一種柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟：將波賽鏈霉菌、灰色鏈霉菌或天藍(lán)淡紅鏈霉菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素，在發(fā)酵的過程中添加外源物質(zhì)；所述的外源物質(zhì)為碳酸氫鹽、氨基酸及其衍生物、脂肪酸類化合物中的一種以上，其中碳酸氫鹽在開始發(fā)酵后的48小時內(nèi)單次添加；氨基酸及其衍生物在開始發(fā)酵后的48～96小時內(nèi)分批次添加；脂肪酸類化合物在開始發(fā)酵后的72～144小時內(nèi)流動持續(xù)添加。該方法簡單、有效，能夠快速提高柔紅霉素發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，無需增加額外設(shè)備與人力，能夠大幅度提高柔紅霉素工業(yè)發(fā)酵水平，適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】
一種柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過外源物質(zhì)的添加以提高柔紅霉素產(chǎn) 量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 柔紅霉素是由一些鏈霉菌產(chǎn)生的一種重要的蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，是治療急性粒 細(xì)胞性白血病，急性淋巴細(xì)胞性白血病的一線藥物，同時也是多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比 星等蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素的合成起始原料。
[0003] 國外主要研究了波賽鏈霉菌和鏈霉菌C5這兩個菌株中的柔紅霉素和阿霉素代謝 生物合成途徑，經(jīng)過近二十余年的努力取得了許多研究成果。一般認(rèn)為整個途徑可以分為 三個階段，第一階段是在Π 型聚酮體途徑合酶(Polyketide systhase n，PKSn)作用下進(jìn) 行，PKS Π 酶系統(tǒng)包括縮合酶(KS)、?；d體蛋白（ACP)、酮基還原酶(KR)、環(huán)化酶(CYC)以 及鏈長確定因子(CLF)，是由一份丙酰輔酶A和九份丙二酸單酰輔酶A為鏈起始和延伸單位 合成的起點，經(jīng)過多次縮合、還原生成聚酮體鏈，形成四環(huán)狀的糖苷配基一 ε_紫紅霉酮（ε_ rhodomyicinone);第二階段由1-磷酸-D-葡萄糖為合成起始物，經(jīng)過脫水轉(zhuǎn)氨、還原等作用 形成10?-柔紅糖胺〇0?-1^-(1&1111〇%1^116);第三階段由 ￡-紫紅霉酮和10?-柔紅糖胺進(jìn)行糖 苷化形成紫紅紅霉素 D(Rhodomycin D)，經(jīng)過一系列酶催化最終形成柔紅霉素和阿霉素以 及鮑霉素類似物。
[0004]在微生物發(fā)酵過程中添加的外源物質(zhì)通常是指產(chǎn)生菌不能合成或合成量比較有 限不能滿足代謝需求的物質(zhì)，添加的物質(zhì)能夠被微生物全部利用或部分利用后進(jìn)入目標(biāo)代 謝產(chǎn)物的代謝過程。研究表明，在發(fā)酵過程中添加外源物質(zhì)（脂肪酸、能夠降解2C、3C物質(zhì)、 氨基酸或其衍生物、碳酸氫鹽)能夠使乙酰輔酶A、丁酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A(來源于乙 酰輔酶A和碳酸氫鹽)或丙酰輔酶A(來源于奇數(shù)鏈的脂肪酸β-氧化的末端產(chǎn)物和異亮氨酸 和甲硫氨酸的代謝產(chǎn)物。）等聚酮化合物前體濃度提高，從而使PKS Π 催化合成的聚酮化合 物產(chǎn)量提高，聚PKS Π 催化合成酮化合物發(fā)生在發(fā)酵中后期，因此發(fā)酵中后期添加外源物 質(zhì)能提高聚酮化合物產(chǎn)量。
[0005] 目前國內(nèi)外研究提高柔紅霉素產(chǎn)量的方法主要圍繞菌種選育、基因突變株篩選、 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方或改進(jìn)發(fā)酵工藝等，雖然取得一定的成績，然而工作量大，收效低，發(fā) 酵水平一般為1000~3000yg/mL，且發(fā)酵水平不穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法，解決了【背景技術(shù)】中的不足， 該方法簡單、有效，能夠快速提高柔紅霉素發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，無需增加額外設(shè)備與 人力，能夠大幅度提高柔紅霉素工業(yè)發(fā)酵水平，適合工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
[0007] 實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟:將波賽鏈霉菌、灰色鏈霉菌 或天藍(lán)淡紅鏈霉菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素，在發(fā)酵的過程中添加外源 物質(zhì);所述的外源物質(zhì)為碳酸氫鹽、氨基酸及其衍生物、脂肪酸類化合物中的一種以上，其 中碳酸氫鹽在開始發(fā)酵后的48小時內(nèi)單次添加，添加至碳酸氫鹽在發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度達(dá) 到O. 1~2.0% ;氨基酸及其衍生物在開始發(fā)酵后的48~96小時內(nèi)分批次添加，添加至氨基 酸及其衍生物在發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度達(dá)到0.01~0.10%;脂肪酸類化合物在開始發(fā)酵后的 72~144小時內(nèi)流動持續(xù)添加，共添加至脂肪酸類化合物在發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度達(dá)到0.1~ 3.0%〇
[0009] 所述的碳酸氫鹽為碳酸氫鈉、碳酸氫鉀以及碳酸氫銨中的一種以上。
[0010] 所述的氨基酸及其衍生物為天門冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、S- 腺苷甲硫氨酸中的一種以上。
[0011] 所述的脂肪酸類化合物為硬脂酸、油酸甲酯、大豆油、菜籽油、玉米油、花生油中的 一種以上。
[0012] 在接種時將菌株種子液按體積比2.0~15.0%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的發(fā)酵 條件具體如下：
[0013]罐溫 26~30°C;
[0014] 罐壓 0.01 ~〇.〇7Mpa;
[0015] 空氣流量 50~250m3/h;
[0016] 攬摔轉(zhuǎn)速20~150rpm;
[0017] 溶氧控制：發(fā)酵前期0~36小時溶氧濃度大于45%;發(fā)酵37~120小時溶氧濃度10 ~45% ;發(fā)酵121小時后溶氧濃度大于30% ;
[0018] pH控制:發(fā)酵pH回升至7 · 5~8 · 0，控制pH6 · 8~7 · 5;
[0019] 補(bǔ)料工藝控制:發(fā)酵中后期60~144小時流加葡萄糖，控制葡萄糖濃度大于0.5%;
[0020] 培養(yǎng)周期：144~240小時。
[0021]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖10. 〇g/L，玉米淀粉50.0 g/L，玉米漿20.0 g/L， 麩質(zhì)粉l〇.〇g/L，硫酸銨10.0g/L，磷酸氫二鉀5.0g/L，硫酸亞鐵1.0g/L，氯化鈉0.5g/L，碳酸 鈣3 · 0g/L，消泡劑0 · 3g/L，pH 7 · 0~7 · 5。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0023] (1)與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本發(fā)明在發(fā)酵前期0~48小時添加0.1~2.0%的碳酸氫 鹽，柔紅霉素發(fā)酵水平提高了28% ;在發(fā)酵前期48~96小時分批添加0.01~0.10 %氨基酸 及其衍生物，柔紅霉素發(fā)酵水平提高了 32%;在發(fā)酵中后期72~144小時流加0.1~3.0%的 脂肪酸類化合物，柔紅霉素發(fā)酵水平提高了 45 %。
[0024] (2)從本發(fā)明實例可以看出，與對照組相比，在波賽鏈霉菌、灰色鏈霉菌或天藍(lán)淡 紅鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素過程中，在發(fā)酵前期0~48小時添加0.1~2.0%的碳酸氫鈉，發(fā) 酵前期48~96小時分批添加0.01~0.10 % S-腺苷甲硫氨酸，發(fā)酵中后期72~144小時流加 0.1~3.0%的菜籽油，柔紅霉素發(fā)酵水平分別提高了68%、72%、65%;可見按照本發(fā)明上 述工藝添加外源物質(zhì)能夠顯著地增加柔紅霉素發(fā)酵水平。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體的實例對本發(fā)明進(jìn)行清楚、完整地描述和說明，所描述的實例僅僅 是本發(fā)明一部分實例，而不是全部實例，本發(fā)明的以下實例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限 制本發(fā)明的范圍。
[0026]本實施例中首先對菌種進(jìn)行培養(yǎng)，最后將波賽鏈霉菌、灰色鏈霉菌或天藍(lán)淡紅鏈 霉菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素，具體方法如下：
[0027] (1)將低溫保藏的菌種轉(zhuǎn)移至新鮮的斜面，28~30°C活化培養(yǎng)10~15天，所述的斜 面活化培養(yǎng)基組成如下(g/L):葡萄糖20.0，土豆30.0，瓊脂2.0，pH自然。
[0028] (2)將成熟的斜面用無菌水刮洗下孢子，制備孢子懸液，按0.1~2.0%的接種量接 種至種子培養(yǎng)基，28~30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)36~60小時，所述的搖瓶種子培養(yǎng)基組成如下 (g/L):葡萄糖10.0，麥芽糊精20.0，酵母提取物10.0，碳酸鈣2.0，pH自然。
[0029] (3)將培養(yǎng)種子液按體積比2.0~15.0 %接種至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，28~30 °C， 200rpm振蕩培養(yǎng)144~240小時，所述的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下（g/L):葡萄糖10.0,玉米 淀粉50.0，玉米漿20.0，酵母提取物5.0，硫酸銨10.0，磷酸氫二鉀5.0，硫酸亞鐵1.0，氯化鈉 〇.5，碳酸鈣3.0，？!17.0~7.5。
[0030] (4)將搖瓶培養(yǎng)種子液按體積比0.1~2.0%接種至一級種子培養(yǎng)基，所述的種子 培養(yǎng)條件如下：一級種子罐溫度26~30°C，罐壓0.01~0.07Mpa，空氣流量20~120LPM，攪拌 轉(zhuǎn)速50~400rpm，所述的一級種子培養(yǎng)基組成如下(g/L):葡萄糖10.0，麥芽糊精20.0，玉米 漿10.0，酵母提取物5.0，碳酸鈣3.0，消泡劑0.2，？!17.0~7.5。
[0031] (5)將培養(yǎng)的一級種子液按體積比2.0~15%接種至二級種子培養(yǎng)基，所述的種子 培養(yǎng)條件如下：二級種子罐溫度26~30°C，罐壓0.01~0.07Mpa，空氣流量5.0~40.0m3/h， 攪拌轉(zhuǎn)速30~250rpm，所述的二級種子培養(yǎng)基組成如下(g/L):葡萄糖10.0，玉米淀粉20.0， 玉米漿10.0，麩質(zhì)粉5.0，硫酸銨10.0，磷酸氫二鉀5.0，碳酸鈣3.0，消泡劑0.2，pH 7.0~ 7.5。
[0032] (6)將培養(yǎng)種子液按體積比2.0~15.0%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液總體積約為 3000~3500L，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下(g/L):葡萄糖10.0，玉米淀粉50.0，玉米漿20.0， 麩質(zhì)粉10. 〇，硫酸銨10. 〇，磷酸氫二鉀5.0，硫酸亞鐵1.0，氯化鈉0.5，碳酸鈣3.0，消泡劑 0.3，pH 7.0~7.5。所述的種子培養(yǎng)條件如下:罐溫26~30°C ;罐壓0.01~0.07Mpa;空氣流 量50~250m3/h;攪拌轉(zhuǎn)速20~150rpm;溶氧控制：發(fā)酵前期0~36小時溶氧濃度大于45 %; 發(fā)酵37~120小時溶氧濃度10~45%;發(fā)酵121小時后溶氧濃度大于30% ;pH控制:發(fā)酵pH回 升至7.5~8.0，控制pH6.8~7.5;補(bǔ)料工藝控制:發(fā)酵中后期60~144小時流加葡萄糖，控制 葡萄糖濃度大于〇.5% ;培養(yǎng)周期：144~240小時。
[0033]在以下實施例中，在最后一步的發(fā)酵階段中添加外源物質(zhì)，具體見以下實施例： [0034] 實施例1
[0035]本實施例中菌種為天藍(lán)淡紅鏈霉菌，搖瓶效價為2500~3000yg/mL。
[0036]配制不同濃度碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫氨溶液分別為0.05g/10mL、0.25g/ 10mL、0.5g/10mL、0.75g/10mL、1.0g/10mL，無菌水充分溶解后，米用直徑0.22μηι微濾膜過濾 除囷。
[0037]配制搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，每500mL搖瓶裝液量為50mL，其培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖 10.0 g/L，玉米淀粉50.0 g/L，玉米漿20.0 g/L，酵母提取物5. Og/L，硫酸銨10.0 g/L，磷酸氫二 鉀5.0g/L，硫酸亞鐵1.0g/L，氯化鈉0.5g/L，碳酸鈣3.0g/L，水40mL，3N鹽酸或40 %氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH 7.0~7.5，121°C，滅菌30分鐘。
[0038] 分別向搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10mL的不同濃度碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫氨溶 液，使得其在發(fā)酵液中的濃度分別為〇 .1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，其中對照組加入 10ml無菌水，將種子液接種至上述培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)192小時，測定柔紅霉素 發(fā)酵單位，結(jié)果如表1所示。
[0039] 表1:添加不同種類不同濃度的碳酸氫鹽對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響
[0040]
[0042] 從表1可以看出在發(fā)酵過程中加入適量碳酸氫鹽，尤其是碳酸氫鈉可以提高柔紅 霉素發(fā)酵產(chǎn)量。
[0043] 實施例2
[0044] 根據(jù)實施例1的結(jié)果，選擇發(fā)酵液中添加碳酸氫鈉濃度為1.0 %，按實施例1的方 法，考察在發(fā)酵不同階段添加碳酸氫鈉對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量，以不添加碳酸氫鈉溶液而以 等體積無菌水的搖瓶作為對照，結(jié)果如表2所示。
[0045] 表2:不同發(fā)酵時期添加碳酸氫鈉對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響
[0046]
[0047] 從表2可以看出，在發(fā)酵前期0~48小時添加 1.0%碳酸氫鈉可以顯著提高柔紅霉 素發(fā)酵產(chǎn)量，而在發(fā)酵中后期添加1.0%碳酸氫鈉效果不明顯甚至還有輕微抑制作用。
[0048] 實施例3
[0049] 根據(jù)實例1與2的結(jié)果，選擇發(fā)酵液中添加碳酸氫鈉濃度為1.0 %，按實施例1與2的 方法，考察在發(fā)酵前期〇~48小時單次或分批添加1.0 %碳酸氫鈉對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量，以 不添加碳酸氫鈉溶液而以等體積無菌水的搖瓶作為對照，結(jié)果如表3所示。
[0050] 表3:不同發(fā)酵時期添加碳酸氫鈉對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響
[0051
[0052]從表3可以看出，在發(fā)酵前期0~48小時單次或分批添加 1.0%碳酸氫鈉可以顯著 提高柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量，且采用單次與分批添加差別不是很明顯。
[0053] 實施例4
[0054]本實施例中菌種為天藍(lán)淡紅鏈霉菌。
[0055]配制不同濃度天門冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸 溶液分別為〇 · 〇〇5g/mL、0 · 01g/mL、0 · 02g/mL、0 · 03g/mL、0 · 04g/mL、0 · 05g/mL，無菌水充分溶 解后，采用直徑0.22μπι微濾膜過濾除菌。
[0056]配制搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，每500mL搖瓶裝液量為50mL，其培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖 10.0 g/L，玉米淀粉50.0 g/L，玉米漿20.0 g/L，酵母提取物5. Og/L，硫酸銨10.0 g/L，磷酸氫二 鉀5.0g/L，硫酸亞鐵1.0g/L，氯化鈉0.5g/L，碳酸鈣3.0g/L，水50mL，3N鹽酸或40 %氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH 7.0~7.5，121°C，滅菌30分鐘。
[0057] 將種子液接種至上述培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)192小時，在發(fā)酵48小時分 別向搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中加入lmL的不同濃度天門冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、甲硫氨 酸、S-腺苷甲硫氨酸溶液，使得其在發(fā)酵液中的濃度分別為0.001 %、0.002 %、0.004 %、 0.006%、0.008%、0.10%，其中對照組加入lml無菌水，測定柔紅霉素發(fā)酵單位，結(jié)果如表4 所示。
[0058]表4:添加不同種類不同濃度的氨基酸及其衍生對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響
[0059]
[0061 ]從表4可以看出在發(fā)酵過程中加入適量丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、S-腺 苷甲硫氨酸可以提高柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量，其中甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸作用效果較為接 近，而添加天門冬酰胺幾乎無影響。
[0062] 實施例5
[0063]根據(jù)實例4的結(jié)果，選擇發(fā)酵液中添加甲硫氨酸濃度為0.04%，按實施例4的方法， 考察在發(fā)酵不同階段添加甲硫氨酸對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響，以不添加甲硫氨酸溶液而 以等體積無菌水的搖瓶作為對照，結(jié)果如表5所示。
[0064]表5:不同發(fā)酵時期添加甲硫氨酸對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響
[0065]
[0066] 從表2可以看出，在發(fā)酵中期48~96小時添加甲硫氨酸可以顯著提高柔紅霉素發(fā) 酵產(chǎn)量。
[0067] 實施例6
[0068]根據(jù)實例4與5的結(jié)果，選擇發(fā)酵液中添加甲硫氨酸濃度為0.04%，按實施例4與5 的方法，考察在發(fā)酵前期48~96小時單次或分批添加0.04%甲硫氨酸對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn) 量，以不添加甲硫氨酸溶液而以等體積無菌水的搖瓶作為對照，結(jié)果如表6所示。
[0069] 表6:不同發(fā)酵時期添加甲硫氨酸對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響
[0070]
[0071] 從衣6牧口」以有出，仕及醉目IJ朋48~96/」、叮甘_伏芏二伏添那甲恤Μ酸敉單次添 加效果好，可以顯著提高柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量。
[0072] 實施例7
[0073] 本實施例中菌種為天藍(lán)淡紅鏈霉菌。
[0074] 配制不同量的硬脂酸、油酸甲酯、大豆油、菜籽油、玉米油、花生油，溶液分別為 0 · 005g/5mL、0 · 50g/5mL、0 · 75g/5mL、1.0g/5mL、1 · 25g/5mL、1 · 5g/5mL，體積為5mL，121 °C，滅 菌20分鐘。
[0075] 配制搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，每500mL搖瓶裝液量為50mL，其培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖 10.0 g/L，玉米淀粉50.0 g/L，玉米漿20.0 g/L，酵母提取物5. Og/L，硫酸銨10.0 g/L，磷酸氫二 鉀5. Og/L，硫酸亞鐵1. Og/L，氯化鈉0.5g/L，碳酸鈣3. Og/L，水45mL，3N鹽酸或40 %氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH 7.0~7.5，121°C，滅菌30分鐘。
[0076] 將種子液接種至上述培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)192小時，在發(fā)酵96小時分 別向搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5mL的不同量的硬脂酸、油酸甲酯、大豆油、菜籽油、玉米油、花 生油，使得其在發(fā)酵液中的濃度分別為〇.1%、〇.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，其 中對照組加入5ml無菌水，測定柔紅霉素發(fā)酵單位，結(jié)果如表7所示。
[0077] 表7:添加不同種類不同濃度的脂肪酸類化合物對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響
[0078]
[0080]從表7可以看出在發(fā)酵過程中加入適量硬脂酸、油酸甲酯、大豆油、菜籽油、玉米 油、花生油都可以提高柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量，其中菜籽油、油酸甲酯、硬脂肪酸作用效果最為 顯著。
[0081 ] 實施例8
[0082]根據(jù)實例7的結(jié)果，選擇發(fā)酵液中添加菜籽油濃度為2.0%，按實施例7的方法，考 察在發(fā)酵不同階段添加菜籽油對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響，以不添加菜籽油而以等體積無 菌水的搖瓶作為對照，結(jié)果如表8所示。
[0083]表8:不同發(fā)酵時期添加菜籽油對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響
[0084]
[0085] 從表8可以看出，在發(fā)酵中期72~144小時添加菜籽油可以顯著提高柔紅霉素發(fā)酵 產(chǎn)量。
[0086] 實施例9
[0087] 根據(jù)實例7與8的結(jié)果，選擇發(fā)酵液中添加菜籽油濃度為2.0%，按實施例4與5的方 法，考察在發(fā)酵前期24~72小時單次或分批添加菜籽油對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量，以不添加菜 籽油而以等體積無菌水的搖瓶作為對照，結(jié)果如表9所示。
[0088] 表9:不同發(fā)酵時期添加菜籽油對柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響
[0089]
[0090]從表9較可以看出，在發(fā)酵前期72~144小時多次添加菜籽油較單次添加效果好， 可以顯著提高柔紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量。
[0091] 實施例10
[0092] 本實施例中菌種為天藍(lán)淡紅鏈霉菌。
[0093]配制三級發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液總體積約為3000~3500L，其培養(yǎng)基組成如下：葡萄 糖10.0 g/L，玉米淀粉50.0 g/L，玉米漿20.0 g/L，麩質(zhì)粉10.0 g/L，硫酸銨10.0 g/L，磷酸氫二 鉀5.0g/L，硫酸亞鐵1.0g/L，氯化鈉 0.5g/L，碳酸鈣3.0g/L，消泡劑0.3g/L，3N鹽酸或40 %氫 氧化鈉調(diào)節(jié)口]^7.0~7.5，121°〇，滅菌30±2分鐘。
[0094] 移種后，控制罐溫26~30°C，罐壓0.01~0.07Mpa，空氣流量50~250m3/h，攪拌轉(zhuǎn) 速20~150rpm，發(fā)酵前期0~36小時溶氧濃度大于45%;發(fā)酵37~120小時溶氧濃度10~ 45 % ;發(fā)酵121小時后溶氧濃度大于30 %，pH控制：發(fā)酵pH回升至7.5~8.0，控制pH6.8~ 7.5，發(fā)酵中后期60~144小時流加葡萄糖，控制葡萄糖濃度大于0.5 %，在發(fā)酵前期24小時 添加1.0%的碳酸氫鈉，發(fā)酵中期48、72小時分批添加0.01~0.10%S-腺苷甲硫氨酸，發(fā)酵 中后期72~144小時流加2.0%的菜籽油，對照罐不添加外源物質(zhì)，但補(bǔ)入等量的無菌水，培 養(yǎng)192小時，柔紅霉素發(fā)酵水平相對提高了68 %。
[0095] 實施例11
[0096]本實施例中菌種為波塞鏈霉菌。
[0097]配制三級發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液總體積約為3000~3500L，其培養(yǎng)基組成如下：葡萄 糖10.0 g/L，玉米淀粉50.0 g/L，玉米漿20.0 g/L，麩質(zhì)粉10.0 g/L，硫酸銨10.0 g/L，磷酸氫二 鉀5.0g/L，硫酸亞鐵1.0g/L，氯化鈉0.5g/L，碳酸鈣3.0g/L，消泡劑0.3g/L，3N鹽酸或40 %氫 氧化鈉調(diào)節(jié)pH 7.0~7.5，121°C，滅菌30±2分鐘。
[0098] 移種后，控制罐溫26~30°C，罐壓0.01~0.07Mpa，空氣流量50~250m3/h，攪拌轉(zhuǎn) 速20~150rpm，發(fā)酵前期0~36小時溶氧濃度大于45%;發(fā)酵37~120小時溶氧濃度10~ 45 % ;發(fā)酵121小時后溶氧濃度大于30 %，pH控制：發(fā)酵pH回升至7.5~8.0，控制pH6.8~ 7.5，發(fā)酵中后期60~144小時流加葡萄糖，控制葡萄糖濃度大于0.5 %，在發(fā)酵前期24小時 添加1.0%的碳酸氫鈉，發(fā)酵前期48、72小時分批添加0.01~0.10%S-腺苷甲硫氨酸，發(fā)酵 中后期72~144小時流加2.0%的菜籽油，對照罐不添加外源物質(zhì)，但補(bǔ)入等量的無菌水，培 養(yǎng)192小時，柔紅霉素發(fā)酵水平相對提高了72%。
[0099] 實施例12
[0100] 本實施例中菌種為灰色鏈霉菌。
[0101]配制三級發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵液總體積約為3000~3500L，其培養(yǎng)基組成如下：葡萄 糖10.0g/L，玉米淀粉50.0g/L，玉米漿20.0g/L，麩質(zhì)粉10.0g/L，硫酸銨10.0g/L，磷酸氫二 鉀5.0g/L，硫酸亞鐵1.0g/L，氯化鈉0.5g/L，碳酸鈣3.0g/L，消泡劑0.3g/L，3N鹽酸或40 %氫 氧化鈉調(diào)節(jié)pH 7.0~7.5，121°C，滅菌30±2分鐘。
[0102] 移種后，控制罐溫26~30°C，罐壓0.01~0.07Mpa，空氣流量50~250m3/h，攪拌轉(zhuǎn) 速20~150rpm，發(fā)酵前期0~36小時溶氧濃度大于45%;發(fā)酵37~120小時溶氧濃度10~ 45 % ;發(fā)酵121小時后溶氧濃度大于30 %，pH控制：發(fā)酵pH回升至7.5~8.0，控制pH6.8~ 7.5，發(fā)酵中后期72~144小時流加葡萄糖，控制葡萄糖濃度大于0.5 %，在發(fā)酵前期24小時 添加1.0%的碳酸氫鈉，發(fā)酵中期48、72小時分批添加0.01~0.10%S-腺苷甲硫氨酸，發(fā)酵 中后期72~144小時連續(xù)流加2.0%的菜籽油，對照罐不添加外源物質(zhì)，但補(bǔ)入等量的無菌 水，培養(yǎng)192小時，柔紅霉素發(fā)酵水平相對提高了65%。
【主權(quán)項】
1. 一種柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟:將波賽鏈霉菌、灰 色鏈霉菌或天藍(lán)淡紅鏈霉菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)柔紅霉素，在發(fā)酵的過程中 添加外源物質(zhì);所述的外源物質(zhì)為碳酸氫鹽、氨基酸及其衍生物、脂肪酸類化合物中的一種 以上，其中碳酸氫鹽在開始發(fā)酵后的48小時內(nèi)單次添加，添加至碳酸氫鹽在發(fā)酵液中的質(zhì) 量濃度達(dá)到0.1~2.0% ;氨基酸及其衍生物在開始發(fā)酵后的48~96小時內(nèi)分批次添加，添 加至氨基酸及其衍生物在發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度達(dá)到0.01~0.10%;脂肪酸類化合物在開始 發(fā)酵后的72~144小時內(nèi)流動持續(xù)添加，共添加至脂肪酸類化合物在發(fā)酵液中的質(zhì)量濃度 達(dá)到0.1~3.0%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的碳酸氫 鹽為碳酸氫鈉、碳酸氫鉀以及碳酸氫銨中的一種以上。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的氨基酸 及其衍生物為天門冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、S-腺苷甲硫氨酸中的一種 以上。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的脂肪酸 類化合物為硬脂酸、油酸甲酯、大豆油、菜籽油、玉米油、花生油中的一種以上。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:在接種時將菌 株種子液按體積比2.0~15.0%接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的發(fā)酵條件具體如下： 罐溫26~30 C ； 罐壓0.01~0.07Mpa; 空氣流量50~250m3/h; 攪拌轉(zhuǎn)速20~150rpm; 溶氧控制：發(fā)酵前期〇~36小時溶氧濃度大于45% ;發(fā)酵37~120小時溶氧濃度10~ 45% ;發(fā)酵121小時后溶氧濃度大于30% ; pH控制:發(fā)酵pH回升至7 · 5~8 · 0，控制pH6 · 8~7 · 5; 補(bǔ)料工藝控制:發(fā)酵中后期60~144小時流加葡萄糖，控制葡萄糖濃度大于0.5%; 培養(yǎng)周期：144~240小時。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的柔紅霉素的高產(chǎn)量發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的發(fā)酵培 養(yǎng)基組成如下：葡萄糖10. 〇g/L，玉米淀粉50.0 g/L，玉米衆(zhòng)20.0 g/L，麩質(zhì)粉10.0 g/L，硫酸銨 10.0 g/L，磷酸氫二鉀5. Og/L，硫酸亞鐵1. Og/L，氯化鈉0.5g/L，碳酸鈣3. Og/L，消泡劑0.3g/ L，pH 7.0~7·5〇
【文檔編號】C12R1/465GK105838760SQ201610354904
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】蔡成平, 潘校軍, 何福彪, 張文凱, 余翔
【申請人】湖北宏中藥業(yè)股份有限公司