源自海洋的銅綠假單胞菌制備鼠李糖脂表面活性劑的工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明一種生物發(fā)酵制備鼠李糖脂的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠李糖脂是由微生物在特定的生長條件下分泌的一種具有優(yōu)良表面活性的代謝 產(chǎn)物，在石油化工領(lǐng)域，多用于回收巖層中石油，提高石油采收率、清洗儲油罐、消除海域中 的石油污染；在農(nóng)業(yè)上，鼠李糖脂生物表面活性劑可增加有機憐殺蟲劑的溶解度，增加粘重 ±親水性，更有利于肥料和農(nóng)藥的吸收；此外，由于鼠李糖脂具有一定的抗菌、抗病毒和抗 支原體的性能，鼠李糖脂在醫(yī)藥工業(yè)中經(jīng)過嚴格處理后作為藥物的輔助劑或替代品，W緩 解抗生素給生物體帶來的抗藥作用，具有廣闊應(yīng)用前景。
[0003] 源自海洋的銅綠假單胞菌（Pseudomonas ae;ruginosa)CICC10204被用于制備鼠李 糖脂，但鼠李糖脂的發(fā)酵制備是典型的好氧發(fā)酵，多采用銅綠假單胞菌作為菌種進行發(fā)酵 生產(chǎn)，其菌絲體和多糖的形成過程中，發(fā)酵液的黏度迅速上升，使得發(fā)酵中后期溶氧性能迅 速下降，如加大攬拌，剪切力將增大，則會造成菌絲體的損傷，生產(chǎn)能力下降，嚴重影響了 生產(chǎn)效果。如何改善糖脂類生物表面活性劑發(fā)酵的溶氧狀況，一直是該領(lǐng)域研究的焦點。 雙相發(fā)酵技術(shù)是指在發(fā)酵液中加入一種新的，與水不相溶的體系，該體系是對氧有較高溶 解度，但又不溶于水、對微生物無毒的載體（氧載體），氧載體發(fā)酵體系由于具有氧傳遞速 度快，能耗低，氣泡生成少，剪切力小等特點，可增加發(fā)酵體系的供氧能力，提高發(fā)酵產(chǎn)率。
[0004] 因此在采用銅綠假單胞菌制備鼠李糖脂表面活性劑時提供一種優(yōu)化的工藝，進一 步優(yōu)化發(fā)酵條件，提高底物的轉(zhuǎn)化率和投料濃度，成為現(xiàn)有技術(shù)中亟待解決的問題

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種改進的源自海洋的銅綠假單胞菌 制備鼠李糖脂表面活性劑的工藝，在研究中為我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，能夠意 外的提高銅綠假單胞菌發(fā)酵制備鼠李糖脂表面活性劑時的轉(zhuǎn)化率和投料濃度。
[0006] 本發(fā)明提供了一種利用源自海洋的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)制 備鼠李糖脂表面活性劑的工藝
[0007] 所述銅綠假單胞菌保藏編號為CICC10204,所述工藝包括W下步驟 陽00引 （1)抱子培養(yǎng)，將保藏號為CICC10204的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)作為生產(chǎn)菌種，采用馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)得到成熟抱子；
[0009] 似菌體培養(yǎng)，步驟（1)得到的抱子接種到的菌體培養(yǎng)基中進行菌體培養(yǎng)得到菌 體培養(yǎng)液；
[0010] (3)生物轉(zhuǎn)化，向步驟（1)中的菌體培養(yǎng)液在發(fā)酵培養(yǎng)基中在好氧發(fā)酵條件下，持 續(xù)發(fā)酵36-6化得到含有鼠李糖脂的發(fā)酵液，通風量（mVm3 · min)為1: (0. 6~1. 0); W11] (4)產(chǎn)物提取，將步驟做得到的發(fā)酵液通過離心法或膜過濾去除菌體及雜質(zhì)，再 經(jīng)服道爾頓超濾膜去除生物大分子和多糖；將收集到的濾液通過蒸發(fā)濃縮去除水分，最終 獲得鼠李糖脂表面活性劑。
[0012] 所述的工藝，所述步驟（1)中的馴化培養(yǎng)基的配方為（按質(zhì)量百分比）：植物油 3~6%，濃度為20~50%的乙醇0. 1~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白腺0.3~0.6%， 牛肉膏 0. 1 ~0. 4 %，Μ拆〇4〇. 02 ~0. 08 %，KH2PO4O. 1 ~0. 4 %，化C1 0. 03 ~0. 08 %， FeS04·7H20 0.00001 ~ 0.00003%，余量為水，培養(yǎng)基抑值7.0~7.2;
[001引所述步驟似中的菌體培養(yǎng)基的配方為（按質(zhì)量百分比）：植物油2~5%，濃 度為20 %~50 %的乙醇0. 5~1 %，葡萄糖0. 2~0. 5 %，蛋白腺0. 3~0. 6 %，牛肉膏 0. 1 ~0. 4 %，Μ拆040. 02 ~0. 08 %，ΚΗ2ΡΟ4Ο. 1 ~0. 4 %，化C1 0. 03 ~0. 08 %，F(xiàn)eS04 · 7&0 0. 00001~0. 00003%，余量為水，培養(yǎng)基抑值7. 0~7. 2。
[0014] 所述步驟（3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為（按質(zhì)量百分比）：植物油2~5%，濃度為 20%~50%的乙醇0. 3~0.8%，葡萄糖0. 2~0. 5%，蛋白腺0. 2~0. 5%，牛肉膏0.05~ 0. 2%，Μ拆〇4〇. 02 ~0. 06%，KH2PO40.0 6 ~0. 2%，F(xiàn)eS〇4 . 7&0 0. 00001 ~0. 00003%，余 量為水，培養(yǎng)基抑7. 0~7. 2。
[0015] 本發(fā)明提供的工藝可W顯著提高采用源自海洋的假銅綠單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂表 面活性劑的收率。并且意外的發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明提供的工藝，發(fā)酵液中的鼠李糖脂更容易進 行提取，說明本發(fā)明提供的工藝其工業(yè)化實施的前景更好。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。W下實施例用于 說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0017] 菌種：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，保藏編號 CICC10204 W化]步驟
[0019] (1)抱子培養(yǎng)，將保藏號為CICC10204的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)作為生產(chǎn)菌種，采用馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)得到成熟抱子；
[0020] 似菌體培養(yǎng)，步驟（1)得到的抱子接種到的菌體培養(yǎng)基中進行菌體培養(yǎng)得到菌 體培養(yǎng)液；（3)生物轉(zhuǎn)化，向步驟（1)中的菌體培養(yǎng)液在發(fā)酵培養(yǎng)基中在好氧發(fā)酵條件下， 持續(xù)發(fā)酵4化得到含有鼠李糖脂的發(fā)酵液，通風量（mVm3 · min)為1 : (0. 6~1. 0);
[0021] (4)產(chǎn)物提取，將步驟（3)得到的發(fā)酵液通過離屯、法或膜過濾去除菌體及雜質(zhì)，再 經(jīng)服道爾頓超濾膜去除生物大分子和多糖；將收集到的濾液通過蒸發(fā)濃縮去除水分，最終 獲得鼠李糖脂表面活性劑。 陽02引所述的方法，所述步驟（1)中的馴化培養(yǎng)基的配方為（按質(zhì)量百分比）：植物油 3~6%，濃度為20~50%的乙醇0. 1~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白腺0.3~0.6%， 牛肉膏 0. 1 ~0. 4 %，Μ拆〇4〇. 02 ~0. 08 %，KH2PO4O. 1 ~0. 4 %，化C1 0. 03 ~0. 08 %， FeS04·7H20 0.00001 ~ 0.00003%，余量為水，培養(yǎng)基抑值7.0~7.2;
[002引所述步驟似中的菌體培養(yǎng)基的配方為（按質(zhì)量百分比）：植物油2~5%，濃 度為20 %~50 %的乙醇0. 5~1 %，葡萄糖0. 2~0. 5 %，蛋白腺0. 3~0. 6 %，牛肉膏 0. 1 ~0. 4 %，Μ拆040. 02 ~0. 08 %，ΚΗ2ΡΟ4Ο. 1 ~0. 4 %，化C1 0. 03 ~0. 08 %，F(xiàn)eS04 · 7&0 0. 00001~0. 00003%，余量為水，培養(yǎng)基抑值7. 0~7. 2。
[0024] 所述步驟做中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為（按質(zhì)量百分比）：植物油2~5%，濃度為 20%~50%的乙醇0. 3~0.8%，葡萄糖0. 2~0. 5%，蛋白腺0. 2~0. 5%，牛肉膏0.05~ 0. 2%，Μ拆〇4〇. 02 ~0. 06%，KH2PO40.0 6 ~0. 2%，F(xiàn)eS〇4 . 7&0 0. 00001 ~0. 00003%，余 量為水，培養(yǎng)基抑7. 0~7. 2。
[00巧]不同實施例的培養(yǎng)基配比見下表：
[0026]
[0027] 通過上述實施例表明，采用本發(fā)明提供的生產(chǎn)工藝，可W顯著提高采用源自海洋 的假銅綠單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂表面活性劑的收率。并且意外的發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明提供的工 藝，發(fā)酵液中的鼠李糖脂更容易進行提取，說明本發(fā)明提供的工藝其工業(yè)化實施的前景更 好。
【主權(quán)項】
1. 一種利用源自海洋的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)制備鼠李糖脂表面 活性劑的工藝 所述銅綠假單胞菌保藏編號為CICC10204,所述工藝包括以下步驟： (1) 孢子培養(yǎng)，將保藏號為CICC10204的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)作 為生產(chǎn)菌種，采用馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)得到成熟孢子； (2) 菌體培養(yǎng)，步驟（1)得到的孢子接種到的菌體培養(yǎng)基中進行菌體培養(yǎng)得到菌體培 養(yǎng)液； (3) 生物轉(zhuǎn)化，向步驟（1)中的菌體培養(yǎng)液在發(fā)酵培養(yǎng)基中在好氧發(fā)酵條件下，持續(xù)發(fā) 酵36-60h得到含有鼠李糖脂的發(fā)酵液，通風量（m 3/m3 · min)為1 : (0. 6~1. 0); (4) 產(chǎn)物提取，將步驟（3)得到的發(fā)酵液通過離心法或膜過濾去除菌體及雜質(zhì)，再經(jīng)6K 道爾頓超濾膜去除生物大分子和多糖；將收集到的濾液通過蒸發(fā)濃縮去除水分，最終獲得 鼠李糖脂表面活性劑。2. 如權(quán)利要求1所述的工藝，其特征是所述步驟（1)中的馴化培養(yǎng)基的配方為（按質(zhì) 量百分比）：植物油3~6%，濃度為20~50%的乙醇0. 1~1 %，葡萄糖0. 2~0. 5%，蛋 白胨 0· 3 ~0· 6%，牛肉膏 0· 1 ~0· 4%，MgS040. 02 ~0· 08%，ΚΗ2Ρ040· 1 ~0· 4%，NaCl 0· 03 ~0· 08%，F(xiàn)eS04 · 7Η200· 00001 ~0· 00003%，余量為水，培養(yǎng)基 pH 值 7. 0 ~7. 2 ; 所述步驟（2)中的菌體培養(yǎng)基的配方為（按質(zhì)量百分比）：植物油2~5%，濃度為 20%~50%的乙醇0.5~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏(λ 1~ 0· 4 %，MgS040 . 02 ~0· 08 %，ΚΗ2Ρ040· 1 ~0· 4 %，NaCl 0· 03 ~0· 08 %，F(xiàn)eS04 · 7H20 0.00001~0.00003%，余量為水，培養(yǎng)基？!1值7.0~7.2; 所述步驟（3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為（按質(zhì)量百分比）：植物油2~5%，濃度為 20%~50%的乙醇0· 3~0· 8%，葡萄糖0· 2~0· 5%，蛋白胨0· 2~0· 5%，牛肉膏0· 05~ 0· 2%，MgS040 . 02 ~0· 06%，ΚΗ2Ρ040 · 06 ~0· 2%，F(xiàn)eS04 · 7H20 0· 00001 ~0· 00003%，余 量為水，培養(yǎng)基PH7. 0~7. 2。
【專利摘要】源自海洋的銅綠假單胞菌制備鼠李糖脂表面活性劑的工藝，所述工藝包括以下步驟：(1)孢子培養(yǎng)，將保藏號為的銅綠假單胞菌作為生產(chǎn)菌種，采用馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)得到成熟孢子；(2)菌體培養(yǎng)，步驟(1)得到的孢子接種到的菌體培養(yǎng)基中進行菌體培養(yǎng)得到菌體培養(yǎng)液；(3)生物轉(zhuǎn)化，向步驟(1)中的菌體培養(yǎng)液在發(fā)酵培養(yǎng)基中在好氧發(fā)酵條件下，持續(xù)發(fā)酵得到含有鼠李糖脂的發(fā)酵液，通風量(m3/m3·min)為1：(0.6～1.0)；(4)產(chǎn)物提取，將步驟(3)得到的發(fā)酵液通過離心法或膜過濾去除菌體及雜質(zhì)，再經(jīng)6K道爾頓超濾膜去除生物大分子和多糖；將收集到的濾液通過蒸發(fā)濃縮去除水分，最終獲得鼠李糖脂表面活性劑。
【IPC分類】C12P19/02, C12R1/385
【公開號】CN105671103
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】季延濱, 李濤, 孫學(xué)亮
【申請人】芝王（天津）生物科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年11月20日