Lim2基因在檢測先天性ccmc中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因診斷與產(chǎn)前基因診斷的相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及晶狀體內(nèi)膜蛋白 2化IM2)在制備檢測先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征(CCMC)基因診斷制品中的應(yīng)用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 先天性白內(nèi)障是導(dǎo)致兒童低視力和致盲的常見眼病，發(fā)病率約為0.01 %~ 0.06%，其中約50%與遺傳有關(guān)，其遺傳方式W常染色體顯性遺傳最為常見。先天性白內(nèi)障 可獨(dú)立發(fā)生，也可作為眼部或全身綜合征的伴發(fā)癥狀，其中12%-18%的先天性白內(nèi)障患者 常發(fā)生合并小角膜癥狀。白內(nèi)障-小角膜綜合征（Cataract-microcornea syn化ome, CCMC, OMIM 116200)是一種先天發(fā)育異常性眼病，常累及雙眼，表現(xiàn)為不同表型的白內(nèi)障及角膜 橫徑小于10mm，常伴發(fā)眼前節(jié)發(fā)育不良，如虹膜缺損、Peters異常、瞳孔異位及眼球震顫等， 運(yùn)些多發(fā)崎形常使大多數(shù)患者喪失視力，是先天性致盲的重要原因之一。并且和單純先天 性白內(nèi)障相比，伴發(fā)小角膜的患者更易患青光眼，并造成不可逆轉(zhuǎn)的視覺損害。目前對于 CCMC治療手段有限、致盲率很高，給全社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0004] 先天性CCMC的病因及病理機(jī)制尚不清楚，目前世界上研究較少。國內(nèi)外的遺傳學(xué) 研究結(jié)果表明該病很大程度上是由于遺傳因素導(dǎo)致的。迄今為止，已有7個致病基因被證實(shí) (詳見表1)。
[0005] 表1:白內(nèi)障-小角膜綜合征致病基因定位及克隆情況
[0007] CCMC具有顯著的遺傳異質(zhì)性，存在多個候選致病基因。到目前為止對CCMC的致病 基因的了解仍然有限，迄今為止7個已知基因僅能解釋不到30%的患者的發(fā)病。運(yùn)已經(jīng)成為 CCMC的發(fā)病機(jī)制的研究W及針對病因的診斷和治療研究的瓶頸。運(yùn)種現(xiàn)狀促使進(jìn)一步去發(fā) 現(xiàn)和了解該病新的致病基因，為后續(xù)的基因診斷、產(chǎn)前診斷及基因治療提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是提供一種LIM2基因在制備檢測先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征 (CCMC)診斷制品中的應(yīng)用，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0009] 申請人發(fā)現(xiàn)了一個3代呈常染色體顯性遺傳的CCMC家系，經(jīng)過候選基因測序，排除 了已知的7個候選基因突變致病的可能；同時，進(jìn)一步對該家系的核屯、成員進(jìn)行了外顯子組 測序，找到了該家系的致病基因晶狀體內(nèi)膜蛋白2(LIM2)，從而促成了本發(fā)明。
[0010] 本發(fā)明首先提供LIM2基因新的用途，是在制備用于檢測先天性白內(nèi)障-小角膜綜 合征(CCMC)診斷制品中的應(yīng)用；
[0011] 本發(fā)明還提供一種用于檢測先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征(CCMC)的引物對，所述 的引物對的上下游引物序列為SEQ ID N0:l-10,其引物信息如下： UM2-1L： AGGGATTTGGGGAACCTAAG SEQ ID NO: 1 L1M2-1 民? AAGGAGCTGGGACCCTAGAC SEQ ID N0.2 LIM2-2：L; A拉TTCCTCCCTTCAAGTCCC SEQIDNQ:3 LIM2-2民;GAA平ACAGGTGTCCTTGOGC SEQIDNO:4 LIM2-3L： TCATCTCAGAGGTAGCAGCATC St QTD NO:5
[0012] LIM2-3民;CAGATTGGGGTTTGAGATGAG SEQ ID NO:6 LIM2-4L,： ACCTCCAAAATCACACCCAG SEQ …NO:7 LIM2-4及;TGGGACACCCTGTCATCTTC SEQ ID NO:8 LIM2-5L： AGAGTAGGGTGTTGGGCTCTC SEQ TD NO;9 LIM2-SR： GACGACGCTTACAGCTGTTTC SEQ ID NO: 10
[0013] 本發(fā)明還提供一種用于檢測先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征(CCMC)的試劑盒，包含 有上述的引物對中的任一種或幾種。
[0014] 本發(fā)明還提供一種與先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征(CCMC)疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)，為 LIM2基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第68位，其堿基為T或G;
[0015] 本發(fā)明提供了 LIM2基因的新的用途，從而提供了一種有效的進(jìn)行先天性CCMC疾病 基因診斷、產(chǎn)前基因篩查及遺傳咨詢的途徑，應(yīng)用效果表明本發(fā)明所提供的基因的SNP位點(diǎn) 及檢測引物可W有效的用于臨床患者及胎兒絨毛或羊水進(jìn)行LIM2基因突變位點(diǎn)的快速檢 測。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明的申請人在一個先天性的CCMC家系中發(fā)現(xiàn)LIM2基因的突變位點(diǎn)從而促成 了本發(fā)明。
[0017] LIM2基因由8052個核巧酸堿基組成，位于19ql3.41，可轉(zhuǎn)錄成大約87加 P的mRNA (NM_001161748.1 )，直接翻譯形成173個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0019] 實(shí)施例1:從先天性CCMC家系中篩選LIM2基因的突變位點(diǎn)
[0020] 1、提取外周血基因組DNA:
[0021] 在符合國家相關(guān)政策規(guī)定，并在取樣對象同意的基礎(chǔ)上，抽取第一個家系成員外 周靜脈血2-5ml，放入抓TA抗凝管內(nèi)，-80°C凍存?zhèn)溆?；凍存的抓TA抗凝血在室溫融化后，取 SOOiiL放于離屯、管，加入等體積TE(p冊.0)，混勻，4°C，10000巧m離屯、10分鐘，棄上清。
[0022] 加入180化TE、20化SDS(l〇%)、如L蛋白酶K(l〇mg/ml)混勻，置于37°C水浴過夜。 從水浴中取出樣品，瞬時離屯、沉淀樣本。在反應(yīng)管中加入等體積的Tris-飽和酪(約30化L)， 充分混勻，室溫下l〇〇(K)rpm離屯、10分鐘，吸取上清液(約30化L)至一新離屯、管中。重復(fù)酪抽 提一次，吸取上清液至一新離屯、管中。
[0023] 加入等體積的Tris飽和酪:氯仿混合液(酪、氯仿各15化L)，混勻，室溫100(K)rpm離 屯、10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離屯、管。
[0024] 加入等體積的Tris飽和酪:氯仿:異戊醇混合液(酪、氯仿、異戊醇各10化L)，混勻， 室溫1000化pm離屯、10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離屯、管。
[00巧]加入1/10體積3mol/L、p冊.2醋酸鋼（約30化），2倍體積預(yù)冷100 %乙醇，輕輕混合， 可見白色絮狀沉淀。室溫1000化pm離屯、10分鐘，使DNA沉淀于管底，棄上清。
[00%] 向DNA沉淀加入70 %乙醇，漂洗一次，室溫7000巧m離屯、5分鐘，棄上清，置于室溫中 揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50化TE(p冊.0)，4°C過夜溶解DNA。
[0027]對提取的DNA行瓊脂糖膠電泳，并應(yīng)用紫外分光光度計在260nm和28化m比色，檢測 DNA純度及濃度。
[002引 2.外顯子組測序:外顯子組測序化xome Sequencing)是一種新型的基因組分析技 術(shù)，只需針對全基因外顯子(exon)區(qū)域的DNA即可，取該家系中3名患者的基因組DNA，由深 圳華大基因科技有限公司應(yīng)用NimbleGen(44Mb)target enrichment system收集人類基因 組的外顯子區(qū)域，應(yīng)用Illumina Genome Analyzer II平臺對富集的外顯子文庫進(jìn)行 111皿ina GA高通量測序，共捕獲了18357個目的基因中的18283(99.6%)個。將運(yùn)些突變?yōu)V 過4個正常人數(shù)據(jù)庫:單核巧酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(化SNP 129,http: //www.ncbi .nlm. nih. gov/ pro jects/SNP/sw_summary. Cgi/),千人基因組計劃（February 28,2011 releases for SNPs,and February 16,2011 releases for indels http://www.1000genome.org/), HapmapS數(shù)據(jù)庫化ttp: //hapmap.ncbi .nlm.nih. gov/),及炎黃數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步篩選出3名患 者共有的非同義未知突變位點(diǎn)128個，應(yīng)用直接測序法在該家系內(nèi)篩選到與致病單倍體型 共分離的致病基因 LIM2,并在200例正常當(dāng)?shù)厝巳和庵苎蚪MDNA樣本中進(jìn)行該位點(diǎn)的突 變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。
[0029] 3.直接測序法驗(yàn)證該家系內(nèi)患者LIM2基因的突變
[0030] PCR擴(kuò)增目的片段:反應(yīng)條件與反應(yīng)體系：
[0031] (1化〔1?反應(yīng)條件：94。[3111111;94。[4036。，55±2。[4036,72。[6036。，30-35。7。163; 72°C10min。
[0032] (2)反應(yīng)體系：（TAKARA LA !"aq polymerase) 2 X GC buffer I 或 n 巧叫 2.SmMdNTP 8如 UM2-2L 引鞠 （AGTTCCTCCCTTCAAGTCCC ) (10pmol/|ii) 2 Jil UM2-2R 引物（（I \ATACAGGTGTCCTTGGGC)
[0033] (10pmol/|il) 2川 LAtaqpolynierase. 0.5jj.l 基園組說JA模板（縱ngM) Ijil 抓三 O_ll.Sul Total 50jil
[0034] 應(yīng)用該反應(yīng)體系分別進(jìn)行每名家系成員的基因組DM模板與該LIM2引物的擴(kuò)增反 應(yīng)。
[0035] PCR產(chǎn)物測序:應(yīng)用常規(guī)Sanger測序法對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，該家系中S名患 者的LIM2基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第68個堿基發(fā)生了雜合突變，由T突變?yōu)镚，引起 LIM2蛋白第23位由甲硫氨酸突變?yōu)榫彼?，?yīng)用點(diǎn)突變預(yù)測程序SIFT (Sorting Intolerant Rrom Tolerant)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該突變導(dǎo)致了LIM2蛋白功能"damaging"級的損壞， 從而引起了該家系中CCMC的發(fā)生。多次測序結(jié)果表明該突變位點(diǎn)并不是因?yàn)閿U(kuò)增或測序錯 誤引進(jìn)的。在200例正常當(dāng)?shù)厝巳杭霸摷蚁抵姓Ｈ说耐庵苎蚪MDNA樣本中進(jìn)行該位點(diǎn) 的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。
[0036] 上述結(jié)果表明LIM2基因可W用來檢測患者是否具有潛在患CCMC的危險。通過將檢 測者的LIM2基因的各外顯子片段于正常的對應(yīng)片段比較，確定待檢測者的患病風(fēng)險。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種LIM2基因的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用是在制備用于檢測先天性白內(nèi)障-小 角膜綜合征的診斷制品中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的診斷制品為PCR檢測引物。3. -種用于檢測先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征的引物對，所述的引物對的信息如下：4. 一種用于檢測先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征的試劑盒，包含有權(quán)利要求3所述的引物 對中的任一種或幾種。5. -種與先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)，所述的SNP位點(diǎn)為UM2基 因編碼區(qū)域由起始密碼子起第68位，其堿基為T或G。6. -種檢測權(quán)利要求5所述的SNP位點(diǎn)的方法，其特征在于，是用權(quán)利要求3所述的引物 對中的任一種或幾種來進(jìn)行檢測。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種LIM2基因在制備檢測先天性白內(nèi)障-小角膜綜合征(CCMC)診斷制品中的應(yīng)用，本發(fā)明提供了LIM2基因的新的用途，從而提供了一種有效的進(jìn)行先天性CCMC疾病基因診斷、產(chǎn)前基因篩查及遺傳咨詢的途徑，應(yīng)用效果表明本發(fā)明所提供的基因的SNP位點(diǎn)及檢測引物可以有效的用于臨床患者及胎兒絨毛或羊水進(jìn)行LIM2基因突變位點(diǎn)的快速檢測。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105603114
【申請?zhí)枴緾N201610191700
【發(fā)明人】代云海, 陳鵬, 王殿強(qiáng), 郝曉丹
【申請人】山東省眼科研究所
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年3月30日