一株假單胞菌及其在降解石油類污染物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物在環(huán)境污染物降解中的應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一株假單胞菌及其 在降解石油類污染物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 石油類污染物是油田開發(fā)和石油加工過程中產(chǎn)生的最重要的污染物。石油類污染 物的危害主要表現(xiàn)在對(duì)人類、動(dòng)物、土壤和天然水體的危害和影響。石油類污染物已列入我 國(guó)危險(xiǎn)廢物名錄，在列入的48種危險(xiǎn)廢物中，石油類排第8位。
[0003] 井噴、油罐泄漏、油輪泄漏、油田設(shè)備檢修、石化生產(chǎn)、運(yùn)輸事故等，都會(huì)溢出和排 放石油烴類。其中，含硫雜環(huán)芳烴是高硫原油的重要組成，70%以上的含硫化合物是二苯并 噻吩（DBT)和其衍生物，它屬于污染面廣、毒性更大的一類難降解有機(jī)物，具有強(qiáng)致癌、致 畸和致突變效應(yīng)。石油、石化產(chǎn)品以及煉焦生產(chǎn)在生產(chǎn)、運(yùn)輸以及使用過程中會(huì)造成土壤和 地下水的污染，并產(chǎn)生大量的廢水，含硫雜環(huán)芳烴作為主要的污染物之一的降解對(duì)于土壤 生物修復(fù)以及石化污水、煉焦廢水的處理具有重要意義，此外這些污染中還含有烷烴和多 環(huán)芳烴等污染物。
[0004] 生物治理是指微生物利用污染物作為碳源或其他營(yíng)養(yǎng)源如氮源、硫源等，將其分 解利用轉(zhuǎn)化為二氧化碳、水以及無機(jī)礦物質(zhì)等。生物治理/處理因?yàn)槌杀镜?、操作?jiǎn)單、條 件溫和以及無二次污染等優(yōu)勢(shì)，在土壤生物修復(fù)以及石化污水、煉焦廢水的處理過程中具 有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，篩選、獲得對(duì)含硫雜環(huán)芳烴具有快速降解能力，以及對(duì)烷烴、多環(huán)芳烴等污 染物具有降解作用的高效微生物菌株，可以將其投加于待修復(fù)的土壤以及污水處理中，來 大幅提高生物降解的效果，這對(duì)保護(hù)生態(tài)具有重要意義。
[0005] -般來說生物降解菌要求具有對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求低、生長(zhǎng)速度快、降解速度快、可耐 受或可降解多種污染物的優(yōu)勢(shì)。
[0006] 二苯并噻吩作為含硫雜環(huán)芳烴的模式物，微生物對(duì)二苯并噻吩的代謝途徑主要分 為"4S"途徑（產(chǎn)物為2-羥基聯(lián)苯）和"Kodama"途徑（產(chǎn)物為3-羥基-2-甲?；讲⑧?吩），不能完全礦化生成二氧化碳和水，生物修復(fù)價(jià)值較低。此外，實(shí)際污染情況下往往有多 種底物同時(shí)存在，因而能夠利用和降解多種底物的降解菌將在生物修復(fù)過程中占有重要地 位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一株假單胞菌及其在降解石油類污染物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0009] 本發(fā)明從中國(guó)勝利油田石油污染土壤中篩選出一株假單胞菌（Pseudomonas sp. LKY-5)，于2015年7月13日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國(guó)武漢武漢大 學(xué)），保藏號(hào)是CCTCC NO :M 2015448。它能夠?qū)⒍讲⑧绶越到馍舌彵蕉?，進(jìn)入三羧酸 循環(huán)，生成〇)2和H 20,該代謝途徑相較已有的"4S"途徑和"Kodama"途徑有進(jìn)一步的延伸， 可以7天完全降解lOOmg/L的二苯并噻吩。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開該假單胞菌在降解石油類污染物中的應(yīng)用。
[0011] 石油類污染物主要包括烷烴（正十六烷）、多環(huán)芳烴（菲、芘）、含硫雜環(huán)芳烴（二 苯并噻吩）、含氮雜環(huán)芳烴（咔唑）等，其中，含硫雜環(huán)芳烴是污染物中最為頑固，且極難降 解的一類物質(zhì)。
[0012] 1)菌株的篩選及分離純化
[0013] 取Ig新鮮土樣加入到篩選培養(yǎng)基中，在溫度為30°C、轉(zhuǎn)速為160rpm的搖床中振蕩 培養(yǎng)一周后，接種5%的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新鮮的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，相同條件下連續(xù)轉(zhuǎn)接5~ 7次。然后取培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于二苯并噻吩-無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3天后， 挑取產(chǎn)生降解圈的菌落，在LB平板上劃線分離純化，直至得到純的單菌落。將菌株經(jīng)培養(yǎng) 后，再單獨(dú)接種到DBT-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，選擇降解效果最好的菌株作為研究 對(duì)象。
[0014] 其中：
[0015] 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HP040 . 6g，ΚΗ2Ρ040· 2g，NaN034. 0g，CaCl2O. Olg，F(xiàn)eSO4O. Olg， MgSO4O. 3g，酵母粉(λ 5g，蒸餾水lOOOmL，調(diào)節(jié)pH至L 2~L 5。（CaCljP MgSO 4單獨(dú)高溫 滅菌，F(xiàn)eSO4過濾除菌）
[0016] 篩選培養(yǎng)基：在無機(jī)鹽培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加40mg/L的二苯并噻吩的丙酮溶液。
[0017] LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，蒸餾水lOOOmL，pH 7. 2~L 5。
[0018] DBT-無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入20g/L的瓊脂，將DBT的丙酮溶 液涂布于固體培養(yǎng)基上。
[0019] 2)菌株的分子生物學(xué)鑒定：
[0020] 將分離的菌株提取總DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
[0021] 正向引物 27F :5,-agagtttgatcctggctcag-3,，SEQ ID NO. 1
[0022] 反向引物 1492R :5, -ggttaccttgttacgactt-3,，SEQ ID NO. 2
[0023] PCR 條件：94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，30 個(gè) 循環(huán)，最后72°C延伸10min。擴(kuò)增之后的產(chǎn)物送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。該菌株的 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0024] 將LKY-5的測(cè)序結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)LKY-5和Pseudomonas sp.BC041(HQ105010)同源性為 99%，命名為 Pseudomonas sp.LKY-5。
[0025] Pseudomonas sp. LKY-5的掃描電鏡分析見圖1。從圖1中可以看出，LKY-5菌株 以桿菌形態(tài)存在，長(zhǎng)度約為1. 5 μ m，寬度約為0. 42 μ m。
[0026] 二苯并噻吩作為含硫雜環(huán)芳烴的模式物，經(jīng)過分析可知，本發(fā)明篩選的LKY-5對(duì) 二苯并噻吩（DBT)的降解主要有以下兩條代謝途徑。
[0027] -條代謝途徑為：DBT首先在加氧酶的作用下生成DBT砜，然后打開噻吩環(huán)上的 C-S鍵生成2'-羥基聯(lián)苯基-2-亞磺酸鹽，然后脫掉磺酸基生成2-羥基聯(lián)苯，然后再脫掉羥 基生成聯(lián)苯，聯(lián)苯發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，生成2-羥基-6-酮基-6-苯基-2, 4己二烯，隨后水解生 成苯甲醛，然后氧化生成苯甲酸，苯甲酸在雙加氧酶的作用下生成鄰苯二酚（兒茶酚），或 者苯甲醛在單加氧酶作用下生成2-羥基苯甲醛，隨后氧化生成2-羥基苯甲酸（水楊酸）， 然后再生成鄰苯二酚，最后生成2-羥基己二烯半醛酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，生成0)2和H 20。
[0028] 另一條代謝途徑為：DBT斷裂一個(gè)苯環(huán)生成3-羥基-2-甲?；讲⑧绶?，然后脫 掉羧基生成3-羥基苯并噻吩，或脫掉羥基生成苯并噻吩-2-羧酸，然后生成2, 3-苯并噻吩 二酮，斷裂噻吩環(huán)生成硫代水楊酸，隨后生成苯甲酸，最后生成鄰苯二酚進(jìn)入三羧酸循環(huán)， 生成0)2和H 20?；蛘邇蓚€(gè)2, 3-苯并噻吩二酮生成硫靛，然后生成2-巰苯基乙醛酸，再生 成苯乙酸。
[0030] 本發(fā)明的有益效果是：
[0031] 1)本發(fā)明篩選得到的Pseudomonas sp. LKY-5能夠?qū)⒍讲⑧绶越到馍舌彵蕉?酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，生成〇)2和H 20,該代謝途徑相較已有的"4S"途徑和"Kodama"途徑有 進(jìn)一步的延伸，具有較高的生物修復(fù)價(jià)值。
[0032] 2)本發(fā)明篩選得到的Pseudomonas sp. LKY-5能有效降解含硫雜環(huán)芳經(jīng)如二苯并 噻吩、苯并噻吩、烷基二苯并噻吩、4, 6-二甲基二苯并噻吩、2, 4, 6-三甲基二苯并噻吩等； 同時(shí)，還可以降解原油中其他的污染物如正十六烷、菲、芘、咔唑等多種污染物。
【附圖說明】
[0033] 附圖1為本發(fā)明的假單胞菌菌株P(guān)seudomonas sp. LKY-5的掃描電鏡圖；
[0034] 附圖2為本發(fā)明具體實(shí)施例3中Pseudomonas sp. LKY-5對(duì)石油類污染物的降解 情況。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】如下：
[0036] 實(shí)施例1 :二苯并噻吩降解
[0037] 將Pseudomonas sp. LKY-5菌株接種至IOOmL含有100mg/L二苯并噻吩的無機(jī)鹽 培養(yǎng)基中。30°C，pH 7.5，接種量1(^%，160印111搖床培養(yǎng)7天，用61的!1(：1酸化至？!1彡2 后，加入等體積的乙酸乙酯萃取，于4°C，5000rpm離心10min，取上清液用Bruker 450氣相 色譜儀（FID，HP5毛細(xì)管柱）測(cè)定，二苯并噻吩降解率達(dá)100%。
[0038] 實(shí)施例2 :
[0039] 將Pseudomonas sp. LKY-5菌株分別接種至含有100mg/L的菲、花、味挫、正十六 烷的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30°C，pH 7. 5,接種量IOwt %，160rpm搖床培養(yǎng)7天，正十六烷采用 Bruker450氣相色譜儀測(cè)定。菲、花和味唑采用高效液相色譜Waters 2695測(cè)定，使用紫外 檢測(cè)器，Waters sunf ire C18反相色譜柱（柱長(zhǎng)150mm，內(nèi)徑4. 6mm，填料5 μ m)，柱子恒溫 25°C，于254nm檢測(cè)物質(zhì)的吸收峰，流動(dòng)相A為含0. 5%三氟乙酸的水，流動(dòng)相B為含0. 5% 三氟乙酸的乙腈。采用梯度洗脫，見表1。
[0040] 表1梯度洗脫程序
[0042] 結(jié)果如圖2所示，Pseudomonas sp. LKY-5對(duì)正十六烷、菲、芘和咔唑均有降解效 果，降解能力順序?yàn)檎?gt;菲>咔唑>芘。
[0043] 實(shí)施例3 :
[0044] 分別添加2mL市售0號(hào)柴油（密度為0. 841g/mL)、2mL青島煉化催化裂化柴油（密 度為0· 9468g/mL)于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基終體積為30mL) ,Pseudomonas sp. LKY-5菌 株的接種量為l〇wt%，不接種的作為空白對(duì)照。30°C，160rpm，培養(yǎng)時(shí)間7天后，將空白對(duì) 照和降解后的含油培養(yǎng)基用石油醚（30~60°C )進(jìn)行振蕩萃取，合并萃取液，于5000rpm、 4°C下離心10min，經(jīng)無水硫酸鈉脫水后，在30°C下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至石油醚完全揮發(fā)后，移 至色譜瓶中，采用美國(guó)Varian 3800氣相色譜儀進(jìn)行分析。檢測(cè)器為脈沖式火焰光度檢測(cè) 器（PFPD)，HP-5NS石英毛細(xì)管柱（30mX0. 32mmX0. 25 μ m)，進(jìn)樣量1 μ L，分流比30:1，進(jìn) 樣口溫度300°C，柱溫80°C保持2min，然后6°C /min升至280°C，載氣He，流速lmL/min。柴 油中總含硫量測(cè)定采用Multi EA 3100S/N微量分析儀。結(jié)果如表2所示。
[0045] 表2柴油中不同類型硫化物的降解
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株假單胞菌（sp.LKY-5)，它的保藏號(hào)是CCTCCNO:M2015448。2. 如權(quán)利要求1所述的假單胞菌，其特征在于，它的16SrDNA序列如SEQIDNO. 3所 不。3. -種如權(quán)利要求1所述的假單胞菌在降解石油類污染物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的石油類污染物為含硫雜環(huán)芳烴。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述含硫雜環(huán)芳烴為二苯并噻吩。6. 如權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述的假單胞菌 sp.LKY-5菌株接種到石油類污染物中進(jìn)行降解。
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物在環(huán)境污染物降解中的應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一株假單胞菌及其在降解石油類污染物中的應(yīng)用，本發(fā)明從中國(guó)勝利油田石油污染土壤中篩選出一株假單胞菌（<i>Pseudomonas</i>？sp.？LKY-5），它的保藏號(hào)是CCTCC？NO：M？2015448。本發(fā)明篩選得到的<i>Pseudomonas？</i>sp<i>.</i>？LKY-5能有效降解含硫雜環(huán)芳烴如二苯并噻吩、苯并噻吩、烷基二苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、2,4,6-三甲基二苯并噻吩等；同時(shí)，還可以降解原油中其他的污染物如正十六烷、菲、芘、咔唑等多種污染物。CCTCC NO:M 201544820150713
【IPC分類】C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12R1/38, C02F101/30
【公開號(hào)】CN105176888
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】趙朝成, 李琳, 劉芳, 劉其友, 張?jiān)撇? 劉春爽, 陳水泉
【申請(qǐng)人】中國(guó)石油大學(xué)(華東)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月22日