同時(shí)檢測(cè)兩種葡萄潰瘍病菌的雙重pcr引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于本發(fā)明屬于植物真菌病原物分子檢測(cè)新技術(shù)，具體涉及采用雙重PCR 技術(shù)檢測(cè)兩種葡萄潰瘍病菌的方法的建立及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae)真菌引起的葡萄潰瘍?。╣rape Botryosphaeria dieback)近年來(lái)在世界范圍內(nèi)危害日益加重，已經(jīng)成為威脅葡萄品質(zhì)和 產(chǎn)量的重要因素之一 (Pascoe I. Trunk diseases of grapevines-perspective from a tour of California. The Australian Grapegrower and Winemaker. 1998,417:68-71. Van Niekerk JM，F(xiàn)ourie P H，Hallenn F，et al. Botryosphaeria spp. as grapevine trunk disease pathogens. Phytopathologia Mediterranea. 2006, 45(4) :43-54. Urbez-Torres JR. The status of Botryosphaeriaceae species infecting grapevines. Phytopathologia Mediterrianea. 2011，50:5-45.) D截至目前，報(bào)道顯示在葡萄座腔菌科 中有17個(gè)種可引起葡萄潰瘍?。ˋuger J，Esterio M，Ricke G，et al.Black dead arm and basal canker of Vitis vinifera cv.Red Globe caused by Botryosphaeria obtusa in Chile. Plant Disease. 2004, 88 (11) : 1286. URbez-Torres J RjPeduto FjStriegler R K，et al. Characterization of fungal pathogens associated with grapevine trunk diseases in Arkansas and Missouri. Fungal Diversity. 2012:1-21. U Rbez-Torres J R，Gubler ff D.Pathogenicity of Botryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers in California. Plant Disease. 2009, 93(6):584-592.)〇 在我 國(guó)已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的葡萄潰瘍病病原菌有Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae、Neofusicoccum parvum 和 Diplodia seriata 四個(gè)種(Li X Hj Yan J Yj Kong F Fj et al.Botryosphaeria dothidea causing canker of grapevine newly reported in China [J]. Plant Pathology. 2010, 59 (6) : 1170. Yan J YjPeng Y LjXie Y，et al.First Report of Grapevine Trunk Disease Caused by Botryosphaeria obtusa in China [J]. Plant Disease. 2011, 95 (5) : 616. Yan J YjLi X HjKong F F，et al. Occurrence of Grapevine Trunk Disease Caused by Botryosphaeria rhodina in China [J]. Plant Disease. 2011, 95 (2) : 219. Yan J Yj Xie Y，Zhang Wj et al.Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China. Fungal Diverisi ty. 2013, 61:221-236. )D 研究表明，在我國(guó) Neofusicoccum parvum 主 要分布在亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，Botryosphaeria dothidea則在溫帶季風(fēng)氣候區(qū)和亞熱帶 季風(fēng)氣候區(qū)均有分布，病原菌侵染葡萄后帶來(lái)嚴(yán)重的損失（Yan J Y，Xie Y，Zhang W，et al. Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China. Fungal Diverisity. 2013, 61:221-236.) D 在實(shí)際生產(chǎn)中，葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea) 和小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum)兩種病原菌?；旌锨秩荆瑤?lái)更為嚴(yán)重的損失。 [0003] 準(zhǔn)確的早期診斷能夠?yàn)椴『τ行Х揽靥峁┮罁?jù)。由于葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)和小新殼梭抱（Neofusicoccum parvum)常混合侵染，且侵染 葡萄后引起的癥狀相似，很難區(qū)分，導(dǎo)致傳統(tǒng)的早期診斷方法無(wú)法快速的得到準(zhǔn)確結(jié)果。而 常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)--聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain react ion, PCR)技術(shù)則 可以快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)到微量病原菌的存在，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物病害的診斷及病原菌 的鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一組能夠用于同時(shí)檢測(cè)兩種葡萄潰瘍病菌-葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)和小新殼梭抱（Neofusicoccum parvum)的雙重 PCR 引物以及 一種操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠的上述兩種葡萄潰瘍病菌的雙重PCR檢測(cè)方法。
[0005] 基于上述發(fā)明目的，根據(jù)葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新殼梭 孢（Neofusicoccum parvum)EF延伸因子和β -tubulin序列上的差異位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了上 述兩種病原菌的特異性引物，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)程序、體系的反復(fù)摸索，建立了這兩種病原 菌的雙重PCR檢測(cè)體系，能夠?qū)⑵咸炎痪˙otryosphaeria dothidea)和小新殼梭孢 (Neofusicoccum parvum)快速準(zhǔn)確的區(qū)分開來(lái)，對(duì)開展苗木帶菌檢測(cè)和葡萄園病原菌動(dòng)態(tài) 監(jiān)測(cè)具有重要意義。
[0006] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)葡萄潰瘍病菌的雙重PCR引物，由序列表中序列1所示的核 苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示 的核苷酸組成。其能夠同時(shí)用于檢測(cè)葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新殼梭 抱（Neofusicoccum parvum)〇
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)葡萄潰瘍病菌中的葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)和小新殼梭抱（Neofusicoccum parvum)的試劑盒，包括所述 的雙重PCR引物組。
[0008] 在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，所述試劑盒中還包括PCR反應(yīng)試劑；所述PCR反應(yīng)試 劑包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、濃縮PCR緩沖液和Taq DNA聚合酶。其中，濃縮PCR緩沖液 即為 10XPCR緩沖液，是由 lOOmmol/L Tris-HCl ρΗ8· 3, 500mmol/L KCl，15mmol/L ]\%(：12組 成的溶液。
[0009] 上述雙重PCR引物組以及包括該引物組的試劑盒在檢測(cè)葡萄潰瘍病菌中的葡萄 座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新殼梭抱（Neofusicoccum parvum)中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述的檢測(cè)優(yōu)選為同時(shí)檢測(cè)。
[0010] 本發(fā)明還提供一種檢測(cè)葡萄潰瘍病菌中的葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)和小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum)的雙重PCR檢測(cè)方法，包括使用上述引 物擴(kuò)增待測(cè)樣品。所述擴(kuò)增過(guò)程中還使用PCR反應(yīng)試劑。PCR反應(yīng)試劑可以從商業(yè)途徑獲 得，也可以自己配置。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟：
[0012] 1)提取待測(cè)樣品DNA，以該DNA為模板，用權(quán)利要求1所述的引物雙重PCR擴(kuò)增；
[0013] 2)鑒定步驟1)所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，將擴(kuò)增產(chǎn)物中含有一個(gè)324bp的 DNA特異性擴(kuò)增片段的待測(cè)樣品鑒定為含有小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum)的樣品， 將擴(kuò)增產(chǎn)物中含有一個(gè)212bp的DNA特異性擴(kuò)增片段的待測(cè)樣品鑒定為含有葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)的樣品。
[0014] PCR反應(yīng)體系為25 μ L，包括：待測(cè)樣品DNA(約5ng，終濃度(λ 2ng/ μ L)，d-F/ Β· d-R 和 Ν· p-F/N. p-R 引物（10 μ mol/L)各 0· 5 μ L (即終濃度為 0· 2 μ mol/L)，dATP、 dCTP、dGTP、dTTP 的終濃度均為 2. 5mmol/L，2. 5 μ L 10XPCR 緩沖液（lOOmmol/L Tris-HCl 口!18.3,500臟〇1/11((：1，15臟〇1/1]\%(：12)和0.25 4 1^了39 0嫩聚合酶（51]/^1^，添加終濃度 為0. 05U/ μ I)，其余部分用ddH20補(bǔ)足；
[0015] PCR 條件為：94°C預(yù)變性 4min ;30 個(gè)循環(huán)的 94°C 30s，58°C 30s 和 72°C 20s ;72°C 延伸5min〇
[0016] 步驟2)中所述鑒定步驟I)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小的方法是取5 μ L PCR產(chǎn)物用質(zhì)量 百分濃度為2%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外燈下根據(jù)有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物判 定結(jié)果。
[0017] 上述雙重PCR引物可應(yīng)用于檢測(cè)引起葡萄潰瘍病的病原菌Neofusicoccum parvum和Botryosphaeria dothidea，其中，本發(fā)明的雙重PCR引物中的序列1和序列2能 夠在葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea)特異性的擴(kuò)增出324bp的產(chǎn)物，序列3和序列 4能夠在小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum)特異性的擴(kuò)增出212bp的產(chǎn)物。而且，本發(fā)明 的雙重PCR