一種高靈敏度菊花b病毒的檢測引物、方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)的病毒檢測領(lǐng)域，涉及一種高靈敏度檢測菊花B病毒的引 物、利用該特異引物提高菊花B病毒檢測靈敏度的方法及引物對的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 菊花（Chrysanthemum morifolium)為菊科菊屬多年生宿根草本植物，是我國十大 傳統(tǒng)名花，也是世界上的四大切花之一。是世界上最早栽培的觀賞植物之一，具有很高的經(jīng) 濟(jì)和觀賞價值。菊花通常采用無性繁殖方式，因此在種植過程中極易感染病毒，出現(xiàn)花葉、 斑駁、畸形、矮化等癥狀，導(dǎo)致菊花種性退化，產(chǎn)量和質(zhì)量下降，嚴(yán)重影響種植者效益。菊花B 病毒（Chrysanthemum virus B，CVB)，隸屬于廣香石竹潛隱花葉病毒屬，是正義單鏈的RNA 病毒，其基因組具有6個0RF，編碼6個蛋白，全長約8-9Kb，3'端具有一個Poly-(A)結(jié)構(gòu)。 其病毒粒子為略微彎曲的線狀，大小為685 X 12nm。菊花B病毒主要通過汁液和幾種嫁蟲以 非持久性方式傳播，侵染菊科植物，是危害菊花最嚴(yán)重的病毒之一，廣泛分布于世界栽培菊 花的國家和地區(qū)。菊花感染CVB后，有的葉片出現(xiàn)輕度斑駁，有的葉脈透明，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重 的葉斑癥狀和花朵畸形癥狀，大大降低了菊花產(chǎn)品的合格率，對菊花產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，因 此對病毒的防控是各大菊花企業(yè)尤為關(guān)心的難題，而準(zhǔn)確可靠的菊花病毒檢測方法是成功 防控病毒病毒前提。
[0003] 目前廣泛采用的是聚合酶鏈?zhǔn)剑≒CR)檢測方法來檢測病毒，但在檢測的靈敏度上 還沒有達(dá)到很高的效果。吳紅芝（2002)發(fā)表的《RT-PCR檢測菊花B病毒的研究》中檢測 CVB的靈敏度達(dá)到了 10、黃叢林（2008)申請的中國專利《一種用于檢測菊花B病毒的方 法》（CN200810240415)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)（LAMP)檢測菊花B病毒，其靈敏度只達(dá)到了 1〇_ 3,且采用LAMP進(jìn)行檢測容易受到污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對引物設(shè)計的要求非常高；顏 琢娜（2009)發(fā)表的《兩重RT-PCR同步檢測菊花B病毒和番茄不孕病毒》中檢測菊花B病 毒的靈敏度也只達(dá)到了 1(T3;尤燕平（2011)申請的中國專利《一種菊花CVB和CChmvd病毒 的二重RT-PCR檢測方法》(201110203309. 7)中檢測菊花B病毒，其靈敏度也只達(dá)到了 10_3。 這些都不能滿足菊花B病毒在感染早期，濃度較低時的有效檢測，不能及時用于田間早期 的菊花病毒病防控，因而在生產(chǎn)實(shí)踐中防控意義有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種菊花B病毒快速檢測引物及用該引物進(jìn)行檢測的方法，以解決現(xiàn) 有技術(shù)中菊花B病毒的檢測靈敏度不高，易出現(xiàn)假陽性等問題，達(dá)到菊花B病毒早期檢測防 控的目的。
[0005] 1、本發(fā)明提供一種高靈敏度菊花B病毒的檢測引物，該引物為CVBi-F，CVBi-R; cvb2-f,cvb2-r；
[0006] 其中，CVBrF 序列為：AGTCACAATGCCTCCCAAAC,
[0007] CVBrR 序列為：CATACCTTTCTTAGAGTGCTATGCT ;
[0008] CVB2-F 序列為：TCTGAAGGTGAGCCAAGCG，
[0009] CVB2-R 序列為：CATATCCTCGGAAGTAGCCATG ;
[0010] 2、本發(fā)明還提供一種高靈敏度菊花B病毒的檢測方法，該方法包括如下步驟：
[0011] (1)設(shè)計針對菊花B病毒的兩輪特異性引物：
[0012] CVBrF 序列為：AGTCACAATGCCTCCCAAAC，
[0013] CVBrR 序列為：CATACCTTTCTTAGAGTGCTATGCT ;
[0014] CVB2-F 序列為：TCTGAAGGTGAGCCAAGCG，
[0015] CVB2-R 序列為：CATATCCTCGGAAGTAGCCATG ;
[0016] (2)以CVB「R為引物，對待檢測菊花DNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，并以步驟⑴所 述兩輪特異性引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增RT-PCR ;
[0017] (3)將步驟⑵進(jìn)行的第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，當(dāng)獲得381bp特 異性片段時，表示待檢測菊花感染菊花B病毒即CVB。
[0018] 3、上述2提供的高靈敏度菊花B病毒檢測方法，步驟（2)的RT-PCR反應(yīng)體系，其 中，第一輪PCR25iil體系為：
[0019]
[0020]
【主權(quán)項】
1. 一種高靈敏度菊花B病毒的檢測引物，其特征在于：該引物為CVB1-F, CVB1-R; CVB2-F, CVB2-R ； 其中，CVB1-F 序列為：AGTCACAATGCCTCCCAAAC， CVB1-R 序列為：CATACCTTTCTTAGAGTGCTATGCT ; CVB2-F 序列為：TCTGAAGGTGAGCCAAGCG， CVB2-R 序列為：CATATCCTCGGAAGTAGCCATG。
2. -種高靈敏度菊花B病毒檢測方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 設(shè)計針對菊花B病毒的兩輪特異性引物： CVB1-F 序列為：AGTCACAATGCCTCCCAAAC， CVB1-R 序列為：CATACCTTTCTTAGAGTGCTATGCT ; CVB2-F 序列為：TCTGAAGGTGAGCCAAGCG， CVB2-R 序列為：CATATCCTCGGAAGTAGCCATG ; (2) 以CVB1-R為引物對待檢測菊花DNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，并以步驟（1)所述兩 輪特異性引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增； (3) 將步驟（2)進(jìn)行的第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，當(dāng)獲得381bp特異性 片段時，表示待檢測菊花感染菊花B病毒即CVB。
3. 權(quán)利要求2所述的高靈敏度菊花B病毒檢測方法，其特征在于：步驟（2)的RT-PCR 反應(yīng)體系，其中，第一輪PCR25y 1體系為：
0· 2 μ ITaq 酶； 17. 5 μ IddH2O0 以第一輪產(chǎn)物為第二輪反應(yīng)物，第二輪PCR25 μ 1體系為：
0· 2 μ ITaq 酶； 17. 5 μ IddH2O0
4. 權(quán)利要求2所述的高靈敏度菊花B病毒檢測方法，其特征在于，步驟（2)所述RT-PCR 反應(yīng)程序設(shè)定為： 第一輪94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸40s，循環(huán)35次，72°C 延伸7min ; 第二輪94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，56°C退火45s，72°C延伸40s，循環(huán)35次，72°C 延伸7min。
5. 權(quán)利要求2-4任一項所述的高靈敏度菊花B病毒檢測方法，其特征在于：以 1 μ IcDNA模板加入25 μ 1反應(yīng)體系計量，需要cDNA模板稀釋度彡10_9,即靈敏度彡KT9Ug/ ul。
6. -種檢測菊花B病毒的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物， CVB1-F, CVB1-R ；CVB2-F, CVB2-R0
7. 權(quán)利要求1所述的引物在檢測菊花B病毒上的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)病毒檢測領(lǐng)域，提供一種高靈敏度檢測菊花B病毒的引物、利用該特異引物檢測菊花B病毒的方法及引物的應(yīng)用。其中，本方法步驟如下：1)設(shè)計針對菊花B病毒的兩輪特異性引物；2)以CVB1-R為引物，對待檢測菊花DNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以步驟1)所述兩輪特異性引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增；3)將步驟2)進(jìn)行的第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，當(dāng)獲得381bp特異性片段時，表示待檢測菊花感染菊花B病毒。本發(fā)明由于加入了特異的反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行巢式PCR，極大地提高了菊花B病毒檢測靈敏度，經(jīng)過驗證靈敏度達(dá)到10-9ug/ul。本發(fā)明提供的方法，菊花CVB檢測特異性強(qiáng)，工序簡單，成本低廉。
【IPC分類】C12N15-11, C12R1-94, C12Q1-68, C12Q1-70
【公開號】CN104673938
【申請?zhí)枴緾N201510100532
【發(fā)明人】管志勇, 吳丹, 宋愛萍, 蔣甲福, 陳發(fā)棣, 王海濱, 張飛, 陳素梅, 房偉民, 趙爽
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月6日