擬組織金屬蛋白酶抑制因子多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及擬組織金屬蛋白酶抑制因子多肽，具體涉及具有抑制基質(zhì)金屬蛋白 酶，具有減輕骨質(zhì)疏松癥的多肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松即骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)，是多種原因引起的一組骨病，骨組織有 正常的鈣化，鈣鹽與基質(zhì)呈正常比例，以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點的代謝性骨病變。 在多數(shù)骨質(zhì)疏松中，骨組織的減少主要由于骨質(zhì)吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折為特 征。
[0003] 目前，用于治療和阻止骨質(zhì)疏松癥發(fā)展的藥物分為兩大類，第一類為抑制骨吸收 藥，包括鈣劑、維生素 D及活性維生素 D、降鈣素、二磷酸鹽、雌激素以及異黃酮;第二類為促 進(jìn)骨性成藥，包括氟化物、合成類固醇、甲狀旁腺激素以及異黃酮。這些藥物可以阻止骨吸 收但對骨形成的作用特別小。
[0004] 基質(zhì)金屬蛋白酶家族參與多種正常的生理功能，例如卵細(xì)胞著床，骨骼生長和器 官發(fā)育等?；|(zhì)金屬蛋白酶被更多的看作是這些病理過程的調(diào)節(jié)因子。其家族成員包括 MMP1-26分布于骨基質(zhì)中。大量研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶參與骨的重塑和構(gòu)建且表達(dá)骨吸 收活性，其中MMP-2、MMP_9等對原發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)病的影響已被證實。目前研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2 是分布最廣的MMP，其主要作用可能為降解損傷或變性膠原以保護(hù)機體。MMP-9也是明膠酶 中的一種。MMP-9包含一個V型的膠原蛋白結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域有高度的糖基化作用，，它影 響底物的特異性以及有抗衰變的作用。MMP-9有許多作用底物，如1￥、￥、\1、叉、見型膠原、 蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等，細(xì)胞因子及其受體也 是MMP-9作用的底物。在骨代謝中，首先由麗P-2啟動骨轉(zhuǎn)換，隨后激活MMP-9，在麗P-2及 MMP-9的作用下水解部分降解的I型膠原及其他多種骨基質(zhì)蛋白，骨鹽因失去依附而丟失， 發(fā)生骨質(zhì)疏松。因此，測定MMP-2和MMP-9活性是影響骨質(zhì)疏松的重要指標(biāo)。抑制基質(zhì)金屬蛋 白酶，可以有效抑制骨質(zhì)疏松。組織金屬蛋白酶抑制因子-1 (t i ssue inhibi tor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1)是由成骨細(xì)胞分泌的內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。研 究表明，TIMP-1能特異性的抑制基質(zhì)金屬蛋，在骨重建過程中對啟動骨吸收與骨形成起著 重要作用。因此，制備擬??ΜΡ-1多肽，可以有效抑制MMP，從而抑制骨質(zhì)疏松。這一發(fā)現(xiàn)為骨 質(zhì)疏松患者的治療找到了新的突破口。盡管如此，并沒有成熟開發(fā)的擬TIMP-1多肽問世，用 于治療骨質(zhì)疏松癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的
[0006] 本發(fā)明提供全新的序列，該序列為擬組織金屬蛋白酶抑制因子多肽，對骨質(zhì)疏松 癥具有很好的療效。
[0007] 技術(shù)方案
[0008] 擬組織金屬蛋白酶抑制因子多肽，其特征在于其序列為 PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA，其多肽在治療骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用。
[0009] 有益效果
[0010] 擬組織金屬蛋白酶抑制因子多肽具有全新的序列，該多肽可體外抑制基質(zhì)金屬蛋 白酶2、9的酶活力。在體試驗研究表明，我們設(shè)計的多肽可以緩解骨質(zhì)疏松模型動物的骨密 度下降。
【具體實施方式】
[0011] 實施例1
[0012] 多肽的化學(xué)合成方法
[0013]多肽用Fmoc化學(xué)方法合成。合成反應(yīng)從C端向N端進(jìn)行，Rink介質(zhì)（可在Advanced ChemTech公司購得)上有自由氨基，按C端向N端的順序?qū)⒏鱾€氨基酸連接。每一步連接過程 中，氨基酸殘基都要活化，活化混合物中有4倍于介質(zhì)上自由氨基的HBTU，H0Bt，DIEA和 Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，都用一個吡啶/醋酸/N-甲基咪唑的混合物來封 閉未連接的自由氨基。每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，下一個氨基酸連接之前，都要把介質(zhì)上 的Fmoc-基團(tuán)去掉，去Fmoc-基團(tuán)使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺。最后，當(dāng)所有氨基酸殘基 順序連接之后，多肽用98%三氟乙酸從介質(zhì)上切割下來。
[0014] 應(yīng)用上述化學(xué)條件可合成并獲得多肽，序列為PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA，該序列 為全新序列。
[0015] 也可委托上海吉爾合成。
[0016] 實施例2
[0017]多肽體外對基質(zhì)金屬蛋白酶2、9的IC50值。
[0018] 重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-2由E.coli細(xì)胞表達(dá).該酶用Ο.ΟΙμΜ的基質(zhì)金屬蛋白酶-3 活性位點活化，所用的緩沖液為l〇〇mM Tris/HCl，pH 7.4，100mM NaCl，10mM CaCl2and 0.01%TWeen-20。活化時基質(zhì)金屬蛋白酶-2的濃度為72ng/yl(lyM)。酶活力的檢測是通過 切割熒光產(chǎn)生多肽底物Mca-Pr〇-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH 2并檢測產(chǎn)生的熒光值實現(xiàn) 的（激發(fā)波長= 328nm，檢測波長= 392nm)。所有的檢測在37°C下100μ1反應(yīng)體系中進(jìn)行。實 施例1測得的IC50值為75.07ymol。
[0019] 重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-9的檢測與-2的檢測類似并使用同樣的熒光產(chǎn)生底物。反 應(yīng)也是在37°C下100μ1反應(yīng)體系中進(jìn)行。檢測時向反應(yīng)體系中加20μ1重組人基質(zhì)金屬蛋白 酶-9(2ngAU).底物的終濃度為10μΜ。實施例1測得的IC50值為25.80μπι 〇1。
[0020] 實施例3
[0021]多肽對體外培養(yǎng)人成骨細(xì)胞的生長EC50。
[0022]采用ΜΤΤ比色法。將對數(shù)生長的人成骨細(xì)胞，以1.0Χ105加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24h，實驗孔、分別加入不同濃度的實驗藥物實施例1多肽(上海吉爾合成）；空白組加入相同 體積的溶劑。每孔設(shè)五個復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMS0，孵育30min， 在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式成骨細(xì)胞增殖率=(1 一實驗組吸光值/對照組吸 光值）X 100%。計算出實施例1多肽的EC50為13.15μΜ。
[0023] 實施例4
[0024]實施例1多肽對骨密度的影響：取50只大鼠隨機分為5組:高劑量組、中劑量組、低 劑量組，陽性對照組，模型組，每組10只。造模及治療大鼠用10%的水合氯醛以3ml/100g行 腹腔注射，麻醉滿意后，將大鼠仰臥位固定于事先制作的老鼠手術(shù)臺上，于腹股溝正中處做 縱切口，長約2cm，切開皮膚及皮下筋膜，水平切斷左側(cè)股神經(jīng)，靠近上段予以切除5mm，并作 神經(jīng)斷端打結(jié)，縫合切口。再將大鼠取俯臥位固定于手術(shù)臺上，在股骨大轉(zhuǎn)子與靠近尾部之 間與后外方45°方向行長約lcm的切口，暴露坐骨神經(jīng)，靠近近端予以切除5mm，并作神經(jīng)斷 端打結(jié)，縫合切口，普通喂養(yǎng)13周后給藥。治療:模型組按照lml/100g的劑量灌胃生理鹽水； 陽性對照組灌胃2.0ml二磷酸鹽;高中低劑量組分別給予實施例1多肽0.5，1.0，2mg/Kg灌 胃，連續(xù)給藥10周。先采用雙能X線骨密度儀測雙側(cè)股骨骨密度。
[0025]結(jié)果:如表1。與模型組大鼠相比，實施例1多肽低、中、高劑量能顯著性緩解大鼠骨 密度下降(P〈〇.〇5)。
[0026] 表1實施例1多肽對大鼠骨密度的作用
[0027]
[0028] *p〈〇 · 05，#p〈0 · 01 與模型組相比 [0029] 實施例5
[0030]實施例1多肽對骨密度的影響：取50只大鼠隨機分為5組:高劑量組、中劑量組、低 劑量組，陽性對照組，模型組，每組10只。造模及治療大鼠用大鼠維甲酸70mg/kg灌胃兩周。 治療:模型組按照Iml/lOOg的劑量灌胃生理鹽水；陽性對照組灌胃2.0ml二磷酸鹽;高中低 劑量組分別給予實施例1多肽〇. 5，1.0，2mg/Kg灌胃，連續(xù)給藥10周。先采用雙能X線骨密度 儀測雙側(cè)股骨骨密度。
[0031 ]結(jié)果:如表2。與模型組大鼠相比，實施例1多肽低、中、高劑量能顯著性緩解大鼠骨 密度下降(P〈〇.〇5)。
[0032]表2實施例1多肽對大鼠骨密度的作用
[0033]
[0034] *p〈〇 · 05，#p〈0 · 01 與模型組相比。
【主權(quán)項】
1. 擬組織金屬蛋白酶抑制因子多肽，其特征在于其序列為PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA。2. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的擬組織金屬蛋白酶抑制因子多肽在治療骨質(zhì)疏松癥的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及擬組織金屬蛋白酶抑制因子多肽及其應(yīng)用，可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2、9，具有減輕骨質(zhì)疏松的多肽。其序列為PEPEFHLISAFWPSLPSYLDAA是全新的序列，它們可以在體外抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2、9的活力，并在體內(nèi)試驗中可以緩解骨質(zhì)疏松模型動物的骨密度下降，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【IPC分類】A61K38/16, A61P19/10, C07K14/00
【公開號】CN105601719
【申請?zhí)枴緾N201610066339
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月30日