一種高效制備海參抗氧化活性肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體的說(shuō)是一種高效制備海參抗氧化活性肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 海參是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴海洋珍品，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，含有多種有益于人類(lèi)身體健康 的生物活性物質(zhì)，是一種高蛋白的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，素有"海中人參"之稱，是"海八珍"之一。海 參體內(nèi)含有的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、防治腫瘤等多種功效。近 年來(lái)，隨著我國(guó)海參養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，我國(guó)海參市場(chǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大，海參資源非常豐富。
[0003] 生物活性肽是指一類(lèi)由25個(gè)及以下天然氨基酸，以不同組成和排列方式構(gòu)成的 從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類(lèi)的總稱。它具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能， 例如易消化吸收，有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、降血 壓、降血脂等作用。目前，生物活性肽主要有以下3種來(lái)源：天然提取法、合成法和蛋白質(zhì)降 解法。天然提取法易受到原料的限制很難大規(guī)模制備；合成法副反應(yīng)較多、成本較高、篩選 復(fù)制，并且可能殘留一部分毒性物質(zhì)，存在一定的食品安全隱患；蛋白質(zhì)降解法是利用某些 水解方法將大分子的蛋白質(zhì)肽鏈打斷，生成較短鏈小分子肽的方法，包括化學(xué)水解法、酶水 解法和微生物發(fā)酵法。但是，化學(xué)水解法反應(yīng)較為劇烈，需要強(qiáng)酸性或者強(qiáng)堿性，高溫環(huán)境， 對(duì)設(shè)備的要求高，并且水解的程度不容易控制，氨基酸結(jié)構(gòu)也容易被破壞，再加上選擇性較 差，產(chǎn)物分子量分布不均，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差；微生物發(fā)酵法的產(chǎn)物較為復(fù)雜，生物活性 肽中可能會(huì)摻入大量微生物及其代謝產(chǎn)物，難以除去；而酶水解法反應(yīng)條件溫和，而且具有 酶解產(chǎn)物含鹽量低，無(wú)氨基酸破壞和消旋，無(wú)毒副產(chǎn)物，原料的有效成分保存完全，對(duì)環(huán)境 無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)非常適用于生物活性肽的大規(guī)模生產(chǎn)制備。通?？蓱?yīng)用于生物活性肽制備的 蛋白酶有多種，主要包括：中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶 等。但是，同一蛋白酶對(duì)不同的酶解原材料的酶解效果、酶解產(chǎn)物及其生物活性是有很大差 異；即使是同一種酶解原材料，采用不同的蛋白酶或酶解條件進(jìn)行酶解，所得到酶解效果、 酶解產(chǎn)物及其生物活性也有很大不同。所以，以海參為原材料，通過(guò)酶解方法制備生物活性 肽過(guò)程中，并非任何一種蛋白酶都可高效制備高生物活性肽。這些蛋白酶中，一般只會(huì)有一 種蛋白酶最適合高效制備高生物活性肽。本發(fā)明是通過(guò)優(yōu)化多種蛋白酶及酶解條件，最終 獲得的一種高效制備抗氧化活性肽的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種高效制備海參抗氧化活性肽的方法。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種高效制備海參抗氧化活性肽的方法，以新鮮海參體壁或內(nèi)臟為原料，將其破 碎勻漿并用磷酸緩沖液稀釋，而后用復(fù)合蛋白酶（Protamex)于55-65Γ下酶解，酶解液離 心上清液即為海參抗氧化活性肽。
[0007] 進(jìn)一步的說(shuō)，以新鮮海參體壁或內(nèi)臟為原料，將其破碎勻漿并用磷酸緩沖液稀釋， 而后在pH6. 0-7. 0,用復(fù)合蛋白酶（Protamex)于55-65°C下進(jìn)行酶解，酶解液離心上清液即 為具有較強(qiáng)抗氧化活性的海參多肽。
[0008] 所述破碎勻漿用磷酸緩沖液稀釋，使其料液比（w/v)在15% -20%。
[0009] 所述復(fù)合蛋白酶加入量為3000-5000U/g，酶解2-4h。
[0010] 所述酶解液于8000-12000rpm下離心l〇-15min,然后將離心上清液進(jìn)行冷凍干 燥，所得固體即為海參體壁或海參內(nèi)臟抗氧化活性肽。將制備得到的海參抗氧化活性肽進(jìn) 行羥自由基清除活性以及還原力等抗氧化活性測(cè)定；
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0012] 1、本發(fā)明是一種簡(jiǎn)單、快速、高效制備海參抗氧化活性肽的方法，適合工業(yè)化生 產(chǎn)。
[0013] 2、本發(fā)明獲得的海參活性肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性特點(diǎn)，與傳統(tǒng)抗氧化劑Vc與 BHT相比，其羥自由基清除能力及還原能力更強(qiáng)，具有非常好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1幾種常見(jiàn)蛋白酶酶解制備海參多肽比較圖；
[0015] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的海參抗氧化活性肽與抗氧化劑Vc對(duì)羥自由基清除能 力比較圖；
[0016] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的海參抗氧化活性肽與抗氧化劑BHT的總還原能力比較 圖。 具體實(shí)施例
[0017] 實(shí)施例1 :
[0018] 取Ig海參內(nèi)臟勻漿液，分別加 2000U的中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木 瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，然后加入IOmL各自蛋白酶合適pH的緩沖液，并于各自蛋白酶的合 適條件下反應(yīng)4小時(shí)（表1)。
[0019] 表1實(shí)驗(yàn)條件
[0021] 然后，取5. OmL混勻后的酶解液，向其中加入等體積的15 %的TCA溶液，靜置 20min后，lOOOOr/min離心10min。取上清液，采用Folin-酚法測(cè)可溶性蛋白含量。如圖1 所示，復(fù)合蛋白酶的酶解能力最強(qiáng)。所以，復(fù)合蛋白酶最適合用來(lái)制備海參生物活性肽。
[0022] 以新鮮海參內(nèi)臟為原料，將其破碎勻漿取Ig加入至5. 56mL，20mM pH6. 0磷酸緩沖 液中混勻，然后加入3000U復(fù)合蛋白酶，在55°C下反應(yīng)2h。然后8000rpm離心10min，上清 液即為海參多肽溶液。
[0023] 海參多肽抗氧化活性測(cè)定如下：
[0024] (1)羥自由基清除能力測(cè)定方法：將上述獲得海參多肽溶液用20mM pH6. O磷 酸緩沖液配置一定梯度，分別取Iml加入至不同試管中，再向每個(gè)試管中依次加入0. 5mL 2mmol/L EDTA-Fe 溶液，ImL 150mM，pH7. 4 磷酸緩沖液，ImL 360ug/mL 番花紅，最后加 入ImL 3%過(guò)氧化氫，混勻，37°C水浴30min，于520nm比色。空白組用緩沖溶液代替樣品 和過(guò)氧化氫，同時(shí)用Vc作對(duì)照。每個(gè)濃度做3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用清除率E來(lái)表示：

[0025] 由圖2可見(jiàn)，該方法制備的海參多肽的羥自由基清除能力明顯強(qiáng)于現(xiàn)有的抗氧化 劑Vc0
[0026] (2)還原能力的測(cè)定方法：將上述獲得海參多肽溶液用20mM pH6. 0磷酸緩沖液 配置一定梯度，分別取Iml加入至不同試管中，再向每個(gè)試管中依次加入ImL 1 %的鐵氰化 鉀，50°C水浴20min，然后加入2mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，5min后，加入1.25mL 0. 1% 的三氯化鐵，混合均勻，靜置3011^11，于70011111比色?？瞻捉M用0.2111〇1/1?!16.6磷酸緩沖液 來(lái)代替樣品，同時(shí)用BHT作對(duì)照。每個(gè)濃度做3個(gè)平行（參見(jiàn)圖3)。
[0027] 由圖3可見(jiàn)，該方法制備的海參多肽的還原能力顯著高于現(xiàn)有抗氧化劑BHT。
[0028] 實(shí)施例2 :
[0029] 以新鮮海參體壁為原料，將其破碎勻漿取Ig加入至6. 67ml，20mM pH6. 5磷酸緩沖 液中混勻，然后加入3500U復(fù)合蛋白酶，在65°C下反應(yīng)4h。然后12000rpm離心15min，上清 液即為海參多肽溶液。
[0030] 海參多肽抗氧化活性測(cè)定如下：
[0031] (1)羥自由基清除能力測(cè)定方法：
[0032] 將上述獲得海參多肽溶液用pH6. 0磷酸緩沖液配置一定梯度，分別取Iml加入至 不同試管中，再向每個(gè)試管中依次加入0. 5mL 2mmol/L EDTA-Fe溶液，ImL 150mM，pH7. 4 磷酸緩沖液，ImL 360ug/mL番花紅，最后加入ImL 3%過(guò)氧化氫，混勾，37°C水浴30min，于 520nm比色。空白組用緩沖溶液代替樣品和過(guò)氧化氫，同時(shí)用Vc作對(duì)照。每個(gè)濃度做3個(gè) 平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用清除率E來(lái)表示：&今°° :空白X麵。 ^對(duì)照_ 空白
[0033] (2)還原能力的測(cè)定方法：將上述獲得海參多肽溶液用20mM pH6. 0磷酸緩沖液 配置一定梯度，分別取Iml加入至不同試管中，再向每個(gè)試管中依次加入ImL 1 %的鐵氰化 鉀，50°C水浴20min，然后加入2mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，5min后，加入1.25mL 0. 1% 的三氯化鐵，混合均勻，靜置3011^11，于70011111比色?？瞻捉M用0.2111〇1/1?!16.6磷酸緩沖液 來(lái)代替樣品，同時(shí)用BHT作對(duì)照。每個(gè)濃度做3個(gè)平行。
[0034] 實(shí)施例3 :
[0035] 以新鮮海參內(nèi)臟為原料，將其破碎勻漿取Ig加入至5ml，pH7. 0磷酸緩沖液中混 勻，然后加入5000U復(fù)合蛋白酶，在60°C下反應(yīng)3. 5h。然后1000 Orpm離心15min，上清液即 為海參多肽溶液。
[0036] 海參多肽抗氧化活性測(cè)定如下：
[0037] (1)羥自由基清除能力測(cè)定方法：將上述獲得海參多肽溶液用20mM pH6. 0磷 酸緩沖液配置一定梯度，分別取Iml加入至不同試管中，再向每個(gè)試管中依次加入0. 5mL 2mmol/L EDTA-Fe溶液，ImL 150mM，pH7. 4磷酸緩沖液，ImL 360ug/mL番花紅，最后加入 ImL 3%過(guò)氧化氫，混勻，37°C水浴30min，于520nm比色。空白組用緩沖溶液代替樣品 和過(guò)氧化氫，同時(shí)用Vc作對(duì)照。每個(gè)濃度做3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用清除率E來(lái)表示

[0038] (2)還原能力的測(cè)定方法：將上述獲得海參多肽溶液用20mM pH6. 0磷酸緩沖液 配置一定梯度，分別取Iml加入至不同試管中，再向每個(gè)試管中依次加入ImL 1 %的鐵氰化 鉀，50°C水浴20min，然后加入2mL 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，5min后，加入1.25mL 0. 1% 的三氯化鐵，混合均勻，靜置3011^11，于70011111比色?？瞻捉M用0.2111〇1/1?!16.6磷酸緩沖液 來(lái)代替樣品，同時(shí)用BHT作對(duì)照。每個(gè)濃度做3個(gè)平行。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效制備海參抗氧化活性肽的方法，其特征在于：以新鮮海參體壁或內(nèi)臟為原 料，將其破碎勻漿并用磷酸緩沖液稀釋，而后用復(fù)合蛋白酶于55-65°C下酶解，酶解液離心 上清液即為海參抗氧化活性肽。2. 按權(quán)利要求1所述高效制備海參抗氧化活性肽的方法，其特征在于：所述破碎勻漿 用磷酸緩沖液稀釋，使其料液比（w/v)在15% -20%。3. 按權(quán)利要求1所述高效制備海參抗氧化活性肽的方法，其特征在于：所述復(fù)合蛋白 酶加入量為3000-5000U/g，酶解2-4h。4. 按權(quán)利要求1所述高效制備海參抗氧化活性肽的方法，其特征在于：所述酶解液于 8000-12000rpm下離心10-15min，然后將離心上清液進(jìn)行冷凍干燥，所得固體即為海參體 壁或海參內(nèi)臟抗氧化活性肽。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體的說(shuō)是一種高效制備海參抗氧化活性肽的方法。具體為以新鮮海參體壁或內(nèi)臟為原料，將其破碎勻漿并用磷酸緩沖液稀釋，而后用復(fù)合蛋白酶于55-65℃下酶解，酶解液離心上清液即為海參抗氧化活性肽。本發(fā)明所得海參多肽的羥自由基清除能力和總還原力明顯高于目前廣泛使用的抗氧化劑—維生素C(Vc)和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)海參資源的高值化利用以及開(kāi)發(fā)具有保健功能的食品奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】C12P21/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105177095
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李榮鋒, 李鵬程, 于華華, 岳洋, 劉松, 邢榮娥, 陳曉琳
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
【公開(kāi)日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月14日