一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-苯丙酮酸效率提高的重組菌的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-苯丙酮酸效率提高的重組菌，屬于生物技術(shù)領域。
【背景技術(shù)】
[0002] α-苯丙酮酸(ΡΡΑ)有很多應用，可用來合成抗腫瘤藥物的雜環(huán)化合物，可作為抗氧 化劑及促進傷口愈合。目前ΡΡΑ生產(chǎn)主要是化學合成法，這些方法均需經(jīng)過多步反應，對反 應條件有較高要求，易產(chǎn)生有毒有害產(chǎn)物。酶和全細胞生物催化劑越來越多的用于工業(yè)化 生產(chǎn)。
[0003] L-氨基酸脫氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脫氨基，生成相應α-酮酸和氨。 Proteus mirabilis KCTC2566中L-氨基酸脫氨酶具有廣泛的底物特異性，能夠催化脂肪族 和芳香族L-氨基酸，尤其對L-苯丙氨酸具有較高催化活性。
[0004] 全細胞轉(zhuǎn)化相比分離酶具有很多優(yōu)勢，如易制備，更穩(wěn)定，無污染，副產(chǎn)物少。通過 構(gòu)建表達來源于P.mirabilis KCTC2566的脫氨酶基因的大腸桿菌，并以之為全細胞催化劑 轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)PPA，PPA的產(chǎn)量可以達到10.0g/L。但是，這個全細胞催化的氧化脫氨 基反應需要輔酶FAD作為電子載體，F(xiàn)AD的胞內(nèi)再生系統(tǒng)需要多酶催化，效率低；而FAD價格 昂貴，不宜外源添加，因此需要構(gòu)建一種一步再生系統(tǒng)，以促進轉(zhuǎn)化效率。
[0005] 現(xiàn)有的FAD再生系統(tǒng)包括電化學再生、化學再生、酶法再生，這些方法的缺陷是生 成H2O2、酶失活、選擇性低、共底物有毒性等。因此需要一種溫和、簡單、低成本、高效率的FAD 再生方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-苯丙酮酸效率提高的重組菌，通 過加強重組大腸桿菌的輔酶FAD再生系統(tǒng)，從而提高全細胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)苯丙酮酸 的產(chǎn)量和效率。
[0007] 所述重組菌是共表達L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶的大腸桿菌。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述L-氨基酸脫氨酶的基因 aad的核苷酸序列 如SEQ ID N0.1 所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述鹵化酶的基因 rebH的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以表達載體pRSFDuet-l共表達L-氨基酸脫氨酶和鹵 化酶。
[0011 ]在本發(fā)明的一種實施方式中，以大腸桿菌BL21 (DE3)為表達宿主。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組菌的構(gòu)建是通過PCR擴增rebH和aad，克隆 到質(zhì)粒pRSFDuet-l，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRSFDuet-AAD-RebH，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)， 構(gòu)建重組大腸桿菌全細胞催化劑。
[0013] 本發(fā)明還提供一種應用所述重組菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-苯丙酮酸的方法，是將重組菌作為 全細胞催化劑。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，是將L-苯丙氨酸20-30g/L、全細胞催化劑4-6g/L、L-色氨酸l_2g/L，在pH 8.0的0.9%的NaCl溶液中，于36-37°C、200-220rpm轉(zhuǎn)化6-10h。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述是全細胞催化劑的獲得，是將重組菌培養(yǎng)后誘 導其表達L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶，進一步收集重組菌菌體得到。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述是全細胞催化劑的獲得，是將共表達L-氨基酸 脫氨酶和鹵化酶的重組大腸桿菌按1-2%接種量到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，當OD 6q0達 到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG誘導L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶表達，28°C誘導24h后，8，OOOrpm 低溫離心l〇-15min，收集菌體，用20mM Tris_HCl(pH 8.0)緩沖液洗兩遍菌體即得。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，誘導重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蛋白胨 12g/100mL，酵母提取物24g/100mL，甘油4mL/100mL。各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60-80 °C，再加 lOOmL滅菌的 17mmol/L KH2P〇4和72mmol/L K2HPO4的溶液（2.31g的KH2P〇4和 12.54g 的K2HPO4溶于水中，終體積為100mL，高壓滅菌）。
[0018] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明成功實現(xiàn)了大腸桿菌內(nèi)L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶的共 表達，鹵化酶以L-色氨酸為底物催化其加氯的過程消耗FADH 2生成FAD，提高了FAD再生效 率，從而提高了全細胞轉(zhuǎn)化效率，PPA產(chǎn)量可達18.3g/L。此全細胞轉(zhuǎn)化體系的建立，解決了 化學法合成PPA的步驟繁瑣、得率低、污染環(huán)境等問題及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化率低的問 題，實現(xiàn)了無污染、高產(chǎn)率、一步法生產(chǎn)PPA，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎。
【具體實施方式】
[0019] 材料與方法
[0020] 種子培養(yǎng)基:蛋白胨lg，酵母粉0.5g，NaCl lg，自來水定容至100mL。
[0021]發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各組分溶解于1L去離子水中后 高壓滅菌。冷卻到60°C，再加100mL滅菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
[0022] PPA含量測定:將轉(zhuǎn)化體系進行離心，棄上清，離心向細胞中加入100yL L-苯丙氨 酸（lOOmM)，30min后，離心，取上清100yL，加入3mL三氯化鐵，分光光度計測定640nm的吸光 度。
[0023]表1PCR所用引物
[0024]
[0025] 實施例1rebH和aad基因的克隆及重組全細胞催化劑構(gòu)建
[0026] 合成得到aad基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，進一步經(jīng)BamHI和Hind III 雙酶切后，克隆到質(zhì)粒pRSFDuet-1的多克隆1位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRSFDuet-AAD。以 Lechevalieria aerocolonigenes基因組為模板，以rebH_MCS2_S和rebH-MCS2_A為引物， PCR擴增rebH基因，其核苷酸序列如SEQ ID勵.2所示。？0?產(chǎn)物經(jīng)恥61和乂11〇1雙酶切后，克 隆到質(zhì)粒pRSFDuet-AAD的多克隆2位點，構(gòu)建質(zhì)粒pRSFDuet-AAD-RebH。重組質(zhì)粒pRSFDuet-AAD和pRSFDuet-AAD-RebH轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建BL21(pRSFDuet-AADWPBL21 (pRSFDuet-AAD-RebH)。
[0027] 實施例2全細胞催化劑的制備及全細胞轉(zhuǎn)化過程
[0028] 實施例1中的共表達L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶后的重組大腸桿菌接種種子培養(yǎng)基 (含卡納青霉素1〇1^/1)，37°(：，200印111過夜培養(yǎng)。發(fā)酵在50〇1^三角瓶中進行，1%接種量到 50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37v培養(yǎng)，當0D 6QQ達到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG誘導L-氨基酸脫氨酶和 鹵化酶表達，28°C誘導24h后，8，000rpm低溫離心10_15min，收集菌體，用20mM Tris_HCl(pH 8.0)緩沖液洗兩遍菌體即得。
[0029]全細胞轉(zhuǎn)化體系為：將L-苯丙氨酸20-30g/L、全細胞催化劑4-6g/L、L-色氨酸1-2g/L，在pH 8 · 0的0 · 9%NaCl 中，于36-37°C、200-220rpm轉(zhuǎn)化6-1011。121 (pRSFDuet-AAD)和 BL21 (pRSFDuet-AAD-RebH)菌株全細胞轉(zhuǎn)化 PPA 產(chǎn)量分別為10 · Og/L 和18 · 3g/L。
[0030]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-苯丙酮酸效率提高的重組菌，其特征在于，是共表達編碼L-氨基酸 脫氨酶和鹵化酶的基因，加強輔酶FAD再生。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，編碼所述L-氨基酸脫氨酶的基因 aad的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，編碼所述鹵化酶的基因 rebH的核苷酸序 列如SEQ ID NO.2所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，以表達載體pRSFDuet-1共表達L-氨基酸 脫氨酶和鹵化酶，以大腸桿菌BL21(DE3)為表達宿主。5. -種構(gòu)建權(quán)利要求1-4任一所述重組菌的方法，其特征在于，PCR擴增編碼L-氨基酸 脫氨酶和鹵化酶的基因，克隆到質(zhì)粒pRSFDuet-Ι，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRSFDuet-AAD-RebH，重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌。6. -種應用權(quán)利要求1-4任一所述重組菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-苯丙酮酸的方法，其特征在于，將 重組菌作為全細胞催化劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，是將L-苯丙氨酸20-30g/L、全細胞催化劑 4-6g/L、L-色氨酸l-2g/L，在pH 8.0的0.9% 的NaCl溶液中，于36-37°C、200-220rpm轉(zhuǎn)化6-10h〇8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述是全細胞催化劑的獲得，是培養(yǎng)重 組菌使其表達L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶，進一步收集重組菌菌體得到。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將重組大腸桿菌按1-2 %接種量到50mL發(fā) 酵培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，當OD600達到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG誘導L-氨基酸脫氨酶和鹵化 酶表達，28°C誘導24h后，8,000rpm低溫離心10-15min，收集菌體，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液洗兩遍菌體即得。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，誘導重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成 為:蛋白胨12g/100mL，酵母提取物24g/100mL，甘油4mL/100mL;各組分溶解后高壓滅菌，冷 去P到60-80°C，再加 100mL滅菌的 17mmol/L KH2P〇4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-苯丙酮酸效率提高的重組菌，屬于生物技術(shù)領域。本發(fā)明成功實現(xiàn)了大腸桿菌內(nèi)L-氨基酸脫氨酶和鹵化酶的共表達，提高了輔酶再生，PPA的產(chǎn)量可達18.3g/L。此全細胞轉(zhuǎn)化體系的建立，解決了化學法合成PPA的步驟繁瑣、得率低、污染環(huán)境等問題及酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)PPA的轉(zhuǎn)化率低的問題，實現(xiàn)了無污染、高產(chǎn)率、一步法生產(chǎn)PPA，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的理論基礎。
【IPC分類】C12R1/19, C12N15/70, C12P7/40, C12N1/21
【公開號】CN105647846
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】堵國成, 劉龍, 陳堅, 李江華, 侯穎
【申請人】江南大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月5日