于或高于150,000道爾頓，或是等于或高于250,000道爾頓，或是等于或高于350,000道爾頓，或是等于或高于500,000道爾頓，或是等于或高于650,000道爾頓，或是等于或高于750,000道爾頓，或是等于或高于1,000,000道爾頓，或是等于或高于1,200,000道爾頓，或是等于或高于1,500,000道爾頓，或是等于或高于2,000,000道爾頓。
據(jù)此，在一態(tài)樣中，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種聚核苷酸佐劑組合物，包含一聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一抗生素以及一陽(yáng)離子，其中該組合物含有在分子大小上呈異質(zhì)的佐劑分子，這些佐劑分子的沈降系數(shù)單位(Svedbergs)為約6.43S至24.03S。
在相關(guān)實(shí)施例中，該組合物中的聚核苷酸佐劑組合物分子在分子大小上是異質(zhì)的，其中該分子大小為約12.8S至24.03S，或是約6.43至18.31S，或是約12.8至18.31S，或是約12.8S至30.31S，或是約12.8S至41.54S，或是約13.5S至18.31S，或是約13.5S至24.03S，或是約16.14至22.12S，或是約22.12S至26.6S，或是約26.6S至30.31S，或是約30.31S至33.55S，或是約33.55S至36.45S，或是約36.45S至39.1S，或是約39.1S至41.54S，或是約41.54S至43.83S，或是約43.83S至45.95S。
在其它相關(guān)實(shí)施例中，該聚核苷酸佐劑組合物具有一平均沉降系數(shù)單位(Svedbergs)，該平均沈降系數(shù)高于9，或是高于12，或是高于13.5，或是高于15，或是高于16，或是高于17，或是高于18，或是高于19，或是高于20，或是高于21，或是高于22，或是高于25，或是高于30。
在一相關(guān)實(shí)施例中，該組合物中的抗生素是卡那霉素、新霉素、蒽環(huán)霉素、硫酸丁酰苷菌素、慶大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、雙去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺、嘌呤霉素、鏈霉素或鏈脲霉素。
在另一相關(guān)實(shí)施例中，該佐劑組合物更包含一種鈣離子。
在另一相關(guān)實(shí)施例中，該組合物中的陽(yáng)離子是鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅。該陽(yáng)離子可呈無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)復(fù)合物的形式。
鈣離子來(lái)源可為例如氯化鈣、碳酸鈣、氟化鈣、氫氧化鈣、磷酸鈣或硫酸鈣。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和鈣，其中該組合物包括在分子量上呈異質(zhì)的佐劑分子，這些佐劑分子的分子量為約66,000至1,200,000道爾頓。
在相關(guān)實(shí)施例中，該聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和鈣分子的分子量為約300,000至1,200,000道爾頓，或是約66,000至660,000道爾頓，或是約300,000至660,000道爾頓，或是約300,000至2,000,000道爾頓，或是約300,000至4,000,000道爾頓，或是約500,000至1,000,000道爾頓，或是約1,000,000至1,500,000道爾頓，或是約1,500,000至2,000,000道爾頓，或是約2,000,000至2,500,000道爾頓，或是約2,500,000至3,000,000道爾頓，或是約3,000,000至3,500,000道爾頓，或是約3,500,000至4,000,000道爾頓，或是約4,000,000至4,500,000道爾頓，或是約4,500,000至5,000,000道爾頓。
在其它相關(guān)實(shí)施例中，該佐劑的聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和鈣分子組合物在分子量上呈異質(zhì)，這些分子具有一平均分子量，該平均分子量等于或高于150,000道爾頓，等于或高于250,000道爾頓，或是等于或高于350,000道爾頓，或是等于或高于500,000道爾頓，或是等于或高于650,000道爾頓，或是等于或高于750,000道爾頓，或是等于或高于1,000,000道爾頓，或是等于或高于1,200,000道爾頓，或是等于或高于1,500,000道爾頓，或是等于或高于1,500,000道爾頓。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和鈣，其中該組合物包括在分子大小上呈異質(zhì)的佐劑分子，這些佐劑分子的沈降系數(shù)單位(Svedbergs)為約6.43S至24.03S。
在相關(guān)實(shí)施例中，該組合物中的聚核苷酸佐劑組合物分子在分子大小上是異質(zhì)的，其中該分子大小為約12.8S至24.03S，或是約6.43至18.31S，或是約12.8至18.31S，或是約12.8S至30.31S，或是約12.8S至41.54S，或是約13.5S至18.31S，或是約13.5S至24.03S，或是約16.14至22.12S，或是約22.12S至26.6S，或是約26.6S至30.31S，或是約30.31S至33.55S，或是約33.55S至36.45S，或是約36.45S至39.1S，或是約39.1S至41.54S，或是約41.54S至43.83S，或是約43.83S至45.95S。
在其它相關(guān)實(shí)施例中，該聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和鈣組合物具有一平均沉降系數(shù)，該平均沈降系數(shù)高于9，或是高于12，或是高于13.5，或是高于15，或是高于16，或是高于17，或是高于18，或是高于19，或是高于20，或是高于21，或是高于22，或是高于25，或是高于30。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和鈣，其中該組合物較佳為排除某些組合物分子，特別是在這些被排除的分子不具有顯著的免疫原效應(yīng)的程度上，其中被排除的組合物分子的分子量為大約或低于30,000道爾頓，大約或低于40,000道爾頓，大約或低于50,000道爾頓，大約或低于60,000道爾頓，大約或低于70,000道爾頓，大約或低于80,000道爾頓，大約或低于90,000道爾頓，大約或低于100,000道爾頓，大約或低于150,000道爾頓，大約或低于200,000道爾頓，大約或低于250,000道爾頓，大約或低于300,000道爾頓，大約或低于350,000道爾頓，大約或低于400,000道爾頓，大約或低于450,000道爾頓，大約或低于500,000道爾頓，大約或低于600,000道爾頓，大約或低于700,000道爾頓，大約或低于800,000道爾頓，大約或低于900,000道爾頓，大約或低于1,000,000道爾頓。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和鈣，其中最好為排除該組合物某些分子，特別是在這些被排除的分子不具有顯著程度的免疫原效應(yīng)的，其中被排除的分子的分子大小為大約或低于4.49S，大約或低于5.12S，大約或低于5.67S，大約或低于6.16S，大約或低于6.6S，大約或低于7.02S，大約或低于7.4S，大約或低于7.77S，大約或低于9.34S，大約或低于10.64S，大約或低于11.78S，大約或低于12.8S，大約或低于13.73S，大約或低于14.59S，大約或低于15.39S，大約或低于16.14S，大約或低于17.54S，大約或低于18.81S，大約或低于19.99S，大約或低于21.09S，大約或低于22.12S。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)抗原物的抗原性的免疫原組合物，包含該聚核苷酸佐劑的組合物。
在相關(guān)實(shí)施例中，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑以及抗原。
在相關(guān)實(shí)施例中，抗原來(lái)源是一種人類抗原、一種非人類動(dòng)物抗原、一種植物抗原、一種細(xì)菌抗原、一種真菌抗原、一種病毒抗原、一種寄生蟲(chóng)抗原或是一種癌腫抗原。
在相關(guān)實(shí)施例中，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物以及一狂犬病抗原。
在某些實(shí)施例中，抗原可從一天然來(lái)源純化出，藉由固相合成法來(lái)合成出或是可藉由重組遺傳技術(shù)而獲得?？乖砂粋€(gè)蛋白質(zhì)片段，該蛋白質(zhì)片段含有該分子的一或多個(gè)免疫原區(qū)。抗原亦可藉由活的、減毒的、或截短的或被殺死的完整細(xì)胞或微生物(例如完整病毒顆粒)來(lái)提供。
在其它的實(shí)施例中，抗原包括一或多種成分，源自于感染物、植物抗原、癌腫、過(guò)敏性成分以及例如會(huì)導(dǎo)致自體免疫疾病的其它人類抗原。在其它的實(shí)施例中，抗原包括一或多種感染物，源自于病毒、細(xì)菌、分枝桿菌(Mycobacterium)、真菌及寄生蟲(chóng)中的任一種。
本發(fā)明的聚核苷酸佐劑組合物亦可用于促進(jìn)免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是針對(duì)運(yùn)用DNA疫苗所產(chǎn)生的抗原。這些疫苗中用以編碼抗原的DNA序列可以是″裸露的″，或是被容納在一個(gè)如脂小體的載體系統(tǒng)內(nèi)。
在其它的相關(guān)實(shí)施例中，狂犬病抗原是選自于人類雙倍體細(xì)胞疫苗(HDCV)，或是倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病疫苗(HKC-IPRV)，或是倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活粗制型狂犬病疫苗(HKC-ICRV)，或是純化型Vero細(xì)胞狂犬病疫苗(PVRV)，或是純化型雞胚細(xì)胞(PCEC)，或是純化型鴨胚疫苗(PDEV)，或是倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA) 或是倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活粗制狂犬病抗原(HKC-ICRA)。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)抗原物的抗原性的免疫原組成物，包含能誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的聚核苷酸佐劑組合物。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)抗原物的抗原性的免疫原組成物，包含能誘導(dǎo)抗原特異性B細(xì)胞免疫反應(yīng)的聚核苷酸佐劑組合物。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)抗原物的抗原性的免疫原組成物，包含能同時(shí)誘導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞對(duì)抗原特異性免疫反應(yīng)的聚核苷酸佐劑組合物。
在一個(gè)特別相關(guān)方面方面，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)一物質(zhì)的抗原性的免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物以及一倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原，其中該狂犬病抗原的存在應(yīng)達(dá)到一最低量，例如超過(guò)1個(gè)國(guó)際單位(IU)。
在相關(guān)實(shí)施例中，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物以及倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原，其中該狂犬病抗原的存在應(yīng)達(dá)到一最低量，例如超過(guò)0.25個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)0.5個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)1.2個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)1.4個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)1.6個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)1.8個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)2.0個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)2.2個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)2.4個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)2.6個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)2.8個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)3.0個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)3.2個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)3.4個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)3.6個(gè)國(guó)際單位，超過(guò)3.8個(gè)國(guó)際單位，或是超過(guò)4.0個(gè)國(guó)際單位。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)一物質(zhì)的抗原性的免疫原組成物，它包含該聚核苷酸佐劑組合物以及倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原，其中該佐劑和狂犬病抗原呈現(xiàn)約1比1的比例。
在相關(guān)實(shí)施例中，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物以及倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原，其中該佐劑和狂犬病抗原呈現(xiàn)低于1比10，約1比9，約1比8，約1比7，約1比5，約1比4，約1比3，約1比2，約2比1，約3比1，約4比1，約5比1，約6比1，約7比1，約8比1，約9比1，約10比1，或是大于10比1的比例。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種佐劑組合物或免疫原組成物，其中該免疫原組成物，或是被包含在該免疫原組成物的佐劑組合物，是呈現(xiàn)一固體或液體形態(tài)或是位于溶液或懸浮液內(nèi)。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種佐劑組合物或包含一佐劑組合物的免疫原組成物，其中該佐劑組合物或免疫原組成物能被冷凍干燥。
在相關(guān)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種組合套裝(KIT)，包含該佐劑組合物以及抗原物質(zhì)。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種聚核苷酸佐劑組合物的用途，以制備促進(jìn)宿主的免疫反應(yīng)的藥劑。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)對(duì)于抗原物的免疫反應(yīng)的方法，包括將一用以促進(jìn)抗原物的抗原性的免疫原組成物給予宿主，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物。
在相關(guān)實(shí)施例中，將該免疫原組成物給予一宿主的方法可選自下列方法中的任一個(gè)方式，該方法包括有胃腸道外注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射、經(jīng)呼吸道吸入、直腸傳輸、陰道傳輸、經(jīng)鼻傳輸、經(jīng)口傳輸、經(jīng)眼傳輸、局部傳輸、透皮傳輸或皮內(nèi)傳輸。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)對(duì)于抗原物的免疫反應(yīng)的方法，包含將一用以促進(jìn)抗原物的抗原性的免疫原組成物給予一宿主，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物，其中該宿主是動(dòng)物。
在一個(gè)特別相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種用以促進(jìn)對(duì)于抗原物的免疫反應(yīng)的方法，包含將一用以促進(jìn)抗原物的抗原性的免疫原組成物給予一宿主，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物，其中該宿主是人類。
通過(guò)后續(xù)的詳細(xì)敘述內(nèi)容以及所附圖式，本發(fā)明的上述特點(diǎn)和其它優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得明顯。
第1圖顯示Av-PICKCa和PIKA樣品的相對(duì)分子量。
第2圖顯示PIKA疫苗誘導(dǎo)特異性產(chǎn)生伽瑪干擾素細(xì)胞因子的劑量依賴性生成。
具體實(shí)施方式本發(fā)明可藉由后續(xù)對(duì)于本發(fā)明某些具體描述以及其中所包括的實(shí)施例的詳細(xì)內(nèi)容而更容易被了解。
本中請(qǐng)案在整篇內(nèi)容中參照公開(kāi)文獻(xiàn)，這些公開(kāi)文獻(xiàn)的內(nèi)容被并入本申請(qǐng)案中作為參考，以充分地?cái)⑹霰景l(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域：
的水準(zhǔn)。
在進(jìn)一步敘述本發(fā)明之前，應(yīng)明暸本發(fā)明不會(huì)被局限于所述特定實(shí)施例中，因?yàn)檫@些實(shí)施例必然是多樣的。亦應(yīng)明暸本說(shuō)明書(shū)中所使用的用語(yǔ)僅是為了闡述特定實(shí)施例，而非作為限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將會(huì)被界定在所附申請(qǐng)專利范圍中。
除非另行界定，本說(shuō)明書(shū)中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)用語(yǔ)均和本案所屬技術(shù)領(lǐng)域：
中具有通常知識(shí)的人士所普遍明暸的意義相同?，F(xiàn)在就實(shí)施本發(fā)明的較佳方法和材料加以敘述，但是和本說(shuō)明書(shū)中所述方法和材料類似或等效的任何方法和材料均可用以實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。本說(shuō)明書(shū)中所提到的所有公開(kāi)文獻(xiàn)均被并入于此作為參考，以揭示并說(shuō)明所述公開(kāi)文獻(xiàn)中的方法及/或材料。
應(yīng)注意，如本案說(shuō)明書(shū)和申請(qǐng)專利范圍中所使用的用語(yǔ)，除非前后文意指明另有其它意義，否則單數(shù)形用語(yǔ)“a”、“and”和“the”包括復(fù)數(shù)形用語(yǔ)。因此，例如提及“一個(gè)文句”即包括此文句的復(fù)數(shù)形式，提及“該片段”即包括提及一或多個(gè)片段以及熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉的等效體等等。此外應(yīng)注意，申請(qǐng)專利范圍可被撰寫(xiě)成排除任何可選擇性成分。因此，此一說(shuō)明是要作為使用例如“僅有(solely)”、“只有(only)”等排除性用語(yǔ)于申請(qǐng)專利范圍構(gòu)成要件的相關(guān)載述內(nèi)容時(shí)或是使用“負(fù)向”限制(“negative”limitation)時(shí)的前述基礎(chǔ)(antecedentbasis)。
名詞定義在陳述本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容之前，應(yīng)當(dāng)了解被使用于本說(shuō)明書(shū)中的數(shù)個(gè)用語(yǔ)。
使用于此處的“佐劑”此用語(yǔ)是指增加或改變宿主對(duì)于抗原物的免疫反應(yīng)的任何物質(zhì)或物質(zhì)混合物。特定地說(shuō)1.“PICKCa”此用語(yǔ)是一般性地指稱一個(gè)由PIC、卡那霉素和鈣所構(gòu)成的組合物，而組合物無(wú)特定的物理和免疫原性特性。
2.“Av-PICKCa”是指PICKCa在商業(yè)上被使用作為抗病毒藥劑的形式。
3.“PIKA”是指本發(fā)明組合物，包含PIC、一抗生素(例如卡那霉素)以及一陽(yáng)離子(例如鈣)，其中所述PIKA的特征在于物理特性(例如本說(shuō)明書(shū)中所敘述的分子量、大小等)，以使得PIKA在給予后可展現(xiàn)出一個(gè)佐劑的特性，且具有相較于以PICKCa為例更低的不良副作用(例如毒性降低)以及相較于以Av-PICKCa為例更高的效力強(qiáng)度(例如誘導(dǎo)增進(jìn)的免疫反應(yīng))。
“含PIC分子”或“含PIC物”是非限制性地指稱PIC，它可選擇性地通過(guò)復(fù)合或組合以上所述含PIC分子的組合物中的一抗生素(例如卡那霉素)以及一陽(yáng)離子(例如鈣)中的至少一者或二者。
在本發(fā)明佐劑組合物的前后文中所使用的“異質(zhì)”此用語(yǔ)是指該組合物的成份(例如含PIC分子)在分子量、大小或此二者的物理特性上不是均一的。
“動(dòng)物”此用語(yǔ)包括人類及所有畜養(yǎng)和野生的動(dòng)物及禽鳥(niǎo)，其非限制性地包括牛、馬、乳牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、鹿、貂、雞、鴨、鵝、火雞、斗雞等。
“抗體”此用語(yǔ)包括多株及單株抗體以及這些抗體的抗原物結(jié)合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv片段，以及這些抗體和片段的單鏈衍生物。此外，“抗體”此用語(yǔ)包括天然發(fā)生的抗體以及非天然發(fā)生的抗體，包括例如嵌合型(chimeric)、雙官能型(bifunctional)和擬人化(humanized)抗體，以及相關(guān)的合成異構(gòu)形式(isoforms)。
如本說(shuō)明書(shū)中所使用，“抗原物”此用語(yǔ)是指可在適當(dāng)情形下被免疫系統(tǒng)所辨識(shí)(例如結(jié)合至抗體或被加工，以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng))的任何物質(zhì)。
“抗原”是指一種物質(zhì)，包括呈現(xiàn)疫苗形式的組成物，其中該疫苗本身包含抗原物，且可以包含或可以不包含除了PIKA以外的佐劑，當(dāng)經(jīng)由適當(dāng)途徑(例如胃腸道外)給予時(shí)，該抗原會(huì)引起例如形成抗體等免疫反應(yīng)，包括特定地結(jié)合該抗原的抗體?？乖膬蓚€(gè)特性在于它們的免疫原性以及它們的抗原性，免疫原性也就是它們?cè)诨铙w內(nèi)引起免疫反應(yīng)的能力，抗原性也就是它們被抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體所具有的選擇性辨識(shí)能力。
“細(xì)胞免疫(cell-mediated immunity)”和“細(xì)胞免疫反應(yīng)(cell-mediated immune response)”等用語(yǔ)是指淋巴細(xì)胞所提供的免疫防御力，例如T淋巴細(xì)胞在靠近受害細(xì)胞時(shí)所提供的防御力。一個(gè)細(xì)胞免疫反應(yīng)通常包括淋巴細(xì)胞的增殖。當(dāng)測(cè)量“淋巴細(xì)胞的增殖”時(shí)，會(huì)測(cè)量淋巴細(xì)胞因應(yīng)一特定抗原的增殖能力。淋巴細(xì)胞增殖是指B細(xì)胞、T-輔助細(xì)胞或細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞(CTL)的細(xì)胞增殖。
“抗原物有效量”是指抗原物的用量將會(huì)致使個(gè)體產(chǎn)生針對(duì)該抗原物的一個(gè)特異性免疫反應(yīng)，該抗原物可選擇性地和一佐劑組合。
“增加免疫反應(yīng)”此表達(dá)方式或類似表達(dá)方式的意思是，相較于先前的免疫反應(yīng)狀態(tài)，免疫反應(yīng)被提高、改善或上升，而對(duì)宿主有利，所述先前的免疫反應(yīng)狀態(tài)是例如給予本發(fā)明的免疫原組成物之前的免疫反應(yīng)狀態(tài)。
“體液免疫力(humoral immunity)”和“體液免疫反應(yīng)(humoralimmune response)”等用語(yǔ)是指因應(yīng)抗原刺激而產(chǎn)生抗體分子的免疫形式。
“免疫反應(yīng)”此用語(yǔ)是指一脊椎動(dòng)物個(gè)體的免疫系統(tǒng)對(duì)于抗原物的任何反應(yīng)。典型的免疫反應(yīng)包括但不限于細(xì)胞和局部及系統(tǒng)性體液免疫反應(yīng)，例如包括CD8+CTLs的抗原特異性誘導(dǎo)作用在內(nèi)的CTL反應(yīng)、包括T-細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子釋出作用在內(nèi)的輔助型T-細(xì)胞反應(yīng)，以及包括抗體反應(yīng)在內(nèi)的B-細(xì)胞免疫反應(yīng)。
本說(shuō)明書(shū)所使用的“誘導(dǎo)免疫反應(yīng)”此用語(yǔ)是一般性地包含一免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)及/或增效(induction and/or potentiation)。
“產(chǎn)生免疫反應(yīng)”此用語(yǔ)是指刺激、起始或引起一個(gè)免疫反應(yīng)。
“增強(qiáng)(potentiating)免疫反應(yīng)”是指一個(gè)既存的免疫反應(yīng)被改善、助長(zhǎng)、補(bǔ)充、擴(kuò)增、促進(jìn)、增加或延長(zhǎng)。
“聚I:C”或“PIC”等用語(yǔ)是指一個(gè)含有聚核糖肌苷和聚核糖胞苷核酸的組合物，亦分別稱作為聚肌苷酸-聚胞苷酸。
“免疫原量”此用語(yǔ)是指，相較于沒(méi)有聚核苷酸佐劑時(shí)所觀察到的免疫反應(yīng)，抗原物加入本發(fā)明的組合物共同給予時(shí)足以刺激免疫反應(yīng)抗原用量。
“免疫增效量(immunopotentiating amount)”此用語(yǔ)是指，相較于沒(méi)有聚核苷酸佐劑時(shí)所觀察到的抗體效價(jià)及/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，當(dāng)佐劑和抗原物在本發(fā)明組合物內(nèi)共同給予時(shí)，致使抗體效價(jià)及/或細(xì)胞免疫反應(yīng)增加所需的佐劑量。
如本說(shuō)明書(shū)中所使用，“混合”此用語(yǔ)包括用以組成組合物的成份的任何方法；這些方法包括但不限于摻合、分配、溶解、乳化、凝集、懸浮或?qū)⒔M合物的組成份合理地加以組合的其它方法。
″藥學(xué)上可接受的鹽″的化學(xué)物意指該鹽是藥用上可接受的，且擁有母化合物的所需藥理活性。這些鹽包括(1)合成鹽的酸，例如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸共同形成鹽；或是和例如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊丙酸、乙二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯醯基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡萄糖甲酸、4，4′-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、三級(jí)丁基乳酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、麩胺酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等有機(jī)酸等共同形成鹽；或是(2)當(dāng)母化合物中所存在的酸性質(zhì)子被一如堿金族金屬離子、堿土族金屬離子或鋁離子等金屬離子所置換，或是配位有如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胺基丁三醇(tromethamine)、葡甲胺(N-methylglucamine)等有機(jī)堿時(shí)，所形成的鹽。
“治療”此用語(yǔ)涵蓋對(duì)于脊椎動(dòng)物(特別是人類)體內(nèi)的疾病的任何處理，且包括(i)預(yù)防一可能有罹病傾向但尚未診斷出罹病的個(gè)體發(fā)生疾??；(ii)遏制疾病，例如阻止該疾病的發(fā)展；或是(iii)舒緩疾病，例如致使該疾病消退。
本說(shuō)明書(shū)中所使用的“單位劑型”此用語(yǔ)是指數(shù)個(gè)在實(shí)體上呈分離的單位，適合作為使用于人類和動(dòng)物個(gè)體的單位劑量，各個(gè)單位含有一預(yù)定量的本發(fā)明組合物，該預(yù)定量經(jīng)計(jì)算后呈現(xiàn)一個(gè)足以和藥學(xué)/藥理上可接受的稀釋劑、載劑或載體共同產(chǎn)生所需效應(yīng)的用量。
發(fā)明總論本發(fā)明關(guān)于用在人類、動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物中促進(jìn)免疫反應(yīng)的組合物和方法，該免疫反應(yīng)可為體液及/或細(xì)胞免疫反應(yīng)。一般而言，該組成物包含一種含有一佐劑的免疫原組成物。該佐劑的存在會(huì)促進(jìn)或改變免疫反應(yīng)。因此，該體液及/或細(xì)胞免疫反應(yīng)因該佐劑的存在而更加有效。此外，該佐劑可藉由影響免疫球蛋白和細(xì)胞因子的數(shù)種亞型(異構(gòu)型)的產(chǎn)生而改變免疫反應(yīng)的品質(zhì)。
該佐劑的關(guān)鍵特性在于它能誘導(dǎo)所需的免疫反應(yīng)水平和種類而不會(huì)引起相應(yīng)不良副作用的能力。目前僅有少數(shù)經(jīng)過(guò)批準(zhǔn)供人類使用的佐劑具有此種特性組合。免疫原物質(zhì)(特別指疫苗)的安全標(biāo)準(zhǔn)是嚴(yán)格且嚴(yán)厲執(zhí)行的。因此，研發(fā)出一種成功佐劑的主要限制在于研發(fā)出一種足以誘導(dǎo)一適當(dāng)免疫反應(yīng)的有效產(chǎn)品，而不會(huì)引起相應(yīng)不良副作用。
本發(fā)明的較佳實(shí)施例是一種聚核苷酸佐劑，其中該聚核苷酸是聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)。PIC已單獨(dú)地顯示為一種有效的佐劑，但會(huì)展現(xiàn)出令人無(wú)法接受的安全性特質(zhì)，且在人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)不穩(wěn)定。本發(fā)明提供一種由PIC和一抗生素及陽(yáng)離子相組合而成的組合物，它能促進(jìn)一佐劑的所需免疫原特性，并改善安全性和穩(wěn)定性特質(zhì)。
本發(fā)明的進(jìn)一步基礎(chǔ)是來(lái)自于發(fā)現(xiàn)佐劑組合物的PIKA分子的物理和生物特性會(huì)影響免疫反應(yīng)和不良副作用。本案發(fā)明人在研發(fā)期間意外地發(fā)現(xiàn)，以后述方式來(lái)調(diào)整該聚核苷酸佐劑的某些特性，它在就會(huì)或多或少地變得有效及/或者或多或少地變得具有毒性。因此，從物理特性的角度來(lái)界定該佐劑組合物，即有可能更正確地描述該佐劑組合物在提供較佳免疫原性反應(yīng)和較佳安全性/穩(wěn)定性特質(zhì)上的特性。
因此，在此被簡(jiǎn)稱為PIKA佐劑的本發(fā)明佐劑完全地被它的化學(xué)組成加上構(gòu)成該佐劑的分子的基本物理特性的組合所界定。因此，展現(xiàn)出優(yōu)越免疫原性質(zhì)且同時(shí)能安全使用于動(dòng)物或人類的PIKA的特定形式被最適當(dāng)?shù)赜梢换蚨鄠€(gè)通常是呈組合的特定特質(zhì)所界定，包括組成、分子量、分子大小、濃度和pH。
PIKA通常包含一聚核苷酸、一抗生素以及一陽(yáng)離子，其中該聚核苷酸可為聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)，且該抗生素是胺基糖苷(例如卡那霉素、鏈霉素、泰百霉素(tobramycin)、新霉素、蒽環(huán)霉素、硫酸丁酰苷菌素、慶大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、雙去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺、嘌呤霉素或鏈脲霉素)，以及該離子是鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅。
“胺基糖苷”抗生素是指該抗生素在結(jié)構(gòu)上含有藉由糖苷鍵而接合至一個(gè)胺基環(huán)醇環(huán)(己糖核心)的胺糖。胺基糖苷抗生素是從多種鏈霉菌(Streptomyces)和小單孢菌(Micromonospora)衍生而來(lái)，或是合成生產(chǎn)。例如，卡那霉素是一種得自于土壤細(xì)菌SteptomycesKanamycetics的胺基糖苷抗生素，用于治療多種感染，特別是由格蘭式陰性細(xì)菌(Gram-negative bacteria)所導(dǎo)致的感染。
PIKA組合物是經(jīng)由在一個(gè)具有pH6至pH8的pH值的氯化鈉/磷酸鹽緩沖液內(nèi)，將聚肌苷酸、聚胞苷酸、一抗生素和一陽(yáng)離子來(lái)源加以混合而制成。聚肌苷酸和聚胞苷酸的濃度通常為0.1至10mg/ml，較佳為0.5至5mg/ml且更佳為0.5 to 2.5 mg/ml。增色值(hyperchromicityvalue)應(yīng)高于10％，較佳為高于15％且更佳為高于20％。PIC的制備以及和卡那霉素和鈣的組合最好是在符合于國(guó)際優(yōu)良制程規(guī)范的品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，聚核苷酸佐劑組合物內(nèi)的卡那霉素可和一或多種抗生素共同使用或被一或多種抗生素所取代，這些抗生素選自于包括泰百霉素、蒽環(huán)霉素、硫酸丁酰苷菌素、慶大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、雙去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺、新霉素、嘌呤霉素、鏈霉素和鏈脲霉素所構(gòu)成的群組中。本發(fā)明聚核苷酸佐劑組合物內(nèi)的抗生素(例如卡那霉素等)的濃度通常為約10至100,000單位/ml，較佳為約100至10,000單位/ml，且更佳為約500至5,000單位/ml。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，該聚核苷酸佐劑組合物更包含一個(gè)陽(yáng)離子(陽(yáng)離子)，通常是一個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子，且通常是一個(gè)堿金族金屬的一個(gè)陽(yáng)離子。在本發(fā)明的組合物內(nèi)，該陽(yáng)離子一般被用作為一個(gè)陽(yáng)離子的來(lái)源，例如一種鹽或復(fù)合物，例如一種有機(jī)或無(wú)機(jī)鹽或復(fù)合物，且通常是一種無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)復(fù)合物。典型的陽(yáng)離子包括但不必然限于鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅。
本發(fā)明的組合物內(nèi)可配有陽(yáng)離子(例如鈣)，該陽(yáng)離子的濃度位在約10umol至10mmol/ml的范圍內(nèi)，較佳為約50umol至5mmol/ml，且更佳為約100umol至1mmol/ml。
如前所述，陽(yáng)離子可以呈任何適當(dāng)?shù)柠}或有機(jī)復(fù)合物的形式，包括但不必然限于氯化物、氟化物、氫氧化物、磷酸鹽或硫酸鹽。例如，當(dāng)該陽(yáng)離子是鈣時(shí)，則該離子可呈碳酸鈣、氯化鈣、氟化鈣、氫氧化鈣、磷酸鈣或硫酸鈣的形式。
當(dāng)本發(fā)明佐劑組合物中的陽(yáng)離子是鈣時(shí)，則它可和其它陽(yáng)離子相組合或被其它陽(yáng)離子所取代，這些陽(yáng)離子包括鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅，其中這些離子可呈無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)復(fù)合物的形式。
所得的組合物經(jīng)由一個(gè)額外的制造過(guò)程而被進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成為PIKA，這個(gè)額外的制造過(guò)程涉及分離具有所界定的分子大小及/或重量的分子。利用過(guò)濾、層析、熱處理、離心分離、電泳以及已經(jīng)成為標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程的類似方法來(lái)分離出具有特定特性的聚核苷酸分子，是熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉的。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，該聚核苷酸佐劑組合物進(jìn)一步藉由分子量的物理特性來(lái)界定。在研發(fā)期間，本案發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)聚核苷酸佐劑組合物的分子量和有效性之間存在有正相關(guān)性。一個(gè)含有該聚核苷酸佐劑組合物的免疫原組成物被觀測(cè)到的效力強(qiáng)度水平，包括誘導(dǎo)免疫球蛋白和細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力，會(huì)隨著聚核苷酸佐劑組合物的分子量增加而上升。聚核苷酸佐劑的分子量可藉由實(shí)施例1所述瓊脂糖凝膠電泳來(lái)測(cè)定。
如后續(xù)實(shí)施例部分所述，本案發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，含有一個(gè)多樣化分子量的PIKA佐劑的疫苗組成物在分子量和抗原特異性保護(hù)效力強(qiáng)度之間會(huì)展現(xiàn)出直接的關(guān)聯(lián)(參見(jiàn)實(shí)施例2)。類似地，本案發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PIKA佐劑組合物和一狂犬病抗原組合給予宿主時(shí)，PIKA佐劑組合物的分子量和誘導(dǎo)伽瑪型干擾素產(chǎn)生的能力之間存在直接的關(guān)聯(lián)(參見(jiàn)實(shí)施例3)。
本案發(fā)明人于1996年在中國(guó)所進(jìn)行的人體試驗(yàn)期間，利用一種帶有佐劑的狂犬病疫苗而該佐劑包含極高分子量規(guī)格的PICKCa，本案發(fā)明人進(jìn)一步鑒定出，所得組合物意外地顯示出具有令人無(wú)法接受的不良副作用水平。在1996年臨床試驗(yàn)所得到的結(jié)果在先前未被公開(kāi)，現(xiàn)在顯示于實(shí)施例4中。對(duì)于分子量的研究則顯示于實(shí)施例5和6中。該試驗(yàn)是在中國(guó)衛(wèi)生部食品藥物管理部門(mén)的管轄下進(jìn)行。因此，若基于當(dāng)時(shí)的知識(shí)已經(jīng)可以預(yù)期到這些不良副作用，則該佐劑將不會(huì)在一個(gè)受監(jiān)管的臨床環(huán)境中給予人體實(shí)驗(yàn)。
本案發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在臨床前試驗(yàn)中分子量達(dá)到1.0×106的本發(fā)明PIKA佐劑組合物，以及含有分子量達(dá)到5.5×105的PIKA佐劑組合物的疫苗組成物，在特定毒性試驗(yàn)中顯示出寬廣的安全性范圍(參見(jiàn)實(shí)施例7)。具有最高分子量為1.2×106的PIKA已被成功地使用在臨床前研究中(參見(jiàn)實(shí)施例3)。本案發(fā)明人所進(jìn)行的進(jìn)一步研究顯示PIKA和一個(gè)抗原物合并成疫苗形式時(shí)的安全性(參見(jiàn)實(shí)施例8)。
本案發(fā)明人于2002年在中國(guó)所進(jìn)行的一項(xiàng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，應(yīng)用PIKA可提供一種安全且有效的人用佐劑。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果先前未被公開(kāi)，現(xiàn)在顯示在實(shí)施例9中。
因此，以前述觀察為基礎(chǔ)，PIKA的較佳實(shí)施例中所包含的分子在分子量及/或大小上具有物理特性，這些物理特性能夠增加效力強(qiáng)度和有效性的益處，同時(shí)提供一個(gè)適當(dāng)?shù)陌踩苑秶圆灰l(fā)任何不良副作用。在Av-PICKCa內(nèi)所存在的分子，位在分子量范圍的較低端，可有效地作為一種抗病毒合成物，但在一免疫原組成物內(nèi)使用作為佐劑時(shí)，顯著地較PIKA的分子組成低效。此外，PIKA已顯示具有較PICKCa更佳的安全性表現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)關(guān)鍵方面是本發(fā)明組合物PIKA的分子量。
PIKA的創(chuàng)作性組成一般包含一組或一群分子，其中這些分子在例如分子量及/或大小上具有物理特性，這些物理特性在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)上提供所需的效應(yīng)，且更好地減低或避免不良副作用(例如給予PICKCa時(shí)所并發(fā)的不良副作用)。一般而言，PIKA的分子在分子量及/或大小上是異質(zhì)的。
除非另外指明，否則本說(shuō)明書(shū)中所通稱的本發(fā)明佐劑組合物PIKA包括PIC，該P(yáng)IC可和一抗生素(例如卡那霉素)以及一陽(yáng)離子(例如鈣)相復(fù)合。PIKA內(nèi)的分子在分子量(例如以道爾頓來(lái)估算)或是大小(例如以沉降系數(shù)來(lái)估算)上是異質(zhì)的。
當(dāng)使用一個(gè)范圍來(lái)描述PIKA分子的異質(zhì)特性(例如分子量或大小)時(shí)，此一范圍的描述在本說(shuō)明書(shū)中是指PIKA分子在組合物內(nèi)的分子量或大小的概略下及上限，而不是暗示或指出該組合物具有代表該范圍內(nèi)的每一分子量或大小的PIKA分子。因此，例如分子量范圍為約66,000至1,200,000道爾頓是指約66,000道爾頓至約1,200,000道爾頓的PIKA分子被包含在組合物內(nèi)，但88,000道爾頓的PIKA分子不必然存在于組合物內(nèi)(雖然此分子確實(shí)可以存在)。
當(dāng)以分子量范圍來(lái)界定本發(fā)明組合物內(nèi)的PIKA分子的物理特性時(shí)，這些PIKA分子在分子量上是異質(zhì)的，其中該分子量范圍為約300,000至660,000道爾頓，約300,000至1,200,000道爾頓，約66,000至660,000道爾頓，或是約66,000至1,200,000道爾頓。
本發(fā)明亦思及具有在分子量上呈異質(zhì)的PIKA分子的組合物，其中該分子量范圍為約300,000至2,000,000道爾頓，約300,000至4,000,000道爾頓，約500,000至1,000,000道爾頓，約1,000,000至1,500,000道爾頓，約1,500,000至2,000,000道爾頓，約2,000,000至2,500,000道爾頓，約2,500,000至3,000,000道爾頓，約3,000,000至3,500,000道爾頓，約3,500,000至4,000,000道爾頓，約4,000,000至4,500,000道爾頓，或是約4,500,000至5,000,000道爾頓。位在這些范圍的上和下限處以及位在這些范圍內(nèi)的PIKA分子均存在于組合物內(nèi)。
當(dāng)以平均分子量來(lái)界定本發(fā)明組合物內(nèi)的PIKA分子的物理特性時(shí)，該P(yáng)IKA分子的平均分子量可等于或高于150,000道爾頓，等于或高于250,000道爾頓，等于或高于350,000道爾頓，等于或高于500,000道爾頓，等于或高于650,000道爾頓，等于或高于750,000道爾頓，等于或高于1,000,000道爾頓，等于或高于1,200,000道爾頓，等于或高于1,500,000道爾頓，或是等于或高于2,000,000道爾頓。
當(dāng)以沉降系數(shù)來(lái)界定本發(fā)明組合物內(nèi)的PIKA分子的物理特性時(shí)，沉降系數(shù)是分子量和大小的一個(gè)度量，該P(yáng)IKA分子的沈降系數(shù)(S)可為高于9S或高于約12S或高于約13.5S，或高于15S，或高于16S，或高于17S，或高于18S，或高于19S，或高于20S，或高于21S，或高于22S，或高于25S，或高于30S。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那霉素和鈣，其中該組合物排除一可測(cè)得數(shù)量的分子，這些分子的分子量大約或低于30,000道爾頓，大約或低于40,000道爾頓，大約或低于50,000道爾頓，大約或低于60,000道爾頓，大約或低于70,000道爾頓，大約或低于80,000道爾頓，大約或低于90,000道爾頓，大約或低于100,000道爾頓，大約或低于150,000道爾頓，大約或低于200,000道爾頓，大約或低于250,000道爾頓，大約或低于300,000道爾頓，大約或低于350,000道爾頓，大約或低于400,000道爾頓，大約或低于450,000道爾頓，大約或低于500,000道爾頓，大約或低于600,000道爾頓，大約或低于700,000道爾頓，大約或低于800,000道爾頓，大約或低于900,000道爾頓，或大約或低于1,000,000道爾頓。在此實(shí)施例中，在這些被排除的分子不具有顯著的免疫原效應(yīng)的程度上排除這些較低分子量分子是特別有利的。
本案發(fā)明人已在特定毒性測(cè)試中顯示，包含分子量達(dá)到1.0×106道爾頓的分子的PIKA對(duì)于動(dòng)物是安全的(參見(jiàn)實(shí)施例7)。包含有最高分子量為1.2×106道爾頓的分子的PIKA已安全地使用在臨床前測(cè)驗(yàn)中(參見(jiàn)實(shí)施例3)。當(dāng)PIKA使用于一免疫原組成物時(shí)亦顯示具有安全性(參見(jiàn)實(shí)施例8)。PIKA的組成在有效性上提供了優(yōu)點(diǎn)。包含有分子量低至6.6×105道爾頓的分子的PIKA在使用于人類及動(dòng)物時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)，且具有廣寬范圍的安全性。將所需要的最小分子的分子量提高至6.6×105道爾頓，且較佳為提升至3.0×105道爾頓，可改善佐劑的有效性，而無(wú)需在安全性標(biāo)準(zhǔn)上妥協(xié)。
本案發(fā)明人已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，聚核苷酸佐劑組合物的濃度可能會(huì)影響到該組合物內(nèi)所含分子的分子量。PICKCa的分子量已顯示會(huì)隨著佐劑組合物的濃度的上升而增加(參見(jiàn)實(shí)施例5)。本案發(fā)明人已觀察到，聚核苷酸佐劑濃度上升會(huì)造成PICKCa分子的聚結(jié)(或稱凝集)，而使得分子具有較高的分子量。這個(gè)過(guò)程已被顯示為不可逆。因此，聚核苷酸佐劑組合物后續(xù)稀釋于一適當(dāng)媒質(zhì)中不會(huì)造成佐劑分子分子量的降低。如實(shí)施例6中所觀察，當(dāng)聚核苷酸佐劑組合物的濃縮大分子形式和狂犬病抗原相組合時(shí)，結(jié)果得到一個(gè)保留有高分子量范圍的組合物。以這個(gè)方式所形成的一種狂犬病疫苗在人體臨床試驗(yàn)中顯示出不良副作用(參見(jiàn)實(shí)施例4)。
本發(fā)明的PIKA組合物可被配入任何生理上可接受的緩沖液內(nèi)，但以磷酸鹽緩沖液為佳。亦可使用如乙酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(tris)、碳酸氫鹽、碳酸鹽等其它可接受的緩沖液作為磷酸鹽緩沖液的取代品。
水溶液成份的pH值在4.0和10.0之間較佳，但更佳是將該系統(tǒng)的pH值調(diào)整至6至8.5，這pH值不會(huì)顯著降低其它組成份的穩(wěn)定性，且不至于在生理上不兼容。在某些實(shí)施例中，該免疫原組成物的水分是緩沖化的生理鹽水。欲以胃腸道外方式給予這些組成物時(shí)，較佳是將這些溶液制成張力(即滲透壓)基本上和正常生理體液相同，以避免組成物因組成物和生理體液之間的差異性離子濃度而在給予后組織膨脹或快速吸收。
緩沖化生理鹽水在這些組成物內(nèi)的用量是將組成物數(shù)值達(dá)成整數(shù)所需的用量。也就是說(shuō)，足夠的緩沖化生理食鹽水用量將會(huì)和其它成份相混合而達(dá)成100％，以使組成物達(dá)到所需體積。
在某些實(shí)施例中，抗原可從一天然來(lái)源被純化而得、由固相合成而得，或是由基因重組技術(shù)而獲得?？乖砂粋€(gè)蛋白質(zhì)片段，該蛋白質(zhì)片段含有該分子的一或多個(gè)免疫原區(qū)。抗原亦可從活的、減毒的、或截短的或被滅活的完整細(xì)胞或微生物(例如完整病毒顆粒)來(lái)提供。
在其它的實(shí)施例中，抗原包括一或多種成分，源自于感染性微生物、植物抗原、癌腫、過(guò)敏性物質(zhì)以及例如會(huì)引發(fā)自體免疫疾病的其它人類抗原。在其它的實(shí)施例中，抗原包括一或多種感染性微生物，源自于病毒、細(xì)菌、分枝桿菌、真菌及寄生蟲(chóng)中的任一種。
本發(fā)明的聚核苷酸佐劑組合物亦可用于促進(jìn)免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)是針對(duì)運(yùn)用DNA疫苗所產(chǎn)生的抗原。這些疫苗中用以抗原編碼的DNA序列可以是″裸露的″，或是被容納在一個(gè)如脂質(zhì)小體的載體系統(tǒng)內(nèi)。
在某些實(shí)施例中，該聚核苷酸佐劑組合物可和疫苗組合使用。疫苗是可含有其他佐劑或不含其他佐劑。所包括的疫苗種類為抗感染疾病、抗癌、抗過(guò)敏、抗自體免疫以及免疫避孕。
本發(fā)明亦思及本發(fā)明聚核苷酸佐劑和任何適合的狂犬病抗原的組合應(yīng)用。
在某些實(shí)施例中，狂犬病抗原可為如倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活粗制狂犬病抗原(HKC-ICRA)等滅活粗制狂犬病抗原，或是倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)等滅活純化型狂犬病抗原。
在某些實(shí)施例中，該聚核苷酸佐劑組合物可和一狂犬病疫苗共同使用。適合的狂犬病疫苗是商業(yè)上可購(gòu)得的或是仍在研發(fā)中，包括滅活型、亞單位型、基因重組型和多肽型疫苗，例如人類雙倍體細(xì)胞疫苗(HDCV)，或是倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病疫苗(HKC-IPRV)，或是倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活粗制狂犬病疫苗(HKC-ICRV)，或是純化型Vero細(xì)胞狂犬病疫苗(PVRV)，或是純化型雞胚細(xì)胞(PCEC)，或是純化型鴨胚疫苗(PDEV)。但是，這些狂犬病疫苗并非都能夠誘導(dǎo)在暴露前和暴露后免疫法中具有重要性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。當(dāng)聚核苷酸佐劑組合物(例如PIKA)和狂犬病疫苗共同給予時(shí)，被引起的免疫反應(yīng)包括非-特異性反應(yīng)(例如巨噬細(xì)胞功能上升)、體液反應(yīng)(例如增進(jìn)特異性抗體的產(chǎn)生)以及細(xì)胞免疫反應(yīng)(例如產(chǎn)生細(xì)胞因子，包括干擾素及白介素-2)。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種組合套裝(KIT)，包含該聚核苷酸佐劑以及抗原物。
一種包括有PIKA的免疫原組成物能夠以二種方式來(lái)引起特異性免疫反應(yīng)i)體液免疫反應(yīng)，涉及刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體或免疫球蛋白(其它細(xì)胞亦涉及產(chǎn)生抗體反應(yīng)過(guò)程，例如抗原-呈示細(xì)胞(APCs，包括巨噬細(xì)胞)及輔助性T細(xì)胞(Th1和Th2)，以及ii)細(xì)胞免疫反應(yīng)，一般涉及T細(xì)胞、包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)和其它涉及CTL反應(yīng)的產(chǎn)生例如，Th1和/或Th2細(xì)胞以及APCs。業(yè)界已熟知用以評(píng)估一個(gè)體內(nèi)的體液及/或細(xì)胞免疫反應(yīng)的方法(參見(jiàn)實(shí)施例10、11、12及13)。
此外，該聚核苷酸佐劑組合物可藉由影響所產(chǎn)生的免疫球蛋白亞型(異構(gòu)型)(對(duì)人類IgGs而言是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；對(duì)小鼠IgGs而言是IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)以及它們的親和力，來(lái)改變免疫反應(yīng)的性質(zhì)。
在鼠體中，被Th1細(xì)胞所調(diào)控的反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生IgG1、IgG2a、IgG2b以及較少的IgG3，亦有利于針對(duì)抗原產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。若對(duì)于抗原的IgG反應(yīng)是被Th2型細(xì)胞所調(diào)控，則其主要為增進(jìn)IgGI and IgA的產(chǎn)生。
利用一種由PIKA佐劑和倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原所構(gòu)成的組成物來(lái)進(jìn)行的NIH效力實(shí)驗(yàn)意外地顯示出，該組成物的免疫力強(qiáng)度需要一最少量的狂犬病抗原的存在(參見(jiàn)實(shí)施例14)。該組成物的效力強(qiáng)度相對(duì)于超過(guò)1 IU抗原量的額外狂犬病抗原的存在而迅速增加。因此，經(jīng)觀察，該組成物在效力強(qiáng)度上的增加速率是在組成物存在有約1.5IU至2.5IU的狂犬病抗原時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。該NIH效力實(shí)驗(yàn)被描述在Laboratory Techniques in Rabies，Edited by F X Meslin，M MKaplan H Koprowski，4th Edition，ISBN 92 4 1544 1。
利用一種由PIKA佐劑和倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原所構(gòu)成的組成物來(lái)進(jìn)行的試驗(yàn)顯示，該組成物的免疫力強(qiáng)度隨著佐劑體積超過(guò)抗原體積量而增加。當(dāng)PIKA對(duì)于倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原的比例增加時(shí)，該效力強(qiáng)度會(huì)增加，且較佳體積比例為高于3∶1。(參見(jiàn)實(shí)施例15)
本發(fā)明思及將本發(fā)明聚核苷酸佐劑和抗原共同使用的方法，以例如誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)的抗原特異性體液反應(yīng)及/或特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)可為在之前沒(méi)有免疫的個(gè)體中對(duì)于抗原的反應(yīng)，或是可用以促進(jìn)一之前已有的免疫反應(yīng)(例如加強(qiáng)劑)。
在某些實(shí)施例中，PIKA佐劑組合物以及一種包含PIKA佐劑和抗原物的免疫原組成物可被冷涷干燥，以呈固體形式長(zhǎng)時(shí)穩(wěn)定保存。冷涷干燥法是熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉的。將含PIKA和抗原物的免疫原組成物凍干物加水溶解顯示其維持原有的有效性水平(參見(jiàn)實(shí)施例16)。
該免疫原組成物可被制備成為一種可注射型溶液、懸浮液或乳劑。所需免疫原組成物配方的制備被一般性地?cái)⑹鲈贜ew Trends andDevelopments in vaccines，edited by Voller et al.，University Park Press，Baltimore，Md.，USA，1978。本發(fā)明的免疫原組成物可以用作以下劑型，例如膠囊、溶液、乳劑、懸浮液或酏劑等形式來(lái)胃腸道給予，任何無(wú)活性媒介物可供優(yōu)選使用，例如生理食鹽水，或磷酸鹽緩沖化生理食鹽水，或是能適當(dāng)溶解本發(fā)明方法所使用的化合物以供本發(fā)明方法應(yīng)用的任何媒介物。
本發(fā)明的免疫原組成物可利用多種熟知的方法給予機(jī)體。在某些實(shí)施例中，免疫原組成物可藉由胃腸道外途徑給予，例如肌肉、腹腔、靜脈、皮下注射等注射方式，或是經(jīng)呼吸道吸入。在其它實(shí)施例中，該免疫原組成物可經(jīng)直腸、陰道、鼻、口、眼、透皮或皮內(nèi)局部來(lái)給予。被囊封的抗原物當(dāng)給予形式是注射時(shí)，會(huì)停留在注射部位長(zhǎng)達(dá)兩周，從而提供一個(gè)在活體內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)式釋放或脈沖式釋放的抗原儲(chǔ)釋點(diǎn)。這個(gè)傳輸系統(tǒng)可針對(duì)需要多次注射才能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的抗原物制成單次注射型免疫原配方。
例如，對(duì)于以水溶液進(jìn)行胃腸道外給予而言，該溶液在必要時(shí)應(yīng)該被適當(dāng)?shù)鼐彌_化，且先以足量的生理食鹽水或葡萄糖來(lái)稀釋以使其呈現(xiàn)等張。這些特定的水性溶液特別適用于靜脈和腹腔內(nèi)給予。關(guān)于這點(diǎn)，熟習(xí)本領(lǐng)域技術(shù)人士將可參照本案揭示內(nèi)容而知悉可供使用的無(wú)菌水性媒媒物?？晒┍景l(fā)明使用的典型注射媒介物包括含有或不含有分散劑及/或防腐劑的緩沖液，以及食用油、礦物油、鱈魚(yú)肝油、角鯊烯(squalene)、一-、二-或三酸甘油酯，以及這些成份的混合物。
這些組成所需的精確用量是隨著個(gè)體不同，依據(jù)個(gè)體的物種、年齡、體重及一般狀態(tài)，被治療或預(yù)防的疾病、感染或病況的嚴(yán)重性，所使用的特定物質(zhì)及它的給予形式等而有所變化。熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士得知本說(shuō)明書(shū)的教示內(nèi)容后，可僅僅利用例行實(shí)驗(yàn)而決定適當(dāng)?shù)挠昧?。初次給予后，個(gè)體可再接受一或多次適當(dāng)間隔的追加免疫。
以上所述內(nèi)容是一般性地?cái)⑹霰景l(fā)明。以下描述實(shí)施例將可協(xié)助了解本發(fā)明。這些實(shí)施例僅以例示說(shuō)明為目的，而非意圖對(duì)于本發(fā)明的范圍加以限制。當(dāng)情勢(shì)所趨或?yàn)橐驎r(shí)制宜時(shí)，當(dāng)可思及本發(fā)明在形式上的變化和等效性取代。雖然本說(shuō)明書(shū)使用特定的用語(yǔ)，但是這些用語(yǔ)是意圖供說(shuō)明之用，而不是以限制為目的。
實(shí)施例實(shí)施例1.測(cè)定PIKA和AV-PICKCA的分子量這個(gè)實(shí)施例說(shuō)明PIKA佐劑的測(cè)定方式，并和Av-PICKCa作比較。
瓊脂糖凝膠電泳已為熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉，因此本說(shuō)明書(shū)僅敘述本發(fā)明的特點(diǎn)。本發(fā)明所使用的瓊脂糖凝膠具有1.5％瓊脂糖的濃度。分子標(biāo)記是100bp至1000bp的100bp DNA梯狀譜帶，對(duì)應(yīng)于6.6×104至6.6×105道爾頓的分子量范圍。4ul加載樣品的濃度是1mg/ml。第1圖顯示參照本段落的教示內(nèi)容所得到瓊脂糖凝膠樣品結(jié)果的一個(gè)代表圖。五個(gè)(5)不同批次的測(cè)驗(yàn)顯示它們的分子量分布的寬廣范圍。它們的分子量上限是位在Av-PICKCa為2.3×105道爾頓至PIKA為5.28×105道爾頓的范圍內(nèi)。
實(shí)施例2.PIKA和AV-PICKCA的免疫有效性的比較這個(gè)實(shí)施例顯示最高分子量為230,000道爾頓的Av-PICKCa和最高分子量為528,000道爾頓的PIKA樣品在效力強(qiáng)度上的差異。
將三批不同分子量的PIKA佐劑，以及一批具有對(duì)應(yīng)于Av-PIKA分子量的分子量的分子，和倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)相組合。隨后，令所得組成物接受NIH效力試驗(yàn)。
該NIH效力試驗(yàn)是一個(gè)嚴(yán)格且大量試驗(yàn)比較性研究，以比較受檢狂犬病疫苗和標(biāo)準(zhǔn)型狂犬病疫苗。以一個(gè)活狂犬病病毒品系來(lái)感染接種疫苗后的小鼠，并測(cè)量它們的存活率。將不同稀釋程度的狂犬病疫苗給予不同群組的小鼠。將被暴露于實(shí)驗(yàn)性及標(biāo)準(zhǔn)型疫苗的小鼠群組之間的存活率加以比較，而測(cè)定出實(shí)驗(yàn)性疫苗的效力強(qiáng)度(LaboratoryTechniques in Rabies，Edited by F X Meslin，M M Kaplan H Koprowski，4th Edition，ISBN 92 4 1544 1)。
將各個(gè)受檢驗(yàn)的組合了PIKA佐劑的疫苗的有效性相對(duì)疫苗標(biāo)準(zhǔn)品予以規(guī)格化，其中疫苗標(biāo)準(zhǔn)品的有效性被標(biāo)定為1，且將相對(duì)有效性標(biāo)定成受檢組合型疫苗的有效性較非組合型標(biāo)準(zhǔn)品增加的倍數(shù)。表1概述這些結(jié)果。如表1所示，PICKCa佐劑的分子量愈高，增加狂犬病疫苗效價(jià)所得的有效性就愈高。
表1.分子量對(duì)于狂犬病疫苗效力強(qiáng)度的效應(yīng)
實(shí)施例3.PIKA和Av-PICKCA之間的干擾素產(chǎn)生比較這個(gè)實(shí)施例顯示，具有分子量上限為230,000道爾頓的Av-PICKCa樣品和具有分子量上限為1,200,000道爾頓的PIKA樣品之間在誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的能力上的差異。
將二批具有分子量上限為1.2×106道爾頓及4.6×105道爾頓的PIKA，和一批具有分子量上限為2.3×105道爾頓的Av-PICKCa作比較。
令PIKA及Av-PICKCa組合物和倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)相組合。將這些組成物經(jīng)皮下注射于小鼠。兩小時(shí)后，測(cè)量每只小鼠的干擾素血清中含量量。測(cè)量干擾素的一般過(guò)程是熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在一個(gè)96孔培養(yǎng)板中，在0.15ml/孔的量下被接種約30,000個(gè)L929細(xì)胞。三天后，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合孔底的程度，將血清樣品以1∶20至1∶640的比例來(lái)稀釋，以血清0.1ml/孔加入孔內(nèi)。各稀釋樣品均以三個(gè)復(fù)孔試驗(yàn)。將這些培養(yǎng)板在37℃下培育至隔日。將血清樣品洗去。使用皰疹性口炎病毒VSV顆粒來(lái)檢測(cè)干擾素的產(chǎn)生效價(jià)。表2顯示被這些混合物所誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素效價(jià)。如表2所示，PIKA樣品的分子量愈高，被誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素就愈多。
表2.分子量和干擾素產(chǎn)生之間的關(guān)系
實(shí)施例4.1996年人用疫苗臨床試驗(yàn)(具有毒性副作用)這個(gè)實(shí)施例顯示PICKCa佐劑和一疫苗相組合會(huì)在給予人體免疫后產(chǎn)生一個(gè)令人無(wú)法接受的不良副作用水平。
這個(gè)研究的目的在于評(píng)估一種狂犬病疫苗的安全性及免疫反應(yīng)，該狂犬病疫苗包含濃度為11.95mg/ml及分子質(zhì)量為69,700(請(qǐng)注意分子質(zhì)量在此例中不等于道爾頓，參見(jiàn)實(shí)施例5)的PICKCa佐劑，以及倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活粗制狂犬病抗原(HKC-ICRA)。上述臨床試驗(yàn)的結(jié)果和結(jié)論從未公開(kāi)。
40位參與臨床試驗(yàn)的病人被分成二個(gè)20人的群組。各群組在第1天、第3天、第7天、第14天及第30天經(jīng)肌肉接受五次2ml的劑量注射。一組接受具有PICKCa佐劑的狂犬病抗原，且另一組接受具有鋁佐劑的狂犬病抗原。
從安全性的觀點(diǎn)，在各次注射后24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)就體溫、局部和全身性癥狀進(jìn)行觀察。下列觀察是表3.注射具有鋁佐劑或PICKCa的HKC-ICRA之后的不良副作用
全身性不良副作用包括發(fā)熱(1例)、起疹(2例)、關(guān)節(jié)痛(2例)、淋巴節(jié)重大(1例)、喉部腫脹(1例)。局部性不良反應(yīng)包括注射部位皮膚變紅(6例)。
本案發(fā)明人的后續(xù)研究將所觀察到的副作用歸因于佐劑內(nèi)分子的分子量和大小(參見(jiàn)實(shí)施例5及6)。
實(shí)施例5.PICKCA濃度及它的分子量之間的關(guān)系這個(gè)實(shí)施例顯示增加PICKCa佐劑的濃度造成組成物的分子量增加。
可將PICKCa制成具有不同的濃度。假設(shè)PICKCa被制成不同濃度時(shí)是一種可以不同形式存在的聚合復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)?zāi)康目墒褂眉す馍⑸浼夹g(shù)來(lái)達(dá)成。激光散射技術(shù)已廣泛地用以測(cè)定重量平均分子質(zhì)量(Mw)以及回轉(zhuǎn)半徑(Rg)。儀器為商業(yè)上可購(gòu)得且測(cè)量過(guò)程是熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉的。表4顯示出，由激光散射技術(shù)所觀察到的PICKCa分子量和它的濃度相關(guān)。
表4.由激光散射技術(shù)所觀察到的分子量
實(shí)施例6.PICKCA的前濃度和疫苗分子量之間的關(guān)系這個(gè)實(shí)施例顯示PICKCa佐劑分子量的增加和所得組成物的分子量之間的關(guān)系，該所得組成物含有PICKCa佐劑以及倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活粗制狂犬病疫苗。
PICKCa樣品的組合前濃度亦被懷疑會(huì)影響疫苗內(nèi)的抗原。將數(shù)個(gè)PICKCa樣品和一種倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活粗制狂犬病疫苗相組合。實(shí)驗(yàn)?zāi)康目墒褂眉す馍⑸浼夹g(shù)來(lái)達(dá)成。激光散射技術(shù)已廣泛地用以測(cè)定重量平均分子質(zhì)量(Mw)以及回轉(zhuǎn)半徑(Rg)。儀器為商業(yè)上可購(gòu)得且測(cè)量過(guò)程是熟習(xí)于本領(lǐng)域技術(shù)人士所知悉的。表5顯示PICKCa的組合前濃度增加致使狂犬病疫苗的Mw增加。
表5.PICKCa的組合前濃度和狂犬病疫苗的Mw之間的關(guān)系
實(shí)施例7.PIKA毒性測(cè)驗(yàn)這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示PIKA佐劑在限制最高分子量時(shí)的安全性特質(zhì)。
依據(jù)中國(guó)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定(WS1-XG-050-2000)進(jìn)行一個(gè)毒性測(cè)驗(yàn)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，以0.5毫升/小鼠的量，將含0.3毫克具有分子量上限為約525,000至約1,000,000道爾頓的PIKA佐劑的氯化鈉溶液靜脈注射至五只(5)體重約18-22克的小鼠。觀察經(jīng)注射的小鼠7天，并在觀察結(jié)束后稱重。表6概述其結(jié)果，顯示PIKA佐劑的分子量可高達(dá)1.0×106道爾頓，而不具有明顯的毒性。
表6.PIKA佐劑毒性測(cè)驗(yàn)
實(shí)施例8疫苗組成物內(nèi)的PIKA的毒性研究這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的在于確認(rèn)PIKA佐劑的安全性。
將PIKA佐劑(分子量66,000道爾頓至660,000道爾頓)和倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)以PIKAHKC-IPRA為4∶1的比例相組合。
將由PIKA和HKC-IPRA所構(gòu)成的疫苗組成物和一種商業(yè)上可購(gòu)得的滅活純化型狂犬病疫苗(IPRV)作比較，該滅活純化型狂犬病疫苗(IPRV)含有一個(gè)鋁佐劑。
將五劑(5)疫苗組成物在第0天、第3天、第7天、第14天及第28天時(shí)給予小鼠。給予的劑量相當(dāng)于進(jìn)行正常人類狂犬病免疫法的成人劑量的約300倍。
毒性觀察的結(jié)果顯示在下表7表7給予狂犬病疫苗后的安全性觀察
釋義(觀察到的發(fā)生次數(shù))/(總數(shù))
得到結(jié)論是該P(yáng)IKA/HKC-IPRA組合較商業(yè)上可購(gòu)得的IPRV更安全。
實(shí)施例9PIKA佐劑在人體的安全使用在2002年，利用一個(gè)由PIKA組成物(分子量66,000至660,000道爾頓)和倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)所構(gòu)成的組成物來(lái)免疫五位(5)志愿者。將該疫苗組成物在第0天、第3天、第7天、第14天及第30天時(shí)給予志愿者。
任何一位病人在各次接種疫苗后，都沒(méi)有被觀察到局部或系統(tǒng)性副作用。
利用標(biāo)準(zhǔn)NIH效力試驗(yàn)來(lái)測(cè)量疫苗的效力強(qiáng)度，結(jié)果顯示在下表8表8狂犬病疫苗的效力強(qiáng)度觀察
上述結(jié)果指出由PIKA和HKC-IPRA所構(gòu)成的疫苗組成物誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)了保護(hù)性中和抗體的產(chǎn)生。
實(shí)施例10.暴露后試驗(yàn)(細(xì)胞免疫反應(yīng))暴露后試驗(yàn)是疫苗能夠從受感染后的宿主身體根除病原的最明確證明。因此，它是疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的一個(gè)指標(biāo)。
在暴露后檢驗(yàn)中，以狂犬病病毒的一個(gè)野生型品系來(lái)感染小鼠，隨后接種以組合有PIKA佐劑(分子量范圍從1.65×105至1.2×106道爾頓)的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)，或是組合有氫氧化鋁佐劑(鋁佐劑)的HKC-IPRA，一商業(yè)上可購(gòu)得的狂犬病疫苗(PVRV)，或是磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。結(jié)果顯示出PIKA佐劑增進(jìn)了存活率，參見(jiàn)表9。
表9.暴露后攻毒測(cè)驗(yàn)9.1治療后的死亡率
9.2疫苗治療后的存活率
被皮下注射活狂犬病病毒所感染的小鼠在注射后第6小時(shí)、第1天、第2天及第3天以疫苗治療。
實(shí)施例11.抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)伽瑪型干擾素的產(chǎn)生伽瑪型干擾素的產(chǎn)生是細(xì)胞免疫活性的一個(gè)指標(biāo)。
在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，從二位試驗(yàn)組病人及二位對(duì)照組個(gè)體中采得血液樣品。這些志愿病人已被接種以PIKA狂犬病疫苗，該P(yáng)IKA狂犬病疫苗含有PIKA(分子量范圍位在66,000至660,000道爾頓)以及倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)。在收集血液樣品之前2.5年接種疫苗。
第2圖中的結(jié)果顯示出，相較于對(duì)照組個(gè)體，二位試驗(yàn)組病人所產(chǎn)生的伽瑪型干擾素有顯著的差異。
將從血液樣品中分離出來(lái)的PBMCs和原來(lái)免疫中所使用相同的HKC-IPRA共同培育。1天后，以ELISPOT方法，檢測(cè)特異性產(chǎn)生伽瑪型干擾素的細(xì)胞數(shù)量。觀察到一個(gè)劑量相依性效應(yīng)。
上述觀察所得到的結(jié)論是含有本發(fā)明PIKA佐劑的狂犬病疫苗具有特異性引起伽瑪型干擾素產(chǎn)生的能力，且意味著可以誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。(也就是說(shuō)，該反應(yīng)是針對(duì)狂犬病抗原)，而不同于非特異性反應(yīng)。
實(shí)施例12PIKA的有效性試驗(yàn)這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的在于顯示PIKA在誘導(dǎo)伽瑪型干擾素及白介素12(IL-12)的產(chǎn)生上的能力。
在干凈的環(huán)境中，將取自正常健康小鼠分離的脾細(xì)胞樣品在不同濃度PIKA(分子量范圍位在66,000至660,000)的存在下培育。培育三天后，利用IL-12(p40)和伽瑪型干擾素特異性抗體，以ELISA試驗(yàn)來(lái)分析上清液內(nèi)的細(xì)胞因子水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在下表10表10細(xì)胞因子產(chǎn)生的活體外試驗(yàn)
上述實(shí)驗(yàn)所得到結(jié)論是，PIKA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞劑量相依性產(chǎn)生伽瑪型干擾素及IL-12細(xì)胞因子。。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，四只(4)小鼠經(jīng)由腹腔注射被給予500ug/小鼠的PIKA(分子量范圍位在66,000至660,000)。使用磷酸鹽緩沖液作為負(fù)對(duì)照組試驗(yàn)。注射后5小時(shí)，取出血液樣品并制備血清。利用IL-12(p40)和伽瑪型干擾素特異性抗體，以ELISA試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)血清里的細(xì)胞因子水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在下表11
表11細(xì)胞因子產(chǎn)生的活體內(nèi)試驗(yàn)
上述實(shí)驗(yàn)所得到結(jié)論是PIKA提示促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞功能，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫功能。
實(shí)施例13PIKA和滅活純化型Vero細(xì)胞狂犬病抗原的共同使用這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的在于評(píng)估組合有滅活純化型Vero細(xì)胞狂犬病疫苗(PVRV)的PIKA的有效性。
將具有66,000至660,000道爾頓的分子量范圍的PIKA和PVRV相組合，以形成一種狂犬病疫苗。使用NIH效力試驗(yàn)來(lái)評(píng)估所得疫苗組成物的效力強(qiáng)度。結(jié)果顯示在下表12表12對(duì)于PIKA及滅活純化型Vero細(xì)胞狂犬病疫苗的NIH試驗(yàn)結(jié)果
得到的結(jié)論是PIKA會(huì)促進(jìn)滅活純化型Vero細(xì)胞狂犬病疫苗的效力強(qiáng)度。
實(shí)施例14.抗原劑量這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示需要具有最低量的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)和PIKA佐劑(分子量范圍從66,000至660,000道爾頓)共同存在于組成物中，以引起具有實(shí)質(zhì)增進(jìn)水平的特異性免疫反應(yīng)。
將遞增量的狂犬病抗原加入定量0.1mg的PIKA佐劑。用NIH標(biāo)準(zhǔn)狂犬病疫苗效力試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其效力強(qiáng)度。在可預(yù)測(cè)到的原始效力強(qiáng)度增加之后，以及在如預(yù)期般達(dá)到效力強(qiáng)度穩(wěn)定之前，隨著抗原量的增加觀察到一個(gè)明顯且戲劇性的效力強(qiáng)度增加(參見(jiàn)表13)。
表13增量的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原的疫苗效力強(qiáng)度
在HKC-IPRA抗原達(dá)到一IU后，觀察到增加少量的HKC-IPRA，PIKA誘導(dǎo)疫苗效力強(qiáng)度明顯增加。
得到的結(jié)論是在顯著免疫反應(yīng)被誘導(dǎo)之前必須存在最低的抗原量。過(guò)度的抗原量到某一點(diǎn)后，抗原量增加僅會(huì)回饋以些微增加的效力強(qiáng)度。
實(shí)施例15.抗原佐劑的比例這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示出倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)和PIKA佐劑(分子量范圍位在66,000至660,000)的最佳混合量。
利用不同劑量抗原和不同劑量佐劑相混合，加入PBS以確保總體積的恒定。利用NIH效力試驗(yàn)來(lái)測(cè)定所得疫苗的效力強(qiáng)度。結(jié)果顯示在表14。
試驗(yàn)結(jié)果的綜合考量指出，最佳的疫苗組合是PIKA對(duì)于抗原的比例落在至少3比1的范圍內(nèi)。
表14各種抗原和佐劑比例下的狂犬病疫苗效力強(qiáng)度
實(shí)施例16.PIKA以及組合有狂犬病疫苗的PIKA的冷凍干燥保存這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示PIKA在冷凍干燥形式下是穩(wěn)定的。
冷凍干燥技術(shù)已被使用在長(zhǎng)期保存狂犬病疫苗，可達(dá)三年以上。本案發(fā)明人想要試驗(yàn)PIKA(分子量范圍從66,000至660,000)以及含有PIKA的狂犬病疫苗在冷凍干燥保存是否有利。下列組成物被使用在冷凍干燥保存試驗(yàn)中i)未被冷凍的PIKA，加入經(jīng)復(fù)原的冷凍干燥型倉(cāng)鼠腎細(xì)胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)中，ii)經(jīng)復(fù)原PIKA加HKC-IPRA的冷凍型干燥組成物，iii)經(jīng)復(fù)原的冷凍干燥型市售狂犬病疫苗(未加入PIKA)，以及iv)未被冷凍的狂犬病疫苗標(biāo)準(zhǔn)品。表15顯示出，經(jīng)冷凍干燥的PIKA以及含有PIKA的狂犬病疫苗對(duì)于長(zhǎng)期保存狂犬病疫苗是理想的。
表15.冷凍干燥保存對(duì)于狂犬病疫苗效力強(qiáng)度的影響
雖然本發(fā)明是參照特定實(shí)施例而被描述，但應(yīng)明了這些實(shí)施例是作例示性說(shuō)明用，本發(fā)明的范圍不僅限于此。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域：
中具有一般知識(shí)的人士來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的選擇的具體示例是很明顯的。這些選擇的實(shí)施例落在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的權(quán)利范圍是由所附申請(qǐng)專利范圍來(lái)載述，且能為前述揭示內(nèi)容所支持。
權(quán)利要求
1.一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素以及陽(yáng)離子，其中該組合物含有在分子量或大小中呈異質(zhì)的聚核苷酸佐劑組合物分子，其中該分子量介于約66,000至1,200,000道爾頓的分子量范圍內(nèi)，且該大小介于約6.4S至24.0S的分子大小范圍內(nèi)。
2.如權(quán)利要求
1所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的分子量范圍是從約300,000至1,200,000道爾頓，或該分子大小范圍是從約12.8S至24.0S。
3.如權(quán)利要求
1所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的分子量范圍是從約66,000至660,000道爾頓，或該分子大小范圍是從約6.4S至18.3S。
4.如權(quán)利要求
1所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的分子量范圍是從約300,000至660,000道爾頓，或該分子大小范圍是從約12.8S至18.3S。
5.一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素以及陽(yáng)離子，其中該聚核苷酸佐劑組合物具有等于或高于150,000道爾頓的平均分子量，或是具有等于或高于9.3S的平均分子大小。
6.如權(quán)利要求
5所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的平均分子量等于或高于250,000道爾頓，或是該平均分子大小等于或高于11.8S。
7.如權(quán)利要求
5所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的平均分子量等于或高于350,000道爾頓，或是該平均分子大小等于或高于15.3S。
8.如權(quán)利要求
1至7項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的佐劑組合物，其中該抗生素是卡那霉素、新霉素、蒽環(huán)霉素、硫酸丁酰苷菌素、慶大霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、雙去氧卡那霉素、暗霉素、美它酰胺(metrzamide)、嘌呤霉素、鏈霉素或鏈脲霉素。
9.如權(quán)利要求
1至8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的佐劑組合物，其中該陽(yáng)離子是鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅；且其中該陽(yáng)離子呈無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)復(fù)合物的形式。
10.如權(quán)利要求
1至9項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的佐劑組合物，其中該陽(yáng)離子來(lái)源是氯化鈣、碳酸鈣、氟化鈣、氫氧化鈣、磷酸鈣或硫酸鈣。
11.如權(quán)利要求
1至7項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的佐劑組合物，其中該抗生素是卡那霉素硫酸鹽，且該陽(yáng)離子是由氯化鈣所提供。
12.一種組合套裝中，包含如權(quán)利要求
1至11項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的佐劑組合物以及抗原物。
13.一種免疫原組合物，包含如權(quán)利要求
1至12項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的聚核苷酸佐劑組合物以及抗原。
14.如權(quán)利要求
13所述的免疫原組合物，其中該抗原是人類抗原、非人類動(dòng)物抗原、植物抗原、細(xì)菌抗原、真菌抗原、病毒抗原、寄生蟲(chóng)抗原或是癌腫抗原。
15.如權(quán)利要求
14所述的免疫原組合物，其中該抗原是狂犬病抗原。
16.如權(quán)利要求
15所述的免疫原組合物，其中該抗原是滅活純化型狂犬病抗原。
17.如權(quán)利要求
16所述的免疫原組合物，其中存在的該倉(cāng)鼠腎細(xì)胞的滅活純化型狂犬病抗原大于1個(gè)國(guó)際單位。
18.如權(quán)利要求
16任一項(xiàng)所述的免疫原組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物與倉(cāng)鼠腎細(xì)胞的滅活純化型狂犬病抗原的比例大于3比1。
19.如權(quán)利要求
1至18任一項(xiàng)所述的免疫原組合物，其中該免疫原組合物包括能夠同時(shí)引發(fā)增強(qiáng)的特異體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的佐劑。
20.如權(quán)利要求
1至19任一項(xiàng)所述的佐劑組合物或免疫原組合物，其中該免疫原組合物或該免疫原組合物中包含的該佐劑組合物是呈固體形式或液體形式或存在于溶液或懸浮液中。
21.如權(quán)利要求
1至20任一項(xiàng)所述的佐劑組合物或免疫原組合物，其中該佐劑組合物和/或該免疫原組合物被冷凍干燥。
22.一種用以增強(qiáng)對(duì)抗原物的免疫響應(yīng)的的方法，該方法包含將如權(quán)利要求
1至21項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的組合物給藥于宿主。
23.如權(quán)利要求
22所述的方法，其中該免疫原組合物可以通過(guò)選自包括下列途徑的群組中的一個(gè)途徑給藥，該途徑包括胃腸道外注射給藥、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、經(jīng)呼吸道吸入、直腸給藥、陰道給藥、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)口給藥、經(jīng)眼給藥、局部給藥、透皮或皮內(nèi)給藥。
24.如權(quán)利要求
1至23任一項(xiàng)所述的聚核苷酸佐劑組合物在制備用于增強(qiáng)宿主的免疫響應(yīng)的藥物中的用途。
25.如權(quán)利要求
1至24任一項(xiàng)所述的方法，其中該宿主是人類。
26.如權(quán)利要求
1至25任一項(xiàng)所述的方法，其中該宿主是動(dòng)物。
專利摘要
本發(fā)明提供一種聚核苷酸佐劑組合物以及引發(fā)免疫反應(yīng)的使用方法。本發(fā)明亦提供一種免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物和抗原(例如此二種成份位于一疫苗內(nèi))。本發(fā)明的佐劑組合物具有特定的物理性質(zhì)(例如分子量、濃度和pH)，這些性質(zhì)能符合所需的一種誘導(dǎo)增強(qiáng)免疫反應(yīng)和改變免疫反應(yīng)類型的有效且安全的佐劑。本發(fā)明更思及這些佐劑組合物的使用方法，特別是誘導(dǎo)對(duì)于抗原復(fù)合物的免疫反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K39/39GK1997391SQ20058001509
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年6月8日
發(fā)明者林海祥 申請(qǐng)人:申益皮卡生物技術(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan