一種從牛膽粉中提取純化含有鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸的總提取物方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及藥物成分提取領域，特別地，設及一種牛膽粉中提取純化含有碟去氧 膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸的總提取物的方法。
【背景技術】
[0002] 牛膽汁是牛科動物黃牛Bostaurus domesticus Gmelin或水牛Bubalus L.的膽 汁。牛膽汁的藥用，始載于漢代的《神農本草經》一書，列為中品，后世本草亦時有論述。本品 味苦性寒，具有清肝明目，利膽通腸，解毒消腫之功效，廣泛用于治療肝熱目赤腫痛，小兒驚 風，癡腫瘡毒及便秘、消渴等疾病。牛膽粉(干燥膽汁)又為蒙藥特色藥材，蒙藥名為烏和仁- 蘇素，具有平息協(xié)日、愈傷、解毒、明目之功效。蒙醫(yī)臨床用于協(xié)日病、配毒癥療效顯著。目前 認為牛膽粉中主要含有膽紅素、膽汁酸、膽固醇、無機元素、蛋白及氨基酸等成分。
[0003] 牛膽汁中含有多種膽酸類化學成分，其中包括碟去氧膽酸、熊去氧膽酸及豬去氧 膽酸，但其含量較低。
[0004] 碟去氧膽酸在臨床上不僅用溶解膽固醇類結石和糾正飽和膽汁的藥物，還具有顯 著地平喘、抗炎、鎮(zhèn)咳和桂疲等作用。碟去氧膽酸也是昂貴的熊去氧膽酸的合成原料，它們 都是治療膽道疾病的有效藥物。
[0005] 熊去氧膽酸具有細胞膜穩(wěn)定作用，對肝臟毒性物質具有解毒作用，同時增加肝低 密度脂蛋白的攝取，從而增加肝細胞脂質的輸出，同時增加脂肪酸氧化或甘油Ξ脂轉化，緩 解肝細胞脂肪變性。
[0006] 豬去氧膽酸具有降血脂、鎮(zhèn)疫、桂疲等作用，為人工牛橫的重要成分，臨床上可用 于治療高血脂癥、氣管炎W及由肝膽疾病引起的消化不良，對百日咳菌、白喉桿菌、金黃色 葡萄球菌亦有抑制作用。
[0007] 現(xiàn)有技術中沒有從牛膽粉中提取有碟去氧膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸的總提 取物技術工藝報道。
[000引1.本發(fā)明只是從牛膽粉中制備碟去氧膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸的總提取物； 主要利用的是大孔樹脂；
[0009] 2.運些大孔樹脂只在我們的研究中應用過，別人還沒有報道；
[0010] 3.大孔樹脂的優(yōu)勢主要是富集微量的化合物，在我們的研究中主要是利用樹脂的 富集和純化作用。

【發(fā)明內容】

[0011] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種牛膽粉中提取純化含有碟去氧膽酸、熊去氧膽 酸、豬去氧膽酸的總提取物的方法。
[0012] 特別地，所述從牛膽粉中提取純化含有碟去氧膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸的總 提取物的方法是利用大孔樹脂有效提取、有效除渣、有效富集、有效純化的工作原理;利用 物美價廉的不用濃度的乙醇達到最后總提取物的純化;提純之后的總提取物可w進行蒙藥 制劑劑型的改革研究，具體步驟包括：
[0013] (1)牛膽粉95%乙醇超聲提取(超聲頻率50-80HZ):取一定量牛膽粉加入一定體積 95 %乙醇(物料比例1:2)超聲提取3次，每次比，每一次超聲提取結束后，提取液上加適量乙 酸乙醋放置30min沉淀，等完全沉淀后用布氏漏斗過濾，沉淀再加95%乙醇繼續(xù)第二次提 取，W上方法提取Ξ次。最后合并過濾液。
[0014] (2)回收濃縮:回收濃縮濾液，濃縮至沒有乙醇味。
[0015] (3)冷凍干燥:濃縮液冷凍干燥，得牛膽粉凍干粉。
[0016] (4)牛膽粉凍干粉40%乙醇超聲(超聲頻率50-80HZ)溶解，備用。
[0017] (5)大孔吸附樹脂分離純化:稱取1kg處理樹脂于玻璃層析柱中，緩慢加入上述溶 解液，依次用20 %、40 %、60 %、80 %乙醇洗脫，過濾，收集60 %和80 %乙醇洗脫液，濃縮60 % 和80 %乙醇洗脫液，冷凍干燥60 %和80 %乙醇濃縮液。
[001引特別的，本實驗中用到了多種大孔樹脂，其中包括D101型，D001型、HPD-100型、 HPD-750 型、HPD-722 型、SIP1300 型、X-5 型。
[0019] 特別地，樹脂經過預處理:將樹脂95%乙醇適量浸泡2地，將浸泡好的樹脂裝柱子， 先95%乙醇沖洗，然后用純化水沖洗，沖洗至不出現(xiàn)白色渾濁沒有乙醇味為止，然后用5% 鹽酸和5 %氨氧化鋼沖柱子，各沖5個柱體積，最后5~6柱體積純化水沖洗至中性備用。
[0020] 附圖概要說明
[0021 ]附圖1給出了一種本發(fā)明蒙藥復方的具體提取純化分離流程圖。
[0022] 附圖2顯示了本發(fā)明60%和80%牛膽粉凍干粉通過化C鑒別含有碟去氧膽酸、熊去 氧膽酸和豬去氧膽酸的薄層圖。用碟去氧膽酸、熊去氧膽酸和豬去氧膽酸標準品分別對照 60%和80%牛膽粉凍干粉中含有碟去氧膽酸、熊去氧膽酸和豬去氧膽酸。圖2薄層鑒定的結 果顯示60%和80%牛膽粉凍干粉中含有與碟去氧膽酸、熊去氧膽酸和豬去氧膽酸對照品相 同的點（相同的Rf值)且相同的顏色反應。
[0023] 薄層鑒定具體實施方法：
[0024] 展開劑：甲苯-冰醋酸-水（19.5:10:0.3)的比例配制成展開劑，并加一滴甲酸。
[0025] 顯色劑：10%硫酸乙醇溶液顯色劑:遵藥典量取2.85ml的硫酸溶液，用乙醇稀釋到 50ml制得。
【具體實施方式】 [00%] 實施例1
[0027] 稱取600g牛膽粉，放入Ξ角瓶中，加入1.化的95%乙醇，封蓋，放入超聲波中提取， 超聲波溫度30°C，時間30min，每次提取化，提取3次，每次超聲提取結束后，提取液上加適量 乙酸乙醋放置30min沉淀，等提取液沉淀后過濾，最后合并過濾液，回收濃縮，冷凍干燥得 496g牛膽粉備用。
[00%] 496g牛膽粉凍干粉加適量40%乙醇超聲溶解，將層析柱里處理好的D101樹脂1kg， 緩慢加入40 %乙醇牛膽粉溶液，吸附解析洗脫，收集60 %和80 %乙醇洗脫液，過濾，濃縮，冷 凍干燥得產品。60 %乙醇洗脫液凍干粉29.897g，80 %乙醇洗脫液凍干粉21.182g。
[0029] 60 %和80 %牛膽粉凍干粉通過化C鑒別含有碟去氧膽酸、熊去氧膽酸和豬去氧膽 酸，其中碟去氧膽酸、熊去氧膽酸和豬去氧膽酸富集在60%牛膽粉凍干粉中。
[0030] 實施例2
[0031 ]對60 %和80 %牛膽粉凍干粉進行藥效學研究，進一步證實蒙藥制劑或蒙藥處方 中，治療膽石癥、高脂血癥、消化不良等癥狀的藥理作用，其中W60%乙醇部位牛膽粉凍干 粉進行藥效學研究為例。
[0032] (1)對膽汁分泌的影響
[0033] 采用膽道插管法，取體重為180-200g雄性大鼠 16只，隨機分為二組，即空白對照組 和給藥組，各8只雄性大鼠，空白組給予灌胃給生理鹽水簇甲基纖維素鋼混懸劑，給藥組灌 胃lOOmg/kg的60%乙醇部位牛膽粉凍干粉，藥后30分鐘，用20%烏拉坦麻醉，手術、插膽管， 收集二小時的膽汁分泌量。
[0034] 實驗結果說明60%乙醇部位牛膽粉凍干粉較對照組有顯著的利膽作用，能明顯增 加膽汁的分泌量，實驗結果見(表1)。
[0035] (表1)60%乙醇部位牛膽粉凍干粉對大鼠膽汁分泌的影響
[0036]
[0038] (2)對血清膽固醇的影響
[0039] 采用高鐵一硫酸顯色法，取體重18-22g小鼠 16只，隨機分為二組，即空白對照組和 給藥組，各8只小鼠，空白組給予灌胃給生理鹽水簇甲基纖維素鋼混懸劑，給藥組灌胃 300mg/kg的60%乙醇部位牛膽粉凍干粉，連續(xù)給藥4天。于最后一次給藥后5小時，摘除眼球 取血，制備血清后，測定其膽固醇濃度。
[0040] 結果表明，給藥組與對照組之間有顯著的差異，說明60%乙醇部位牛膽粉凍干粉 對血清膽固醇有明顯降低作用。實驗結果見(表2)
[0041 ](表2)60%乙醇部位牛膽粉凍干粉對小鼠血清膽固醇濃度的影響
[0042]
【主權項】
1. 一種牛膽粉中提取純化含有鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸的總提取物的方 法，其特征在于包括步驟： (1) 牛膽粉95 %乙醇超聲提取(超聲頻率50-80HZ):取一定量牛膽粉加入一定體積95 % 乙醇(物料比例1:2)超聲提取3次，每次lh，每一次超聲提取結束后，提取液上加適量乙酸乙 酯放置30min沉淀，等完全沉淀后用布氏漏斗過濾，沉淀再加95%乙醇繼續(xù)第二次提取，以 上方法提取二次。最后合并過濾液。 (2) 回收濃縮:回收濃縮濾液，濃縮至沒有乙醇味。 (3) 冷凍干燥:濃縮液冷凍干燥，得牛膽粉凍干粉。 (4) 牛膽粉凍干粉40 %乙醇超聲(超聲頻率50-80HZ)溶解，備用。 (5) 大孔吸附樹脂分離純化:稱取lkg處理樹脂于玻璃層析柱中，緩慢加入上述溶解液， 依次用20 %、40 %、60 %、80 %乙醇洗脫，過濾，收集60 %和80 %乙醇洗脫液，濃縮60 %和 80 %乙醇洗脫液，冷凍干燥60 %和80 %乙醇濃縮液。2. 根據(jù)權利要求1的方法，其中處理樹脂的方法為:將樹脂95%乙醇適量浸泡24h，將浸 泡好的樹脂裝柱子，先95%乙醇沖洗，然后用純化水沖洗，沖洗至不出現(xiàn)白色渾濁沒有乙醇 味為止，然后用5 %鹽酸和5 %氫氧化鈉沖柱子，各沖5個柱體積，最后5~6柱體積純化水沖 洗至中性備用。3. 根據(jù)權利要求1或2的方法，其中大孔樹脂，其中包括D101型，D001型、HPD-100型、 HPD-750 型、HPD-722 型、SIP1300 型或 X-5 型。4. 根據(jù)權利要求1-3任一的方法制備的含有鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸的總 提取物。5. 根據(jù)權利要求4的總提取物在用于治療膽石癥、高脂血癥或消化不良癥狀蒙藥制劑 中的應用。6. 根據(jù)權利要求4的總提取物制成的蒙藥制劑，其特征在于劑型包括滴丸劑、軟膠囊、 膠囊劑、顆粒劑、注射劑、片劑、巴布劑、軟膏劑、凝膠劑、透皮控釋貼劑、噴霧劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛膽粉中提取純化含有鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸的總提取物的方法，其提取純化方法主要包含：取一定量的牛膽膏粉，用95％的乙醇浸泡(牛膽膏∶乙醇＝1∶2)，在超聲波提取器中提取；提取液中加入乙酸乙酯放置30min沉淀，過濾，濃縮，冷凍干燥備用。稱取一定量處理過的大孔樹脂于玻璃層析柱中，將牛膽粉提取物凍干粉用40％乙醇溶解，然后緩慢加入溶解液于析柱中，洗脫過濾，濃縮，冷凍干燥得產品。采用超聲提取牛膽粉提取率高，提取時間較短，工藝操作簡便。本發(fā)明采用了大孔樹脂法分離純化牛膽粉提取物，該方法分離、純化、富集的作用好，方便鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、豬去氧膽酸的提取純化。
【IPC分類】A61P1/14, A61P3/06, A61P1/16, A61K35/413
【公開號】CN105596373
【申請?zhí)枴緾N201510845226
【發(fā)明人】畢力格, 李漢青, 金亮, 蔚璐
【申請人】內蒙古自治區(qū)蒙醫(yī)藥研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年11月27日