基于wb條帶灰度值的hiv-1新發(fā)感染的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及新醫(yī)藥技術(shù)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于WB條帶灰度值的HIV-1新發(fā)感染的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫印跡法(Western Blot,WB)是HIV確證的金標(biāo)準(zhǔn)。它利用硝酸纖維試劑膜條上的天然滅活HIV-1新型毒蛋白的分離顆粒和特異性的HIV-2型合成多肽與稀釋的血液或血漿樣本中的抗體結(jié)合。結(jié)合后的特異性抗體再與帶有堿性磷酸酶的羊抗人IgG抗體結(jié)合，加入底物液顯色。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種基于WB條帶灰度值的HIV-1新發(fā)感染的檢測方法。
[0004]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是:利用新加坡MP生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的HIV-1確診試劑盒(HIV blot 2.2,MP Diagnostics，Singapore)對HIV-1 感染者的血楽_/血清HIV-1特異性抗體進行檢測，并對各抗原的條帶進行灰度值分析。具體如下:
[0005]—種基于WB條帶灰度值的HIV-1新發(fā)感染的檢測方法，包括以下步驟:
[0006](I)利用HIV-1確診試劑盒對HIV-1感染者的血漿/血清HIV-1特異性抗體進行檢測，將20ul的感染者血漿加入到事先加有2mL封閉液的孵育槽內(nèi)，置于水平搖床上，以12次/分鐘的速度在室溫下孵育20小時;清洗三遍后，加入酶結(jié)合物，同樣的條件孵育30分鐘，最后再清洗三遍后加入顯色劑處理15分鐘；將硝酸纖維試劑膜條置于濾紙上自然干燥。將檢測結(jié)果掃描成圖像，備用；
[0007](2)選取目標(biāo)區(qū)域:將掃描后的圖像導(dǎo)入灰度值分析軟件，在多條帶分析功能模塊進行灰度值分析，并將數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換;利用矩形方框選取目標(biāo)區(qū)域，框選的范圍包括10個條帶所在的位置，所述的10個條帶分別為:HIV-1膜區(qū)蛋白gp41、gpl20和gpl60，pol區(qū)蛋白口51、口31和口66，以及6八6蛋白口17、口24、口39和口55;
[0008](3)背景區(qū)域的選擇:使用定義框在每一個目的條帶附近定義一個相應(yīng)的具有代表性的背景區(qū)域，然后用鼠標(biāo)同時選中一組目的條帶和其相應(yīng)的背景區(qū)域，使目的條帶與相應(yīng)背景區(qū)域相關(guān)聯(lián)，并依次完成所有目的條帶與其相應(yīng)背景區(qū)域的關(guān)聯(lián)，軟件自動進行背景扣除的計算；
[0009](4)抗體表達(dá)量的計算:用相對灰度值表示抗體表達(dá)量，以扣除背景后的條帶灰度值均值為條帶灰度值，每個樣本利用自身的血清對照條帶灰度值作為自身內(nèi)對照，計算出每個樣本的每個條帶相對灰度值，計算公式為:目的條帶的條帶灰度值均值/血清對照的條帶灰度值均值。
[0010]本發(fā)明只需利用少量的病人血漿/血清樣本即可檢測，操作簡單，成本較低，較易開展。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用到的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的試驗均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0012]試驗材料如下:
[0013]WB檢測試劑盒:新加坡MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司。
[0014]掃描儀:中國惠普有限公司。
[0015]灰度值分析軟件:AlphaViewSoftware。
[0016]實施例1: HIV-1WB確證檢測試驗
[0017]WB確證檢測試驗的方法是:根據(jù)試劑盒說明書，采用隔夜孵育法進行。具體步驟是，將20ul的感染者血漿加入到孵育槽內(nèi)(事先加入了2mL的封閉液)，蓋上蓋子，置于水平搖床上，以12次/分鐘的速度在室溫下孵育20小時。清洗三遍后，加入酶結(jié)合物，同樣的條件孵育30分鐘，最后再清洗三遍后加入顯色劑處理15分鐘。將硝酸纖維試劑膜條置于濾紙上自然干燥，利用惠普公司生產(chǎn)的掃描掃成灰度圖像，備用。洗膜液、封閉液及酶結(jié)合物工作液的配置如下:
[0018]洗膜液:以1:19的比例將20X的濃縮洗膜緩沖液與蒸餾水混合，充分混勻；
[0019]封閉液:以1:9的比例將濃縮樣品稀釋液與蒸餾水混合，每20mL的混合液加入Ig脫脂奶粉，充分混勻；
[0020]酶結(jié)合物工作液:以1:1000的比例稀釋酶結(jié)合物，稀釋液為上述的封閉液。
[0021 ]所有液體均需現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0022]實施例2:WB條帶灰度值分析
[0023]1.選取目標(biāo)區(qū)域:將掃描后的圖像導(dǎo)入AlphaView軟件，在多條帶分析功能(Multiplex Band Analysis)模塊進行灰度值分析，勾選“Invert data”選項。利用矩形方框選取目標(biāo)區(qū)域，框選的范圍包括10個條帶所在的位置。
[0024]2.背景區(qū)域的選擇:在Analysis Tools工具欄中選擇Multiplex Band Analysis中的Bkgrnd—欄，選中 “Mult1-Reg1nal Background”，并使用定義框“Background Reg1nTools”在每一個目的條帶附近定義一個相應(yīng)的具有代表性的背景區(qū)域。然后用鼠標(biāo)同時選中一組目的條帶和其相應(yīng)的背景區(qū)域，點擊“Link Background”按鍵，實現(xiàn)其條帶與相應(yīng)背景區(qū)域的關(guān)聯(lián)。這樣依次完成所有條帶與其相應(yīng)背景區(qū)域的關(guān)聯(lián)，軟件自動進行背景扣除的計算。
[0025]3.抗體表達(dá)量的計算-灰度值:以扣除背景后的條帶灰度值均值(BC average)為其灰度值。每個樣本，利用自身的血清對照條帶灰度值作為自身內(nèi)對照，計算出每個樣本的每個條帶相對灰度值，計算公式如下:目的條帶的BC average/血清對照的BC average。
【主權(quán)項】
1.一種基于WB條帶灰度值的HIV-1新發(fā)感染的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)利用HIV-1確診試劑盒對HIV-1感染者的血漿/血清HIV-1特異性抗體進行檢測，將檢測結(jié)果掃描成圖像，備用； (2)選取目標(biāo)區(qū)域:將掃描后的圖像導(dǎo)入灰度值分析軟件，在多條帶分析功能模塊進行灰度值分析，并將數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換;利用矩形方框選取目標(biāo)區(qū)域，框選的范圍包括10個條帶所在的位置，所述的10個條帶分別為:HIV-1膜區(qū)蛋白gp41、gpl20和gpl60，pol區(qū)蛋白p51、p31和p66，以及GAG蛋白pl7、p24、p39和p55; (3)背景區(qū)域的選擇:使用定義框在每一個目的條帶附近定義一個相應(yīng)的具有代表性的背景區(qū)域，然后用鼠標(biāo)同時選中一組目的條帶和其相應(yīng)的背景區(qū)域，使目的條帶與相應(yīng)背景區(qū)域相關(guān)聯(lián)，并依次完成所有目的條帶與其相應(yīng)背景區(qū)域的關(guān)聯(lián)，軟件自動進行背景扣除的計算； (4)抗體表達(dá)量的計算:用相對灰度值表示抗體表達(dá)量，以扣除背景后的條帶灰度值均值為條帶灰度值，每個樣本利用自身的血清對照條帶灰度值作為自身內(nèi)對照，計算出每個樣本的每個條帶相對灰度值，計算公式為:目的條帶的條帶灰度值均值/血清對照的條帶灰度值均值。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于WB條帶灰度值的HIV-1新發(fā)感染的檢測方法，其特征在于，所述的利用HIV-1確診試劑盒對HIV-1感染者的血漿/血清HIV-1特異性抗體進行檢測的具體步驟為: 將20ul的感染者血漿加入到事先加有2mL封閉液的孵育槽內(nèi)，置于水平搖床上，以12次/分鐘的速度在室溫下孵育20小時;清洗三遍后，加入酶結(jié)合物，同樣的條件孵育30分鐘，最后再清洗三遍后加入顯色劑處理15分鐘;將硝酸纖維試劑膜條置于濾紙上自然干燥。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于WB條帶灰度值的HIV-1新發(fā)感染的檢測方法，對HIV-1感染者的血漿/血清HIV-1特異性抗體進行檢測，將結(jié)果掃描成圖像，導(dǎo)入灰度值分析軟件進行灰度值分析，并將數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換；利用矩形方框選取目標(biāo)區(qū)域，使用定義框在目的條帶附近定義背景區(qū)域，同時選中一組目的條帶和其相應(yīng)的背景區(qū)域，依次完成所有目的條帶與其相應(yīng)背景區(qū)域的關(guān)聯(lián)，軟件進行背景扣除后的條帶灰度值均值為條帶灰度值；利用自身的血清對照條帶灰度值作為自身內(nèi)對照，計算出每個樣本的每個條帶相對灰度值。本發(fā)明只需利用少量的病人血漿/血清樣本即可檢測，操作簡單，成本較低，較易開展。
【IPC分類】G06F19/00, G01N33/569
【公開號】CN105651997
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】梁浩, 葉力, 黃頡剛, 蔣俊俊, 王敏連, 梁冰玉, 臧寧, 廖艷研, 周波, 王洪, 陳榮鳳, 劉潔
【申請人】廣西醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月2日