microRNA-22在毛發(fā)發(fā)育和雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及microRNA的應(yīng)用，具體地說(shuō)，設(shè)及microRNA-22在毛發(fā)發(fā)育和雄激素 誘導(dǎo)脫發(fā)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 病理性脫發(fā)是指頭發(fā)異常或過(guò)度的脫落。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在人一生中60-70%的人都會(huì)經(jīng) 歷過(guò)度脫發(fā)的煩惱。年齡、激素、紫外線和化學(xué)刺激等因素都會(huì)造成脫發(fā)。病理性脫發(fā)中最 常見(jiàn)的是雄激素誘導(dǎo)的脫發(fā)，稱為雄激素源性脫發(fā)（AGA)。正常情況下，人85%-90%頭發(fā) 處于生長(zhǎng)期，不會(huì)脫落，只有少量處于靜止期的毛發(fā)脫落下來(lái)。通常進(jìn)入靜止期與新進(jìn)入生 長(zhǎng)期的毛發(fā)不斷處于動(dòng)態(tài)平衡，故能維持正常數(shù)量的頭發(fā)。雄激素源性脫發(fā)是因?yàn)椴G酬在 5 a-還原酶作用下形成雙氨睪酬值HT)，雙氨睪酬在一定的環(huán)境下可W誘導(dǎo)毛囊從生長(zhǎng)期 進(jìn)入退行期和靜止期，從而抑制頭部和太陽(yáng)穴部位的頭發(fā)生長(zhǎng)導(dǎo)致脫發(fā)。另一方面，DHT也 可W促進(jìn)蔽毛和面毛的生長(zhǎng)，運(yùn)就是雄激素的惇論。在頭部，DHT作用于毛囊的真皮乳頭， 刺激TGF 0 1、TGF 0 2和Dkkl表達(dá)，誘導(dǎo)毛囊從生長(zhǎng)期提前進(jìn)入退化期和靜止期。運(yùn)樣，毛 囊生長(zhǎng)期由正常的數(shù)年變?yōu)槎潭痰臄?shù)周或幾天，導(dǎo)致毛發(fā)脫落。研究表明AGA毛囊干細(xì)胞 數(shù)量沒(méi)有變化，但是活化的增殖的祖細(xì)胞數(shù)量明顯減少。干細(xì)胞的存在使治療脫發(fā)和頭發(fā) 再生成為可能。雄激素受體（AR)的多態(tài)性與AGA密切相關(guān)。然而，雄性激素源性脫發(fā)的分 子機(jī)制至今仍然沒(méi)有完全掲示清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是探索雄性激素源性脫發(fā)的分子 機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了 microRNA-22在毛發(fā)發(fā)育和雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)中的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 陽(yáng)0化]microRNA-22在毛發(fā)發(fā)育和雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)中的應(yīng)用，所述microRNA-22的核巧 酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0006] 進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為雄激素誘導(dǎo)mic;roRNA-22過(guò)表達(dá)，mic;roRNA-22過(guò)表達(dá)誘導(dǎo) 毛發(fā)進(jìn)入退行期而導(dǎo)致毛發(fā)脫落。
[0007] 進(jìn)一步地，所述應(yīng)用為通過(guò)抑制microRNA-22表達(dá)，括抗雄激素 DHT引起的脫發(fā)和 毛發(fā)生長(zhǎng)變慢。
[000引本發(fā)明還提供了 microRNA-22在制備雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)的藥物中的應(yīng)用，具體為提 供一個(gè)具有潛在治療雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)的治療祀點(diǎn)，通過(guò)抑制microRNA-22表達(dá)，括抗雄激 素雙氨睪酬值HT)引起的脫發(fā)和毛發(fā)生長(zhǎng)變慢。
[0009] 本發(fā)明利用雄激素雙氨睪酬誘導(dǎo)脫毛小鼠模型和miR-22敲除小鼠模型證實(shí) miR-22具有介導(dǎo)雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)的方法，具體如下：
[0010] 1)通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得K14-rtTA/miR-22雙轉(zhuǎn)基因小鼠。利用Dox誘導(dǎo)miR-22 過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-22過(guò)表達(dá)可W導(dǎo)致小鼠脫毛。
[0011] 2) H/E染色技術(shù)顯示miR-22過(guò)表達(dá)導(dǎo)致毛發(fā)從生長(zhǎng)期提前進(jìn)入退化期。
[0012] 3)利用免疫組化技術(shù)和化加追蹤技術(shù)證實(shí)miR-22可W抑制毛囊角質(zhì)細(xì)胞的分 化。 陽(yáng)01引 4)利用miR-22基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)miR-22缺失可W延緩毛發(fā)進(jìn)入退化期。
[0014] 5)在雙氨睪酬誘導(dǎo)脫毛的小鼠模型里，miR-22缺失可W顯著加快小鼠的毛發(fā)生 長(zhǎng)。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0016] 本發(fā)明掲示miR-22在毛發(fā)發(fā)育和雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)中的作用機(jī)制，首次公開(kāi)了 miR-22在毛發(fā)發(fā)育和雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)中的應(yīng)用。同時(shí)，首次公開(kāi)了過(guò)表達(dá)miR-22可W誘導(dǎo) 脫毛或敲除miR-22可W括抗雄激素引起脫發(fā)的體內(nèi)研究方法。通過(guò)運(yùn)種方法可W顯著促 進(jìn)在雄激素存在條件下的毛發(fā)生長(zhǎng)，為治療雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)提供了新的解決方案。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中real-time PCR結(jié)果圖。 陽(yáng)0化]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中Dox飼喂K14-rtTA/TRE-miR-22雙陽(yáng)小鼠和K14-rtTA 單陽(yáng)小鼠在49天對(duì)小鼠進(jìn)行的拍照。
[0019] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中毛囊組織結(jié)構(gòu)的顯微鏡拍照。
[0020] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中毛囊組織結(jié)構(gòu)的顯微鏡拍照。
[0021] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)狀況拍照。
【具體實(shí)施方式】
[0022] W下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 實(shí)施例1 Dox在K14rt-TA/TRE-miR-22轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚組織中誘導(dǎo)miR-22表達(dá) 和miR-22的檢測(cè)
[0024] 1.利用含有2克/升Dox的水去飼喂3周齡的K14rt-TA/ 陽(yáng)0巧]TRE-miR-22雙陽(yáng)小鼠，同時(shí)飼喂K14rt-TA或TRE-miR-22單陽(yáng)小鼠作對(duì)照。在4 周時(shí)殺死小鼠取樣。
[0026] 2.處死小鼠后，用去RNase酶的手術(shù)剪刀W及手術(shù)綴子取背部皮膚組織放于經(jīng) DEPC處理的1.5血離屯、管中，向其中加入1血Lysis Binding Buffer,放入勻漿儀勻漿 10-15min，直到組織完全裂解后，再向上述勻漿液中添加100 Ji L HomegenateAdditive,輕 輕振蕩幾次，置于冰上lOmin。
[0027] 3.向上述混合液中添加1血酪仿抽提液，輕輕振蕩Imin，1000 Og離屯、5min，直到 分層。
[0028] 4.將上清液轉(zhuǎn)移至2mL離屯、管中，向其中添加1. 25倍體積的無(wú)水乙醇，充分混勻 后，室溫放置。
[0029] 5.將上述混合液加入到柱子中（每個(gè)柱子每次最多只能加入700 y L)，1000 Og離 屯、15s，棄濾液，重復(fù)本次操作，直到濾過(guò)所有上述混合液。
[0030] 6.向柱子中添加 TOOyL miRNA Wash Solution I，離屯、15s (10, OOOg),棄去濾出 液，并再次向其中加入SOOiiL Wash Solution 2/3, 1000 Og離屯、15s，重復(fù)該操作一次后，空 柱再次離屯、一次，去除殘留液體。
[0031] 7.將柱子轉(zhuǎn)移到2血Collection l\ibe中，向其中加入50-100 y L經(jīng)95°C預(yù)熱的 Elution Solution, 1000 Og離屯、30s，棄去柱子。使用Nano化OP測(cè)離屯、管底部溶液濃度和 純度，-80°C保存待用。 陽(yáng)03引 8.反轉(zhuǎn)錄miR-22,按下列反應(yīng)體系加樣（15化），包括：引物，3.0iiL;dNTP， 0. 15 Ji L ；Mautiscribe RT enzyme, I. 0 y L ; IOx RT Buffer I. 5 y L ;RNase inhibitor, 0. 19yL;RNA 樣品，5. OyL(I-IOng) ;DEPC 水，4. 16yL。
[0033] 反應(yīng)條件：16°C，30min ;42°C，30min ;85°C，5min ;最后保持在 4°C。
[0034] 9. miR-22定量PCR，按照下列反應(yīng)體系加樣（20化），包括：TaqMan Small RNA Assay, LOyL ；Product from RT Reaction, I. 33 uL ；TaqMan Universal PCR Master Mix, 10. 0 y L ;DEPC 水，7. 67 y L。
[0035] 反應(yīng)條件如下：
[0036] 第一步，95°C，IOmin ;
[0037] 第二步，95°C，15s ;60°C，Imin ;重復(fù) 40 次。
[0038] 第S步，4°C，30min。
[0039] real-time PCR 結(jié)果如圖 1 所示，顯示 Dox 誘導(dǎo) miR-22 在 K14-rtTA/TRE-miR-22 雙陽(yáng)小鼠的皮膚上顯著上調(diào)25倍。 W40] 實(shí)施例2 miR-22過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)小鼠脫毛 陽(yáng)0川 1、利用含有2克/升Dox的水去飼喂1周齡的K14-rtTA/TRE-miR-22雙陽(yáng)小鼠誘 導(dǎo)miR-22表達(dá)，同時(shí)飼喂K14-rtTA或TRE-miR-22單陽(yáng)小鼠作對(duì)照。49天對(duì)小鼠進(jìn)行觀 察和拍照。如圖2所示。結(jié)果表明，在小鼠出生后開(kāi)始喂食Dox誘導(dǎo)，K14-rtTA/TRE-miR22 雙轉(zhuǎn)基因小鼠在第49天出現(xiàn)明顯的脫毛表型。
[0042] 2、在小鼠出生后的第9，第17，第30，第35，第42，第46和第50天，取小鼠后背的 皮膚，固定在福爾馬林里。然后，利用常見(jiàn)方法包埋并制成組織切片。
[0043] 3、進(jìn)行H/E染色，利用顯微鏡觀察毛囊組織結(jié)構(gòu)并拍照。如圖3所示。毛囊在 miR-22過(guò)表達(dá)小鼠中的組化分析：圖3A顯示，小鼠毛發(fā)在第一和第二毛發(fā)周期中不同時(shí)間 點(diǎn)的組織結(jié)構(gòu)，顯示miR-22過(guò)表達(dá)可W促進(jìn)毛囊提前進(jìn)入退行期。圖3B顯示，毛囊中內(nèi)根 銷分化細(xì)胞的標(biāo)記基因 AE13, AE15, Gata3和Baprla在miR-22轉(zhuǎn)基因小鼠中顯著下調(diào)。 W44] 實(shí)施例3
[0045] 1、分別在第9,第18,第21和第26天取miR-22基因敲除小鼠的后背皮膚，固定在 福爾馬林里。然后利用常用方法包埋并制成組織切片。
[0046] 2、進(jìn)行H/E染色，利用顯微鏡觀察毛囊組織結(jié)構(gòu)并拍照。如圖4所示。結(jié)果表明， 毛囊在miR-22基因敲除小鼠中的組化分析，小鼠毛發(fā)在第一毛發(fā)周期中不同時(shí)間點(diǎn)的組 織結(jié)構(gòu)，顯示miR-22敲除可W延遲毛囊進(jìn)入退行期。
[0047] 實(shí)施例4
[0048] 1、取8-9周齡，同窩出生的miR-22敲除鼠和WT小鼠，剌去背部毛發(fā)，然后背部皮 下注射DHT，Img/天，連續(xù)注射21天。 W例 2、分別于DHT注射第1天和第21天，用照相機(jī)記錄小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)狀況，如圖5所 示。結(jié)果表明，剌毛后背部皮下連續(xù)注射DHT 21天后，WT小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)嚴(yán)重被抑制，而 miR-22敲除鼠毛發(fā)生長(zhǎng)受DHT影響不大。
[0050] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. microRNA-22在毛發(fā)發(fā)育和雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)中的應(yīng)用，其特征在于，所述 microRNA-22的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，雄激素誘導(dǎo)microRNA-22過(guò)表達(dá)， microRNA-22過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)毛發(fā)進(jìn)入退行期而導(dǎo)致毛發(fā)脫落。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)抑制microRNA-22表達(dá)，拮抗雄激素 DHT引起的脫發(fā)和毛發(fā)生長(zhǎng)變慢。 4. microRNA-22在制備雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)抑制 microRNA-22表達(dá)，拮抗雄激素雙氫睪酮引起的脫發(fā)和毛發(fā)生長(zhǎng)變慢。
【專利摘要】本發(fā)明揭示miR-22在毛發(fā)發(fā)育和雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)中的作用機(jī)制，首次公開(kāi)了miR-22在毛發(fā)發(fā)育和雄激素誘導(dǎo)脫發(fā)中的應(yīng)用。同時(shí)，首次公開(kāi)了過(guò)表達(dá)miR-22可以誘導(dǎo)脫毛或敲除miR-22可以拮抗雄激素引起脫發(fā)的體內(nèi)研究方法，所述microRNA-22的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。
【IPC分類】A61P17/14, A61K31/7088
【公開(kāi)號(hào)】CN105663153
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】于政權(quán), 袁樹楷, 李菲菲
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2014年11月21日