[0135]該制備方法得到的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白抗體效價(jià)、純度和回收率高，可 以針對性的呼吸道合胞病毒進(jìn)行治療，填補(bǔ)了國內(nèi)對RSV感染的預(yù)防和治療既沒有安全有 效的疫苗，也沒有特效藥，因此該發(fā)明有極大的實(shí)用價(jià)值和臨床意義。
[0136] 質(zhì)量檢驗(yàn)
[0137] 按上述工藝制備的抗呼吸道合胞病毒(RSV)人免疫球蛋白，其質(zhì)量檢驗(yàn)如下表4。 [0138]表4.抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白檢驗(yàn)報(bào)告書
[0141]
[0142] 通過表4可以看出抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，各項(xiàng)指標(biāo)均符合國家規(guī)定的 標(biāo)準(zhǔn)，并且具有特異性好、安全、可靠等優(yōu)點(diǎn)。具體使用時(shí)，可以采用靜注或其他適合方式。
[0143] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，其特征在于，呼吸道合胞病毒中和抗體效價(jià) 大于等于1:900。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球 蛋白與正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀線為IgG。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，其特征在于，免疫球蛋白 的純度為總蛋白的99%~99.8%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球 蛋白的單體和二聚體之和達(dá)到99%~99.8%，PKA < 30IU/mL，ACA < 45%。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，其特征在于，原料血漿為 呼吸道合胞病毒抗體效價(jià)不低于1:200的血漿。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，其特征在于， 劑型為液體制劑或凍干制劑。7. -種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 用中和試驗(yàn)法篩選出呼吸道合胞病毒不低于1:200的中和抗體效價(jià)滴度的原料血 漿； 2) 以篩選后的所述血漿原料制備混合血漿供試品，所述混合血漿中呼吸道合胞病毒中 和抗體效價(jià)滴度不低于1:500; 3) 將所述混合血漿供試品采用低溫乙醇壓濾法分離結(jié)合層析法純化生產(chǎn)人免疫球蛋 白，生產(chǎn)操作壓力為0.1~0.2MPa，包括從血漿中分離組分II+111沉淀、從組分II+111中分 離組分II、層析、超濾、病毒滅活、配置、分裝得到成品。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制備方法，其特征在于，步 驟(1)所述中和試驗(yàn)法具體步驟包括如下： (A) 樣品稀釋： 血漿樣本用細(xì)胞維持液預(yù)先進(jìn)行1:4預(yù)稀釋后，56°C滅活30分鐘，后繼續(xù)10倍稀釋，即 最終1:40倍稀釋的樣品液； 打開足夠量的96孔細(xì)胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗(yàn)板，并在各樣品試驗(yàn)板蓋上 標(biāo)明該板試驗(yàn)樣本號、病毒性型號和代次； 在樣品試驗(yàn)板的各樣品孔中加入40yL細(xì)胞維持液，病毒回滴孔與陰性對照孔加入50yL 細(xì)胞維持液； 將預(yù)先滅活的樣品液分別加入到96孔細(xì)胞板的相應(yīng)位置，每孔加樣品10yL，每樣品作 豎向兩孔平行;所述細(xì)胞維持液為體積比為3%的胎牛血清的MEM液； (B) 攻擊病毒： 攻擊病毒液制備:根據(jù)試驗(yàn)的標(biāo)本數(shù)用維持液制備足量的攻擊病毒液，將病毒稀釋到 100CCID5Q/0.05mL;除病毒回滴孔與陰性對照孔外，其余各孔中均加入50yL含100CCID5〇的 攻擊病毒液； 回滴100CCID5Q攻擊病毒液：用細(xì)胞維持液將攻擊病毒液作1〇4、1〇4、1(^3稀釋，將攻擊 病毒液10°與其10'1〇_2、1〇_3稀釋度的病毒液加入到相應(yīng)的病毒回滴用96孔細(xì)胞板孔中， 每個(gè)稀釋度加10孔，50μLν孔； 陰性對照：向陰性對照各孔中再加入50yL細(xì)胞維持液;將所有96孔細(xì)胞板放入37 °C、含 有C02體積百分?jǐn)?shù)為5 %的培養(yǎng)箱中和培養(yǎng)2小時(shí)； (C) 細(xì)胞懸液的配制與添加： 細(xì)胞懸液的配制：取足夠量的Vero細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，稀釋至試驗(yàn)所需的細(xì)胞液量，試 驗(yàn)用細(xì)胞懸液濃度應(yīng)為1 X 1〇5個(gè)/mL，配好的細(xì)胞液立即使用； 細(xì)胞懸加：中和培養(yǎng)后每孔加細(xì)胞懸液l〇〇yL，約1 X 104個(gè)/孔； (D) 培養(yǎng)及觀察統(tǒng)計(jì)： 將完成以上操作的96孔細(xì)胞板放置37°C、含有C02體積百分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 天，病毒接種后的第5天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，第7天最終判定結(jié)果，并記錄統(tǒng)計(jì)。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制備方法，其特征在于，步 驟(3)所述免疫球蛋白制備具體步驟包括如下： (A) 從血漿中分離組分II + III:將冷凍血漿在溫度在1~4°C之間融化，離心去冷沉淀， 用pH值為4.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)血漿pH值到7.0~7.4，加入乙醇使血漿中乙醇的最終濃度 為7 %~11 %，使反應(yīng)液的最終溫度為-1~-3°C，離心分離組分I，調(diào)節(jié)組分I上清液的pH到 5.9~6.0，加入乙醇使血漿中乙醇的濃度從8%達(dá)到20%，使反應(yīng)液的最終溫度控制在-2.0 °C~_4.0°C，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過濾，過濾后的清液入另一個(gè)反應(yīng)罐，過濾完成時(shí)用壓縮空 氣將壓濾機(jī)吹干，打開壓濾機(jī)，收取組分II+III沉淀； (B) 將上一步加壓過濾后的組分II + III沉淀用加入4~6倍量預(yù)冷的注射用水溶解，使 反應(yīng)溫度控制在〇~2.0°C，調(diào)節(jié)制品的pH值為5.10~5.20，加入乙醇使血漿中乙醇的濃度 達(dá)到18%，反應(yīng)液溫度最終控制在-4.5°C~-5.5°C，用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過濾分離組分III上 清液； 將組分III上清液中調(diào)節(jié)pH值為7.3~7.5，每升溶液補(bǔ)加2.8g氯化鈉以提高反應(yīng)液離 子強(qiáng)度;加入乙醇使反應(yīng)液乙醇的最終濃度為25%，在加入乙醇過程中，冷卻反應(yīng)液，使其 最終溫度為-9.0°C~-11.0°C，繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)，靜置1小時(shí)后用壓濾機(jī)進(jìn)行加壓過濾，過 濾后的清液做回收乙醇處理，過濾完成時(shí)用壓縮空氣將壓濾機(jī)吹干，打開壓濾機(jī)，收取組分 II沉淀，組分II沉淀即為呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的粗制品； (C) 將上一步加壓過濾后的組分II用0~2°C注射用水溶解5~8小時(shí)，溶解溫度控制在0 。(:~2.0。。； 將充分溶解的組分Π 過濾澄清，調(diào)節(jié)溶液的pH值至6.40~6.80之間，并調(diào)節(jié)溶液的電 導(dǎo)為 1 · 30~1 · 50ms/m; 采用陰離子交換層析介質(zhì)二乙氨乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠裝填層析柱；用AKTA-process層 析系統(tǒng)控制進(jìn)液流速，將層析柱用pH值為6.40~6.80的0.03M磷酸鹽緩沖液平衡至出液的 pH值為6.40~6.80后上樣，上樣壓力不超過1.5kg/cm，收集流出的蛋白峰，上樣結(jié)束后，用 pH值為6.40~6.80的磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠上的殘余蛋白，合并濾過液和后頂液稱重，調(diào) 節(jié)溶液pH至3.70~4.00，將調(diào)整好的蛋白液通過轉(zhuǎn)接管道抽至清潔的反應(yīng)罐中； (D) 啟動(dòng)超濾器，開始初濃縮，控制溫度在2 °C~6.0 °C之間，蛋白濃度達(dá)到5 %~8 % (g/ mL)時(shí)，加入2.0°C~6.0°C注射用水，使液蛋白濃度在2 %~5 %并進(jìn)行恒體積超濾透析脫 鹽，超濾透析過程中蛋白液體積保持恒定;透析過程中保持蛋白液pH在3.70~4.00;透析結(jié) 束后停止加水，將制品濃縮至蛋白濃度達(dá)8 %以上，用2.0 °C~8.0 °C注射用水頂洗超濾系 統(tǒng)，將頂洗液合并入超濾罐中； (E) 向超濾濃縮后的蛋白液加入麥芽糖，補(bǔ)加注射用水，調(diào)整濃縮后蛋白液的pH值為 3.8~4.4，使最終制品中免疫球蛋白含量為50~55g/L，麥芽糖含量為8%~11 % (g/mL)，抗 體效價(jià)不低于1:900，用0.22um的濾膜除菌過濾，進(jìn)行低pH孵育法使制品保持在21°C~25°C 下21天進(jìn)行病毒滅活； (F) 在滅菌滅活結(jié)束后，通過原液送樣檢測蛋白含量，向藥液中加入注射用水稀釋藥液 的最終蛋白濃度為53g/L，再用納米膜過濾法進(jìn)行病毒去除處理，然后進(jìn)行除菌分裝即得成 品抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制備方法，其特征在于， 在加壓過濾時(shí)，加入1%~2%(g/mL)的娃藻土做助濾劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法，呼吸道合胞病毒中和抗體效價(jià)大于等于1:900。該制備方法包括：(1)篩選出呼吸道合胞病毒中和抗體效價(jià)不低于1:200的特免血漿；(2)將篩選出的高效特免血漿混合；(3)將上述混合血漿采用低溫乙醇壓濾法分離并結(jié)離子交換層析法純化分離免疫球蛋白組分Ⅱ，經(jīng)過濾、層析、超濾、配制、低pH孵放滅活病毒、納米膜過濾去除病毒、分裝得到純度98％～100％的免疫球蛋白。該制備和生產(chǎn)方法得到的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白抗體效價(jià)、純度和回收率高，可以針對性的呼吸道合胞病毒進(jìn)行治療，具有安全、有效等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C07K1/34, C07K1/36, C07K16/10, C07K1/18
【公開號】CN105601736
【申請?zhí)枴緾N201610060348
【發(fā)明人】孫婷, 楊金平, 李常祿, 于引航, 陳東明, 楊莉, 孫曉東, 閆磊
【申請人】哈爾濱派斯菲科生物制藥股份有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月28日