一種高靈敏檢測黃曲霉毒素的方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高靈敏檢測黃曲霉毒素的方法及其應用。屬于檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一類由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類含有 二氫呋喃環(huán)結構次級代謝物，是迄今發(fā)現(xiàn)的毒性最強的一類真菌毒素，目前已發(fā)現(xiàn)的有20 多種，在食品中較常見的包括黃曲霉毒素8132、61、62和組等，它們毒性大小的排列順序為 AFTB1>AFTM1>AFTG1>AFTB2>AFTG2。黃曲霉毒素對動物及人體的危害主要是肝臟損害， 可引發(fā)肝炎、肝硬化、肝部壞死、肝癌等疾病，是誘發(fā)惡性腫瘤原發(fā)性肝細胞癌的主要因素 之一。黃曲霉毒素常存在于玉米、谷物、花生及其他堅果中。
[0003] 黃曲霉毒素檢測過程中，由于B1和G1的熒光檢測靈敏度低，通常需要衍生增強熒 光，以提高檢測器對目的物的響應。目前衍生的方法主要有柱前三氟乙酸衍生法和柱后碘 衍生法及光化學衍生法。光化學柱后衍生是目前檢測黃曲霉毒素的最常用方法，柱后光化 學衍生反應原理是利用環(huán)狀化合物在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光這一特性，通過紫外光使流 動相中光解出光子，與AFB1和AFG1分子上的活性雙鍵發(fā)生反應，產(chǎn)生了熒光特性更強且更 穩(wěn)定的物質，解決了 AFB1和AFG1在水溶液中的熒光淬滅現(xiàn)象。
[0004] 國家標準GB/T 18979-2003食品中黃曲霉毒素測定，采用高效液相色譜儀柱后碘 溶液衍生測定黃曲霉毒素的含量，總量檢出限為lyg/kg;國家標準GB/T 5009.23-2006食品 中黃曲霉毒素測定，采用高效液相色譜儀柱前衍生測定黃曲霉毒素的含量，AFB1和AFG1檢 出限為〇.2yg/kg。
[0005] 目前的HPLC測定黃曲霉毒素或者是用柱前衍生或者是柱后衍生結合熒光測定。但 也存在柱前衍生后熒光不穩(wěn)定及附加柱后衍生設備的問題。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單，靈敏度高，檢測時間短的黃曲霉毒素的測 定方法。
[0007] -種高靈敏檢測黃曲霉毒素的方法及其應用，包括以下步驟：
[0008] (1)工作曲線的制作:分別配制黃曲霉毒素 B10.5~200ng/mL、黃曲霉毒素 G10.5~ 100ng/mL的標準溶液，加入一定量的衍生試劑，在紫外燈下照射一定時間進行衍生反應，在 選定色譜條件下進高效液相色譜進行測定，得到黃曲霉毒素回歸方程、相關系數(shù)、相對標準 偏差、回收率。
[0009] (2)樣品提?。?br>[0010] ①對于大米、玉米、小麥、花生、核桃、杏仁及其制品及中藥提取方法為:準確稱取 粉碎均質后的樣品2~5g，精確至O.OOOlg，加入體積分數(shù)為70~80%的乙腈水溶液20~ 50mL，劇烈振蕩lmin，50±2°C水浴超聲提取20~30min，以3500~5000r/min離心5~10min， 取出上層溶液，重復提取2~3次，合并上清液，待用;或者
[0011]②對于醬油、食醋、植物油脂提取方法為:準確稱取5.00~10.00g樣品，加入2~5g NaCl和體積分數(shù)為70~80 %的乙腈水溶液20~50mL，渦旋混合1~3min，定量濾紙過濾，準 確吸取5. OOmL濾液，加入10mL超純水稀釋，混勻，待用。
[0012] ⑶樣品測定
[0013] 取步驟(2)中的提取液，按照步驟(1)進行熒光衍生，在與步驟(1)相同色譜條件進 行HPLC分析，并對照步驟(1)所得的線性回歸方程，計算樣品中黃曲霉毒素的含量。
[0014] 所述的食品樣品中待測黃曲霉毒素包括:黃曲霉毒素 B1、G1。
[0015] 所述的衍生試劑包括三氟乙酸、硝酸、硫酸、鹽酸中之一種，體積百分比濃度為15 ~25%〇
[0016] 所述的紫外燈下照射時間為5~20min。
[0017] 所述的設定的液相色譜條件為:C18色譜柱(4.6mmX 250mm，5. Ομπι)，流動相甲醇-水（45:55)，流速1.〇111171^11，進樣量5(^1^，柱溫箱30°(：。檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長 360nm，發(fā)射波長440nm;高效液相色譜儀(配備焚光檢測器）。
[0018] 本發(fā)明將現(xiàn)行的柱前衍生技術與柱后衍生技術結合，柱前衍生反應在紫外光線照 射下進行，使衍生反應進行的完全且產(chǎn)生的熒光強，衍生產(chǎn)物熒光穩(wěn)定性好，同時又提高了 檢測靈敏度的優(yōu)勢。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0020] 1.本發(fā)明將黃曲霉毒素測定的柱前衍生技術與柱后衍生技術結合，柱前衍生反應 在紫外光線照射下進行，使衍生反應進行的完全且產(chǎn)生的熒光強，衍生產(chǎn)物熒光穩(wěn)定性好， 同時又提高了檢測靈敏度。
[0021] 2.本發(fā)明黃曲霉毒素測定的衍生技術操作簡單，時間短，效果好。
[0022] 3.經(jīng)本衍生后的黃曲霉毒素 B1及G1檢測限可達O.lyg/kg。
[0023] 4.結合高效液相色譜-柱前衍生-熒光檢測器檢測食品中黃曲霉毒素，檢測限低， 靈敏度高，加標回收率高。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步地說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0025] 實施例1利用本發(fā)明檢測花生中黃曲霉毒素的含量，步驟為：
[0026] 1、取適量黃曲霉毒素對照品儲備液，用乙腈稀釋得濃度分別為0.5、10、50、100、 150、200ng/mL的黃曲霉毒素 B1及G1對照品溶液，加入20%的三氟乙酸和在紫外燈下照射 5min后，過0.45m有機濾膜，C18色譜柱(4.6mm X 250mm，5 . Ομπι)，流動相甲醇-水(45 :55; v/ v)，流速1. OmL/min，進樣量50yL，柱溫箱30°C。檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長360nm，發(fā)射 波長440nm;Agilentl200高效液相色譜儀（四元栗，自動進樣器，配備熒光檢測器）。以濃度 為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，相關系數(shù)、相對標準偏差、線 性范圍等見表1，樣品中加標回收率見表2。
[0027]表1黃曲霉毒素的線性方程、相關系數(shù)、相對標準偏差、線性范圍
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[0031] 3、樣品測定:準確稱取粉碎均質后的花生樣品2g，精確至0.0001 g，加入體積分數(shù) 為70 %的乙腈水溶液20mL，劇烈振蕩lmin，50 ± 2°C水浴超聲提取20min，以3500r/min離心 lOmin，取出上層溶液，重復提取2次，合并上清液;衍生條件及色譜條件與步驟1相同條件下 進樣檢測，得出黃曲霉毒素 B1含量為5.41yg/kg，黃曲霉毒素 G1含量為1.49yg/kg。
[0032] 實施例2利用本發(fā)明檢測玉米中黃曲霉毒素的含量，步驟為：
[0033]樣品測定:準確稱取粉碎均質后的玉米樣品3g，精確至0.0001 g，加入體積分數(shù)為 75 %的乙腈水溶液30mL，劇烈振蕩lmin，50 ± 2°C水浴超聲提取25min，以4000r/min離心 8min，取出上層溶液，重復提取3次，合并上清液;衍生條件及色譜條件與實施例1步驟1相同 條件下進樣檢測，得出黃曲霉毒素 B1含量為5.41yg/kg，黃曲霉毒素 G1含量為1.49yg/kg。 [0034]實施例3利用本發(fā)明檢測枸杞中黃曲霉毒素的含量，步驟為：
[0035]樣品測定:準確稱取粉碎均質后的枸杞樣品5g，精確至0.0001 g，加入體積分數(shù)為 80 %的乙腈水溶液50mL，劇烈振蕩lmin，50 ± 2°C水浴超聲提取25min，以5000r/min離心 5min，取出上層溶液，重復提取2次，合并上清液;衍生條件及色譜條件與實施例1步驟1相同 條件下進樣檢測，得出黃曲霉毒素 B1含量為5.41yg/kg，黃曲霉毒素 G1含量為1.49yg/kg。 [0036]實施例4利用本發(fā)明檢測醬油中黃曲霉毒素的含量，步驟為：
[0037] 樣品測定:準確稱取醬油樣品5g，精確至O.OOOlg，加入2g NaCl和體積分數(shù)為70% 的乙腈水溶液50mL，渦旋混合lmin，定量濾紙過濾，準確吸取5.00mL濾液，加入10mL超純水 稀釋，混勻;衍生條件及色譜條件與實施例1步驟1相同條件下進樣檢測，得出黃曲霉毒素 B1 含量為5 · 41yg/kg，黃曲霉毒素 G1含量為1 · 49yg/kg。
[0038]實施例5利用本發(fā)明檢測花生油中黃曲霉毒素的含量，步驟為：
[0039] 樣品測定：準確稱取花生油樣品10g，精確至O.OOOlg，加入5gNaCl和體積分數(shù)為 80 %的乙腈水溶液20mL，渦旋混合lmin，定量濾紙過濾，準確吸取5 . OOmL濾液，加入10mL超 純水稀釋，混勻;衍生條件及色譜條件與實施例1步驟1相同條件下進樣檢測，得出黃曲霉毒 素 B1含量為5.41yg/kg，黃曲霉毒素 G1含量為1.49yg/kg。
[0040] 以上實施例與GB/T 18979-2003食品中黃曲霉毒素測定比較，結果見表3。
[0041] 表3測定結果比較(yR/kR)
[0042]
[0043]
[0044] 表中代表未檢出
[0045] 由表3結果可知：用本發(fā)明微萃取分離凈化方法結合高效液相色譜-在線柱后光化 學衍生-熒光檢測器檢測食品中黃曲霉毒素與GB/T18979-2003測定方法相比，結果一致，但 因處理步驟少，所用時間短，處理成本低，有機溶劑用量少更具優(yōu)勢。
【主權項】
1. 一種高靈敏檢測黃曲霉毒素的方法及其應用，其特征在于該方法包括以下步驟：（1) 工作曲線的制作： 配制黃曲霉毒素 B1及黃曲霉毒素 G1混合標準溶液0.5~200ng/mL，加入一定量的衍生 試劑，在紫外燈下照射一定時間進行衍生反應，在選定色譜條件下進高效液相色譜進行測 定，得到黃曲霉毒素回歸方程、相關系數(shù)、相對標準偏差、回收率。 (2) 樣品提取 ① 對于大米、玉米、小麥、花生、核桃、杏仁及其制品及中藥提取方法為:準確稱取粉碎 均質后的樣品2~5g，精確至0.0001 g，加入體積分數(shù)為70~80 %的乙腈水溶液20~50mL，劇 烈振蕩lmin，50±2°C水浴超聲提取20~30min，以3500~5000r/min離心5~lOmin，取出上 層溶液，重復提取2~3次，合并上清液，待用； ② 對于醬油、食醋、植物油脂提取方法為：準確稱取5.00~10.00g樣品，加入2~5g NaCl和體積分數(shù)為70~80 %的乙腈水溶液20~50mL，渦旋混合1~3min，定量濾紙過濾，準 確吸取5. OOmL濾液，加入10mL超純水稀釋，混勻，待用。 (3) 樣品測定 取步驟（2)中的提取液，按照步驟（1)進行熒光衍生，在與步驟（1)相同色譜條件進行 HPLC分析，并對照步驟(1)所得的線性回歸方程，計算樣品中黃曲霉毒素的含量。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種高靈敏檢測黃曲霉毒素的方法及其應用，其特征在于所 述食品樣品中待測黃曲霉毒素包括:黃曲霉毒素 B1、G1。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種高靈敏檢測黃曲霉毒素的方法及其應用，其特征在于步 驟（1)所述的衍生試劑包括三氟乙酸、硝酸、硫酸、鹽酸中之一種，體積百分比濃度為15~ 25% 〇4. 根據(jù)權利要求1所述的一種高靈敏檢測黃曲霉毒素的方法及其應用，其特征在于所 述的紫外燈下照射時間為5~2 0m i η。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種高靈敏檢測黃曲霉毒素的方法及其應用，其特征在于所 述的設定的液相色譜條件為：C18色譜柱(4 · 6mm X 250mm，5 · Ομπι)，流動相甲醇-水(45: 55)， 流速1. OmL/min，進樣量50yL，柱溫箱30°C。檢測器為熒光檢測器，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長 440nm;高效液相色譜儀(配備熒光檢測器）。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測食品中黃曲霉毒素的新方法，主要將現(xiàn)行黃曲霉毒素的柱前衍生技術與柱后衍生技術結合，柱前衍生反應在紫外光線照射下進行，使衍生反應進行的完全且產(chǎn)生的熒光強，衍生產(chǎn)物熒光穩(wěn)定性好，同時又提高了檢測靈敏度。與現(xiàn)有標準中黃曲霉毒素測定方法相比，該法具有檢測靈敏度高，不需要柱后光衍生設備，重現(xiàn)性好、準確等特點。
【IPC分類】G01N30/06, G01N21/64, G01N30/02
【公開號】CN105651899
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】焦揚, 楊亞玲, 趙嬌
【申請人】云南健牛生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月8日