一種日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星三重pcr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)遺傳育種的分子標(biāo)記輔助技術(shù)，具體涉及一種日本囊對(duì)蝦 微衛(wèi)星三重PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 日本囊對(duì)奸（Penaeus japonicus)廣泛分布于印度洋，西太平洋地區(qū)，以及日本沿 海和我國東南沿海等海域均有分布，是我國沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖對(duì)象。利用分子標(biāo)記輔助 是日本囊對(duì)蝦良種選育的重要途徑之一，目前微衛(wèi)星為廣泛應(yīng)用的一種分子標(biāo)記。微衛(wèi)星 廣泛分布于基因組中，多態(tài)性高，穩(wěn)定性好，共顯性遺傳。廣泛應(yīng)用于系譜鑒定、個(gè)體識(shí)別、 基因連鎖分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性檢測等諸多領(lǐng)域。常規(guī)微衛(wèi)星檢測技術(shù)為單 引物常規(guī)PCR，效率低，而多重PCR在同一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)位點(diǎn)，極大提高了效率，減少 樣品浪費(fèi)，加快了檢測進(jìn)程，大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本等優(yōu)點(diǎn)。微衛(wèi)星多重PCR技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物 中應(yīng)用廣泛，主要用于親子鑒定和遺傳多樣性檢測。在日本囊對(duì)蝦中尚未見有多重PCR檢 測技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的三重PCR檢測 方法，該發(fā)明在大量微衛(wèi)星分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個(gè)三重PCR檢測體系及檢測程序， 實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)PCR反應(yīng)中同時(shí)檢測3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，與常規(guī)PCR方法相比效率提高了 3倍， 所得結(jié)果可同時(shí)反映日本囊對(duì)蝦多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，為日本囊對(duì)蝦分子標(biāo)記輔 助選擇育種提供高效而準(zhǔn)確的微衛(wèi)星檢測技術(shù)。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種日本囊對(duì)蝦微衛(wèi) 星三重PCR檢測方法，它包括：（1)設(shè)計(jì)、合成3重PCR引物；（2)提取總DNA ; (3)三重PCR 反應(yīng)；（4)電泳檢測PCR產(chǎn)物；所述3重PCR反應(yīng)包括三重PCR反應(yīng)體系和三重PCR反應(yīng)程 序，所述三重PCR反應(yīng)體系的引物為SEQ036、SEQ031和SEQ043的組合，所述三重PCR引物 的序列如下：
[0005] SEQ036 正向引物序列：5' -AAGGGAATTTGAGTAGAGTCTG-3' ；SEQ036 反向引物序列： 5'-GTTACATGCGAGTTGCTATT-3'
[0006] SEQ031 正向引物序列：5' -ACGCTGGTTTCATTGGGATT-3' ；SEQ031 反向引物序列： 5'-AAATGTGGGAGGGCGAAA-3'
[0007] SEQ043 正向引物序列：5' -ATTGCTGTCGGGATGAGA-3' ；SEQ043 反向引物序列： 5,-TGGTTGTTCGGAAGAGGT-3，
[0008] 所述的三重 PCR 反應(yīng)體系為：10XBuffer 2yL ;25mM Mg2+2yL ;10mM dNTP2yL， 10 μΜ 3 對(duì)擴(kuò)增引物 SEQ036、SEQ031 和 SEQ043 各 I μ L ;5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0· I μ L ; IOOng/ μ L日本囊對(duì)奸總DNA : 1 μ L ;滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μ L。
[0009] 所述的三重？〇?反應(yīng)程序?yàn)椋?4°(：預(yù)變性51^11;94°(：變性408,51°(：退火11^11， 72°C延伸lmin，共進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min ;4°C保存結(jié)束反應(yīng)。
[0010] 本發(fā)明步驟（4)采用8 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0012] 1、本發(fā)明將需要分別進(jìn)行3次的日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增和3次檢測，整合為 一次的3重PCR反應(yīng)體系和一次產(chǎn)物檢測，大大提高了日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測效率。 利用該3重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星檢測，可以大大節(jié)約PCR和電泳試劑、實(shí)驗(yàn) 耗材、減少電泳檢測時(shí)間及成本。
[0013] 2、本發(fā)明的3重PCR反應(yīng)所得微衛(wèi)星產(chǎn)物片段差異顯著，可避免不同位點(diǎn)產(chǎn)物片 段大小接近時(shí)無法區(qū)分的缺點(diǎn)。
[0014] 3、本發(fā)明可對(duì)日本囊對(duì)蝦在各個(gè)生長發(fā)育時(shí)期檢測，有利于日本囊對(duì)蝦育種過程 中選擇具備優(yōu)良性狀的日本囊對(duì)蝦家系和群體。
[0015] 4、本發(fā)明可以在日本囊對(duì)蝦群體遺傳多樣性分析、家系識(shí)別、親子鑒定、育種管 理、良種選育中進(jìn)行推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0016] 圖1為日本囊對(duì)蝦3重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
[0017] 圖中M為marker D2000，l為所述3對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果，2, 3,4為所述3對(duì)引物兩 兩組合的擴(kuò)增結(jié)果，5,6, 7為所述單對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例，具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并 不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范 圍。
[0019] 實(shí)施例1
[0020] (1)、引物設(shè)計(jì)與組合
[0021] 利用Tandem Repeat Finder從隨機(jī)克隆測序序列中查找微衛(wèi)星序列，選取核心重 復(fù)序列兩側(cè)完整的側(cè)翼序列用Premier Primer設(shè)計(jì)引物。MPprimer進(jìn)行引物間的組合評(píng) 價(jià)，取Λ G的絕對(duì)值小于3,降低二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的幾率，提高PCR反應(yīng)特異性及反應(yīng)效率。通 過對(duì)多對(duì)微衛(wèi)星引物間的組合，對(duì)日本囊對(duì)蝦多重PCR體系組合、PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)程序 進(jìn)行優(yōu)化，最終建立本發(fā)明所述的一種日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星3重PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及檢 測方法。本發(fā)明所選擇的3對(duì)日本囊對(duì)蝦引物為：
[0022] SEQ036 正向引物序列：5' -AAGGGAAITTGAGTAGAGTCTG-3'
[0023] SEQ036 反向引物序列：5' -GTTACATGCGAGTTGCTATT-3'
[0024] SEQ031 正向引物序列：5' -ACGCTGGTTTCATTGGGATT-3'
[0025] SEQ031 反向引物序列：5' -AAATGTGGGAGGGCGAAA-3'
[0026] SEQ043 正向引物序列：5' -ATTGCTGTCGGGATGAGA-3'
[0027] SEQ043 反向引物序列：5' -TGGTTGTTCGGAAGAGGT-3'
[0028] (2)、日本囊對(duì)蝦總DNA提取
[0029] 取肌肉組織約 100mg，放入 I. 5ml 離心管，加入 pH8. 0 的 TE(10mM Tris-Cl，IOOmM EDTA) 475 μ I，剪刀剪碎，加入10 % SDS溶液20 μ I，加入20mg/ml蛋白酶K 5 μ I，混勻，55°C 消化2. 5-3小時(shí)，至無組織塊。用Tris-Cl平衡飽和酚、酚：氯仿：異戊醇=25:24:1(體 積比）混合溶液、氯仿各抽提一次，每次混勾10min，12000rpm離心10min，取上清，最后上 清加1/25體積5MNaCl，2. 5倍體積-20°C冰凍無水乙醇沉淀DNA，靜置lOmin，離心10min， 沉淀用70%乙醇洗2遍，室溫干燥，用滅菌雙蒸水100 μ 1溶解，1 %瓊脂糖凝膠檢測DNA質(zhì) 量。
[0030] (3)、日本囊對(duì)蝦3重PCR反應(yīng)體系
[0031] 日本囊對(duì)蝦 3 重 PCR 反應(yīng)體系為：10XBuffer 2yL ;25mM Mg2+2yL ;10mM dNTP 2μL，10μΜ 3 對(duì)擴(kuò)增引物 SEQ036、SEQ031 和 SEQ043 各 lyL;5U/yL Taq DNA 聚合酶 0· 1 μ L ; IOOng/ μ L曰本囊對(duì)奸總DNA : 1 μ L ;滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μ L。
[0032] (4)、日本囊對(duì)蝦3重PCR反應(yīng)程序
[0033] 日本囊對(duì)蝦3重PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性40s，51°C退火lmin， 72°C延伸lmin，共進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min ;4°C保存結(jié)束反應(yīng)。
[0034] (5)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測
[0035] PCR反應(yīng)結(jié)束，將產(chǎn)物與載樣緩沖液1:1混合后，經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳， 電泳儀功率12W，電泳1-2. 5h。將電泳后膠板銀染顯色，記錄所得結(jié)果。
[0036] 圖1為日本囊對(duì)蝦3,2, 1重PCR擴(kuò)增變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖中M為 marker，1為所述3對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果，2, 3,4為兩兩組合的擴(kuò)增結(jié)果，5,6, 7為單引物的擴(kuò) 增結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3對(duì)引物組合擴(kuò)增結(jié)果清晰，分辨率高。
[0037] 依據(jù)本發(fā)明所提供的日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的3重PCR的引物組合及檢測方法快 速檢測日本囊對(duì)蝦單個(gè)個(gè)體在3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳變異及多態(tài)性，進(jìn)一步可應(yīng)用于日本 囊對(duì)蝦的家系識(shí)別、親子鑒定、遺傳標(biāo)記篩選、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面。
[0038] 以上實(shí)例已經(jīng)僅說明本發(fā)明的技術(shù)方案，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說， 對(duì)上述實(shí)施例做出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明 精神的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的專業(yè)術(shù)語用于對(duì)本發(fā)明的闡述和理解，并不能對(duì)本發(fā)明做出 限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星三重PCR檢測方法，其特征是，包括下述步驟：（1)設(shè)計(jì)、合成 3重PCR引物；（2)提取總DNA; (3)三重PCR反應(yīng)；（4)電泳檢測PCR產(chǎn)物；所述3重PCR反 應(yīng)包括三重PCR反應(yīng)體系和三重PCR反應(yīng)程序， 所述步驟（3)三重PCR反應(yīng)體系的引物為SEQ036、SEQ031和SEQ043的組合，所述三重PCR引物的序列如下： SEQ036 正向引物序列：5' -AAGGGAAITTGAGTAGAGTCTG-3' ；SEQ036 反向引物序列： 5'-GTTACATGCGAGTTGCTATT-3' SEQ031 正向引物序列：5'-ACGCTGGITTCAITGGGAIT-3' ；SEQ031 反向引物序列： 5'-AAATGTGGGAGGGCGAAA-3' SEQ043 正向引物序列：5'-AITGCTGTCGGGATGAGA-3' ；SEQ043 反向引物序列： 5,-TGGTTGTTCGGAAGAGGT-3， 所述的三重？〇?反應(yīng)體系為：10\8虹€6121^;2511111% 2+21^;1〇1111(1犯1321^，1〇1^3 對(duì)擴(kuò)增引物SEQ036、SEQ031 和SEQ043 各IyL;5U/yLTaqDNA聚合酶 0?IyL;100ng/ yL日本囊對(duì)奸總DNA:1yL;滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25yL; 所述的三重PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min;94°C變性40s，51°C退火lmin，72°C延 伸lmin，共進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min;4°C保存結(jié)束反應(yīng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星三重PCR檢測方法，其特征是，所述步驟 (4)采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星3重PCR檢測方法。本發(fā)明包括設(shè)計(jì)并合成3對(duì)PCR引物；提取總DNA；3重PCR反應(yīng)的組合、體系和反應(yīng)程序；PCR產(chǎn)物的檢測。本發(fā)明建立了進(jìn)行的日本囊對(duì)蝦微衛(wèi)星3重PCR檢測方法比原有方法效率可提高3倍。本發(fā)明具有節(jié)省成本，節(jié)省時(shí)間，高效經(jīng)濟(jì)，重復(fù)性強(qiáng)、簡單易行，檢測簡單等特點(diǎn)，可在日本囊對(duì)蝦的育種管理、家系鑒定、個(gè)體識(shí)別、親緣關(guān)系鑒定、良種選育、連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性檢測等方面進(jìn)行推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105177158
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】董世瑞, 欒生, 王素英, 王博瑋, 陳瑾
【申請人】天津商業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月15日