一類(lèi)新型的諾西肽衍生物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一類(lèi)新型的諾西肽衍生物1、2和3,這類(lèi)化合物具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)或殺 死細(xì)菌的作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)隨著耐藥菌感染的不斷蔓延，現(xiàn)有的抗生素已經(jīng)無(wú)法滿足需求，因此開(kāi)發(fā) 結(jié)構(gòu)新穎、抗耐藥菌活性強(qiáng)的新型抗生素迫在眉睫。
[0003]諾西肽（Nosiheptide)是一種由活躍鏈霉菌Streptomyces aetuosus ATCC25421、 Streptomyces sp.ATCC31463、Streptomyces glaucoghseus NRRL LL-BP189產(chǎn)生的具有抗 菌活性的硫肽類(lèi)化合物。但是諾西肽的水溶性極大地限制了其應(yīng)用。目前諾西肽僅用作為 一種新型的非吸收性動(dòng)物飼料添加劑，適合于抑制腸道內(nèi)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的生長(zhǎng)。
[0004] 諾西肽是由nosM編碼的前體肽經(jīng)過(guò)翻譯后修飾合成的。前體肽由37個(gè)氨基酸構(gòu)成 的前導(dǎo)肽和13個(gè)氨基酸構(gòu)成的核心肽構(gòu)成。改變諾西肽核心肽基因?qū)⒅苯痈淖冏罱K產(chǎn)物的 結(jié)構(gòu)，這為產(chǎn)生新型的具有良好水溶性及抗菌活性的諾西肽衍生物打下了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，公開(kāi)了一類(lèi)新型的諾西肽衍生物，該類(lèi)衍生物在上述 文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道，具有抗菌活性。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案具體如下： 具有下式結(jié)構(gòu)的諾西肽類(lèi)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu) 體或混合物：
其中，R為 CH3、CH2〇H或 CH(CH3)2。
[0007] 具體的，上述的諾西肽類(lèi)衍生物優(yōu)選如下結(jié)構(gòu)的化合物： 化合物1
化合物3 d
本發(fā)明還提供了上述諾西肽類(lèi)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映 異構(gòu)體或混合物在制備抑菌或抗菌藥物中的應(yīng)用。
[0008] 上述諾西肽衍生物通過(guò)重組技術(shù)表達(dá)制備。通過(guò)定向改變諾西肽基因 nosM核心肽 序列得到。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物1的HPLC色譜圖。
[0010] 圖2為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物1的高分辨質(zhì)譜圖。
[0011] 圖3為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物1的核磁共振氫譜圖。
[0012] 圖4為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物1的核磁共振碳譜圖。
[0013] 圖5為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物2的HPLC色譜圖。
[0014] 圖6為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物2的高分辨質(zhì)譜圖。
[0015] 圖7為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物2的核磁共振氫譜圖。
[0016] 圖8為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物2的核磁共振碳譜圖。
[0017] 圖9為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物3的HPLC色譜圖。
[0018] 圖10為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物3的高分辨質(zhì)譜圖。
[0019] 圖11為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物3的核磁共振氫譜圖。
[0020] 圖12為本發(fā)明所述諾西肽衍生物化合物3的核磁共振碳譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 以下實(shí)施例中所述斜面培養(yǎng)基、遺傳操作培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下： 斜面培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基 遺傳操作培養(yǎng)基：ISP1培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基：（g/L):酵母提取物3 . Og，玉米淀粉10 . Og，黃豆餅粉20 . Og，KN032 . Og， 〇&0)34.(^，恥(：14.(^，？!17.0，121。(：滅菌3〇11^11。
[0023] 工程菌株T3A，T3S和T3V的構(gòu)建。根據(jù)GenBank公布的諾西肽生物合成基因簇序列， 設(shè)計(jì)上下游引物，以活躍鏈霉菌基因組為模板，通過(guò)定點(diǎn)突變PCR技術(shù)擴(kuò)增出含nosM上下游 同源臂的下列nosM基因突變序列： (1) nosM基因第118位A堿基突變?yōu)镚堿基的基因片段； (2) nosM基因第118位A堿基突變?yōu)門(mén)堿基的基因片段； (3) nosM基因第118位A堿基和119位的C堿基分別突變?yōu)镚堿基和T堿基的基因片段。
[0024] 根據(jù)上述3種基因序列分別設(shè)計(jì)下述3組引物用于相應(yīng)的基因擴(kuò)增(下劃線為限制 酶切位點(diǎn)），分別獲得含目的突變基因的大小為2375bp的目的片段： (1)nosM-hF:5 '-GGATCCACCAGGCTCACCAGCTCGGCGGAGA-3' BamHI;(SEQ ID No:1) nosM-hR:5'-AAGCTTTCCTCGCGGGGGATGCCGTCGAACA-3'HindllI;(SEQ ID No:2) T3A-A:5 '-ACTCGCAGGTGGCGCACGAGGCCGACATGAC-3 '；（SEQ ID No:3) T3A-B:5 '-GTCATGTCGGCCTCGTGCGCCGCCTGCGAGT-3 '。（SEQ ID No:4)
[0025] (2)nosM-hF:5'-GGATCCACCAGGCTCACCAGCTCGGCGGAGA-3'BamHI;(SEQ ID No:l) nosM-hR:5'-AAGCTTTCCTCGCGGGGGATGCCGTCGAACA-3'HindllI;(SEQ ID No:2) T3S-A:5 '-CAGCACTCGCAGGTGGAGCACGAGGCCGACA-3 '；（SEQ ID No:5) T3S-B:5 '-TGTCGGCCTCGTGCTCCACCTGCGAGTGCTG-3 '。（SEQ ID No:6)
[0026] (3)nosM-hF:5'-GGATCCACCAGGCTCACCAGCTCGGCGGAGA-3'BamHI;(SEQ ID No:l) nosM-hR:5'-AAGCTTTCCTCGCGGGGGATGCCGTCGAACA-3'HindllI;(SEQ ID No:2) T3V-A:5 '-CAGCACTCGCAGGTGACGCACGAGGCCGACA-3 '；（SEQ ID No:7) T3V-B:5 '-TGTCGGCCTCGTGCGTCACCTGCGAGTGCTG-3 '。（SEQ ID No:8)
[0027] 分別將目的基因測(cè)序正確后雙酶切后連接至溫度敏感型質(zhì)粒pKCl 139得到重組質(zhì) 粒。然后再通過(guò)屬間接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入nosM缺失菌株L1000的活躍鏈霉菌，抗生素篩 選獲得nosM突變菌株T3A、T3S和T3V，分別對(duì)應(yīng)nosM基因第118位A堿基突變?yōu)镚堿基(核心肽 第三位蘇氨酸突變?yōu)楸彼幔?、T堿基(核心肽第三位蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸)和第118位A堿基 及119位的C堿基分別突變?yōu)镚堿基和T堿基(核心肽第三位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸)的的菌株。 [0028]工程菌的培養(yǎng)和發(fā)酵 將上述3種突變菌株T3A、T3S和T3V分別從凍干管中接種至MS培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)2天 后，轉(zhuǎn)入裝入經(jīng)121°C高壓滅菌在30min的ISP1培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其 中，轉(zhuǎn)速為220rpm，溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為20h。然后，將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng) 基的三角瓶中，轉(zhuǎn)種量為10 %，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為220rpm，溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為 120h〇
[0029]表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 將上述三種突變菌株T3A、T3S和T3V經(jīng)發(fā)酵后的發(fā)酵液，分別按照體積比1:1的比例加 入乙酸乙酯萃取4-8h，攪拌轉(zhuǎn)速為200-800rpm/min。棄下層，將上層乙酸乙酯萃取液進(jìn)行減 壓旋蒸，然后按照1:1的比例加入正己烷，_20°C過(guò)夜，析出的晶體即為粗品。粗品經(jīng)過(guò)3次重 結(jié)晶即得到純品。
[0030] 將上述三種突變菌株T3A、T3S和T3V發(fā)酵液經(jīng)多次重結(jié)晶后制備的純品分別上分 析型液相島津SCL-2010A進(jìn)行分析，條件如下： 分析用柱：Agilent Eclipse Plus C18，100mmX4.6mm，3.5ym 流動(dòng)相：：A:蒸餾水中含0.1 % TFA B:乙腈中含0.1%TFA 梯度：梯度洗脫 0-10min:40%B-55%B;10-15min:55%B ;15-18min:55%B-60%B; 20-23min：40%B； 柱溫:40°C; 流速：lml/min; 波長(zhǎng):330nm; 進(jìn)樣量:20μ1。
[0031] 色譜圖如圖1、圖5和圖9所示，從上述三種突變菌中共各自分離了 1種化合物，分別 命名為化合物1、2、3，其中化合物1從菌株Τ3Α發(fā)酵液中分離得到，化合物2從菌株T3S發(fā)酵液 中分離得到，化合物3從菌株T3V發(fā)酵液中分離得到。
[0032] (1)化合物1結(jié)構(gòu)解析 如圖1所示，目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間在7. lmin左右，純度大于95 %。
[0033]經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)（圖2)，目標(biāo)化合物的精確分子量為1192.1814,分子式為 C51H43N13011S6。進(jìn)一步經(jīng)結(jié)合氫譜（圖3)、碳譜（圖4)及核磁數(shù)據(jù)（表1)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分 析。
[0034]表1化合物1的NMR核磁數(shù)據(jù)

通過(guò)解析，得到了化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下： (2)化合物2：結(jié)作」胛個(gè)/T
如圖5所示，目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間在5.8min左右，純度大于95 %。
[0035]經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)（圖6)，目標(biāo)化合物的精確分子量為1208.1530,分子式為 C51H43N13011S6。進(jìn)一步經(jīng)結(jié)合氫譜（圖7)、碳譜（圖8)及核磁數(shù)據(jù)（表2)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分 析。
[0036]表2化合物2的NMR核磁數(shù)據(jù)
通過(guò)解析，得到了化合物2的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
(3)化合物3結(jié)構(gòu)解析 如圖9所示，目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間在5.3min左右，純度大于95 %。
[0037]經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)（圖10)，目標(biāo)化合物的精確分子量為1220.1735，分子式為 C51H43N13011S6。進(jìn)一步經(jīng)結(jié)合氫譜（圖11)、碳譜（圖12)及核磁數(shù)據(jù)(表3)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分 析。
[0038]表3化合物3的NMR核磁數(shù)據(jù)

通過(guò)解析，得到了化合物3的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下： 化合物丨卜rn
為了對(duì)測(cè)試化合物的抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較，采用倍比稀釋法對(duì)不同測(cè)試菌株的最 低抑菌濃度(MIC)進(jìn)行檢測(cè)。在Mueller-Hinton肉湯培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18-24小時(shí)后，觀察 并記錄細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，進(jìn)而得到最低抑菌濃度(μg/ml)。
[0039] 待測(cè)化合物對(duì)不同的菌株的MIC值如下表所示(單位:μg/ml)，根據(jù)表中的數(shù)值可 知，下列3種化合物具有較強(qiáng)的抑菌作用。
[0040] 表4諾西肽衍生物的抗菌活性分析
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下式結(jié)構(gòu)的諾西膚類(lèi)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽、醋、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異 構(gòu)體或混合物：其中，R為C出、C出OH或CH( C出)2。2. 如權(quán)利要求1所述的諾西膚類(lèi)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽、醋、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì) 映異構(gòu)體或混合物，其特征在于所述化合物具有如下結(jié)構(gòu)式：3. 如權(quán)利要求1所述的諾西膚類(lèi)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽、醋、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì) 映異構(gòu)體或混合物，其特征在于所述化合物具有如下結(jié)構(gòu)式：4. 如權(quán)利要求1所述的諾西膚類(lèi)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽、醋、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì) 映異構(gòu)體或混合物，其特征在于所述化合物具有如下結(jié)構(gòu)式：5. 如權(quán)利要求1-4之一項(xiàng)所述的諾西膚衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽、醋、對(duì)映異構(gòu) 體、非對(duì)映異構(gòu)體或混合物在制備抑菌或抗菌藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)發(fā)明了一類(lèi)新型的諾西肽衍生物，包括諾西肽衍生物1、2和3。這類(lèi)化合物通過(guò)定向改變諾西肽生物生物合成基因簇中nosM基因來(lái)達(dá)到產(chǎn)生新型的具有抗菌活性的諾西肽衍生物。
【IPC分類(lèi)】A61P31/04, C07K5/097, A61K38/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105646650
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】陳依軍, 鄭徐露, 王淑珍
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年3月29日