程中蛋白液體積保持恒定;透析過程中注意補加3%HCL適量以保持蛋 白液pH在3.70~4.00;透析結束后停止加水，將制品濃縮至蛋白濃度達8 %以上，用2.0°C~ 8.0°C注射用水頂洗超濾系統(tǒng)，將頂洗液合并入超濾罐中；
[0039] (E)向超濾濃縮后的蛋白液加入麥芽糖，補加注射用水，用3%的HCL調整濃縮后蛋 白液的pH值為3.8~4.4,使最終制品中免疫球蛋白含量為50~55g/L，麥芽糖含量為8 %~ 11% (g/mL)，抗體效價不低于1:900,用0.22um的濾膜除菌過濾，進行低pH孵育法使制品保 持在21°C~25°C下21天進行病毒滅活；
[0040] (F)在滅菌滅活結束后，通過原液送樣檢測蛋白含量，向藥液中加入注射用水稀釋 藥液的最終蛋白濃度為53g/L，再用納米膜過濾法進行病毒去除處理，然后進行除菌分裝即 得成品抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白。
[0041 ]進一步，在加壓過濾時，加入1 %~2 % (g/mL)的娃藻土做助濾劑，有利于提高過濾 效果。
[0042] 本發(fā)明所述抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白中和抗體效價大于等于1:900,可以 針對性的對呼吸道合胞病毒進行治療，是治療呼吸道合胞病毒感染癥的有效藥物，具有較 大的社會效益和經濟效益。
[0043] 本發(fā)明所述制備方法有以下優(yōu)點：
[0044] (1)到目前為止，國內對RSV感染的預防和治療既沒有安全有效的疫苗，也沒有特 效藥，國外治療RSV感染常用RSV特異性免疫球蛋白（RSV-IVIG)和RSV單克隆抗體 Palivizmuab。由于進口 RSV-IVIG及Palivizmuab價格昂貴，因此研制國產RSV-IVIG有極大 的實用價值和臨床意義。本發(fā)明是國內首次對呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白特異性血漿篩 選并進行工藝生產，同時對其工藝參數摸索優(yōu)化，生產出的高效價呼吸道合胞病毒人免疫 球蛋白為國內首例，將填補國內缺乏該藥物的市場空白。
[0045] (2)從健康人群中篩選出具有較高滴度的特異性原料血漿，其標準符合《中華人民 共和國藥典》2015版中"生物制品生產用血衆(zhòng)"規(guī)定，經低溫乙醇壓濾工藝結合柱層析純化 制備出高效價的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，是用于預防和治療呼吸道合胞病毒所引起 的嬰幼兒細支氣管炎和病毒性肺炎的有效藥物，特異性高，對于提高患者的存活率具有重 要的意義。
[0046] (3)采用中和試驗法對原料及產品進行抗體效價的檢測，該方法具有操作性強，靈 敏度高、特異性好的優(yōu)點。
[0047] (4)本發(fā)明在離心去除冷沉淀的基礎上，進一步通過調節(jié)血漿pH至7.0~7.2,乙醇 濃度至8%~10%，離心去除組分I沉淀，得到的組分I沉淀可以用來制作纖維蛋白原，提升 的血漿的附加值，同時使后續(xù)制備的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白純度更高，蛋白純度達 到100 % 〇
[0048] (5)本發(fā)明對壓濾后的組分III上清液通過摸索反應離子強度、pH和乙醇濃度，最 終確定向組分III上清液中加入1M碳酸氫鈉溶液調節(jié)pH值為7.55,按2.8g/L補加氯化鈉以 提高反應液離子強度。加入95%的乙醇，使反應液乙醇的最終濃度為25%，壓濾分離組分II 沉淀，該步反應最終確定反應液的離子強度、pH和乙醇濃度使得壓濾得到的組分II沉淀量 最大、免疫球蛋白純度達到100%、效價不低于1:900。
[0049] (6)收集的特異性原料血漿，采用壓濾機為主要分離設備，代替離心機進行靜注人 免疫球蛋白的生產，使分離的溫度等條件容易控制，分離速度快，而且沒有高速運轉設備， 生產安全性高；同時，采用離子交換層析法進行產品的進一步純化，制備出的呼吸道合胞病 毒人免疫球蛋白制劑純度達到100%，抗體效價不低于1:900，單體和二聚體之和達到99% ~99.5%，PKA< 30IU/mL，ACA<45%。
【具體實施方式】
[0050]以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限 定本發(fā)明的范圍。
[0051 ]各實施例中，細胞維持液為體積百分比3 %的胎牛血清，購自Gibco ;MEM細胞培養(yǎng) 液購自Gibco。
[0052] Vero細胞，中文名稱為非洲綠猴腎細胞，購自ATCC。
[0053] 實施例1
[0054] 1.供血漿者的血漿篩選采集：
[0055] 選擇血漿，采用中和試驗法檢測原料血漿中的呼吸道合胞病毒抗體的中和效價應 滿足以下條件：中和效價不低于1:200;蛋白質含量(雙縮脲法檢測)大于等于56g/L;丙氨酸 氨基轉移酶（賴氏法監(jiān)測）不高于35單位;ELISA法測定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/ HI V-2抗體、HCV抗體均為陰性。低溫-20 °C以下冰凍儲存，保存期不超過2年。
[0056] 2.中和實驗法測定原料血衆(zhòng)中抗體效價：
[0057] (A)將血漿樣品供試品用細胞維持液(體積百分比3%胎牛血清，購自Gibco)的MEM 細胞培養(yǎng)液(購自Gibco)預先進行1:4預稀釋后，56°C滅活30分鐘，后繼續(xù)10倍稀釋，即最終 1:40倍稀釋。
[0058] (B)取足夠量的96孔細胞培養(yǎng)板，在各樣品試驗板蓋上標示該板試驗樣本號、病毒 性型號和代次，在樣品板中每孔加入40yL細胞維持液，然后加入相應的預稀釋滅活的各樣 品液1〇μ!7孔，每樣品作豎向兩孔平行。
[0059] (C)取呼吸道合胞病毒，用足量的細胞維持液稀釋至試驗所需濃度（即100 X CCID5Q/0.05mL)，50yL/孔等量加入細胞培養(yǎng)板中，并同時設置陰性對照孔和病毒回滴孔。
[0060] 細胞(陰性)對照孔:直接加入細胞維持液100μL7孔；
[0061] 病毒回滴孔:先在板孔中加入細胞維持液50μLν孔，然后將應用病毒液進行10倍比 稀釋后，將攻擊病毒液10*3與其10 \1〇 2、1〇 3稀釋度的病毒液加入到相應的病毒回滴用96 孔細胞板孔中，50yL/孔。
[0062] (D)中和反應:將各板孔中液體小心混勻后置于37°C，5% (體積分數)的C02培養(yǎng)箱 中進行中和反應2小時。
[0063] (E)細胞懸液的配制和細胞懸加：
[0064]細胞懸液的配制:取足夠量的Vero細胞(ATCC購買），培養(yǎng)液為含10% (V/V)胎牛血 清的MEM培養(yǎng)液(Gibco)，消化后計數，用細胞維持液調節(jié)試驗用細胞懸液濃度應為1 X 105 個/mL，配好的細胞液立即使用。
[0065]細胞懸加：中和培養(yǎng)后每孔加細胞懸液100yL，約1 X104個/孔；
[0066] (F)培養(yǎng):將完成以上操作的96孔細胞板放置37°C、含有C02體積百分數為5%的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，病毒接種后的第5天顯微鏡下觀察細胞生長情況，第7天最終判定結果，并 記錄統(tǒng)計。
[0067] (G)樣品中和抗體效價的判定：各樣品若兩孔均未發(fā)生病變則其中和效價< 1 : 200;若一孔發(fā)生病變另一孔未發(fā)生病變則中和效價=1: 200;若兩孔均發(fā)生病變則其中和 效價>1:200。血漿樣品以中和效價大于或等于1:200判為合格的高效價呼吸道合胞病毒特 免血漿。
[0068]含較高滴度的特異性血漿在投產前進行混合檢測，抗體滴度不低于1:900，連續(xù)三 批混合血漿檢測結果見表1-3。
[0069] 表1第一批混合血衆(zhòng)檢測結果
[0070]
[0071 ] 表2第二批混合血漿檢測結果
[0072]
[0073] 表3第三批混合血漿檢測結果
[0074]
[0075] 3.呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的制備：
[0076] (A)將1600名具有呼吸道合胞病毒抗體的供血漿者的血漿融化混合，混合后體積 為900L，用中和試驗法檢測混血漿的中和效價為1:556;
[0077] (B)從血漿中分離組分II+III沉淀:將冷凍血漿900L在溫度在4°C融化，離心去冷 沉淀，用pH值為4.0的醋酸緩沖液調節(jié)血漿pH值到7.01，加入濃度為54% (v/v)的乙醇溶液 158.3Kg，使血漿中乙醇的最終濃度為8%，使反應液的最終溫度為-2.1°C，離心分離組分I， 用pH值為4.0的醋酸緩沖液調節(jié)組分I上清液的pH到5.93，加入濃度為95% (v/v)的乙醇溶 液139.7Kg，使血漿中乙醇的濃度從8 %達到20 %，使反應液的最終溫度控制在-3.6 °C，加入 1.5% (g/mL)的硅藻土做助濾劑13.5Kg，用壓濾機進行加壓過濾，過濾后的清液入另一個反 應罐，過濾完成時用壓縮空氣將壓濾機吹干，打開壓濾機，收取組分Π +ΙΙΙ沉淀22.3Kg。
[0078] (C)分離組分II沉淀:將上步加壓過濾后的組分II+III沉淀用加入5倍量預冷的注 射用水403Kg溶解，使反應溫度控制在1.2 °C。用pH值為4.0的醋酸緩沖液調節(jié)制品的pH值為 5.10，加入4lKg濃度為95 %的乙醇，使血漿中乙醇的濃度達到18 %，反應液溫度最終控制 在-5.2。。；
[0079] 每噸血漿加入5.0kg硅藻土，攪拌30分鐘，用壓濾機進行加壓過濾分離組分III上 清液。向組分III上清液中加入1M碳酸氫鈉溶液調節(jié)pH值