利用黃粉蟲蛹培養(yǎng)蟬花棒束孢的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用黃粉蟲蛹培養(yǎng)蟬花棒束孢的方法。其操作步驟主要包括：（1）蟬花棒束孢分生孢子懸液制備；（2）無菌黃粉蟲蛹制備；（3）蟬花棒束孢感染黃粉蟲蛹；（4）蟬花孢梗束誘導(dǎo)培養(yǎng)；（5）培養(yǎng)后處理。使用本發(fā)明所提出的利用黃粉蟲蛹培養(yǎng)蟬花棒束孢的方法，促進(jìn)蟬花棒束孢感染黃粉蟲蛹，培養(yǎng)出蟬花孢梗束。本發(fā)明操作簡便，效果良好，可推廣應(yīng)用到蟬花棒束孢的大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)方面。
【專利說明】
利用黃粉蟲蛹培養(yǎng)蟬花棒束孢的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬微生物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用黃粉蟲蛹培養(yǎng)蟬花棒束孢的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蝴花Cordyceps cicadae X.Q.Shing 為蝴花棒束抱(Zsaria cicadae Miquel)真菌及其寄主山蝴(C/cai/a flammata Dist)若蟲的復(fù)合體?！蹲C類本草》記載蝴花在宋代以前即已入藥，有退熱、解毒、驅(qū)風(fēng)、鎮(zhèn)驚的功效，可治小兒驚癲、天吊、痰疚、夜啼、心悸?！侗静菥V目》記載蟬花甘、寒、無毒、功同蟬蛻。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)家認(rèn)為蟬花具有疏散風(fēng)熱，透疹，驅(qū)風(fēng)止痙，明目退翳之功效；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明其具有調(diào)節(jié)免疫力、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、改善腎功能、延緩衰老等作用。蟬花在民間使用的歷史悠久，市場需求量大，野生蟬花資源短缺，未能滿足需求。蟬花容易人工規(guī)模化培養(yǎng)，功效成分與冬蟲夏草含量相似，具有非常高的應(yīng)用價值。
[0003]黃粉蟲(rMdr1 mo Ii tor L.)分類上屬鞘翅目、擬步行甲科、擬步甲族、擬步甲屬。它是一種大型倉貯害蟲，同時又是一種極具開發(fā)潛力的資源昆蟲。該蟲主要用作禽類和其它一些特種經(jīng)濟動物(蝎子、蛤蚧、牛蛙、林蛙、鱉、蝎、蛇、蜈蚣、觀賞魚及鳥類等)的飼料，同時也用于開發(fā)保健食品或藥品。
[0004]前期研究發(fā)現(xiàn)，用蟬花棒束孢感染黃粉蟲的不同生活史階段(幼蟲、蛹、成蟲)，感染效果差異較大，其中蟬花棒束孢對黃粉蟲蛹期具有非常理想的感染效果。目前黃粉蟲的規(guī)模化養(yǎng)殖技術(shù)非常成熟，容易大量獲得黃粉蟲蛹。本課題組已經(jīng)申請了無菌培養(yǎng)黃粉蟲的發(fā)明專利，專利申請?zhí)枮?201110360999.7。本發(fā)明利用無菌黃粉蟲蛹材料，作為蟬花寄主蟬若蟲的替代寄主，開展蟬花棒束孢的室內(nèi)培養(yǎng)，尋找一條仿生態(tài)大規(guī)模培養(yǎng)蟬花的新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種利用黃粉蟲蛹培養(yǎng)蟬花棒束孢的方法。
[0006]該方法的操作步驟如下:
(1)蟬花棒束孢分生孢子懸液制備:蟬花棒束孢菌株接種到PDA平皿培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)10-15天，用無菌水洗下孢子，稀釋調(diào)整使孢子終濃度達(dá)到5 X 17個/毫升；
(2)無菌黃粉蟲蛹制備:選取30-40只生長健壯的無菌黃粉蟲幼蟲，培養(yǎng)在滅菌的麩皮培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶為在100 ml罐頭瓶中裝入麩皮60 g，常規(guī)滅菌30 min ;黃粉蟲幼蟲化蛹后，選擇化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹，用無菌鑷子挑出，裝入無菌空罐頭瓶內(nèi)備用；
(3)蟬花棒束孢感染黃粉蟲蛹:用無菌鑷子將化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹在蟬花分生孢子懸液里蘸一下，控制黃粉蟲蛹浸沒在孢子懸液下的時間在3-5秒，避免黃粉蟲蛹被淹死，并使部分分生孢子附著在黃粉蟲蛹體表。迅速轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)瓶里，該培養(yǎng)瓶為在100 ml空罐頭瓶底部放一張無菌濾紙片，可以吸去黃粉蟲蛹體表多余的水分，控制黃粉蟲蛹數(shù)量在每瓶30-40只，避免濾紙片含水量過高影響黃粉蟲蛹呼吸。靜置培養(yǎng)，控制培養(yǎng)溫度在28°C, 2-3天后，黃粉蟲蛹受蟬花棒束孢感染致死； (4)蟬花孢梗束誘導(dǎo)培養(yǎng):待黃粉蟲蛹被蟬花棒束孢感染致死后，降低培養(yǎng)溫度至15-200C，使黃粉蟲蛹上長出蟬花孢梗束。調(diào)控培養(yǎng)溫度至20-25°C，繼續(xù)培養(yǎng)15-20天，蟬花孢梗束長至2-4 cm,終止培養(yǎng)；
(5)培養(yǎng)后處理:將終止培養(yǎng)的蟬花孢梗束取出，50°C恒溫干燥至恒重，用自封袋分裝或粉碎至80目粉末后再分裝，置于4°C環(huán)境保存。
[0007]本發(fā)明的關(guān)鍵點在于:蟬花棒束孢對黃粉蟲蛹期具有非常理想的感染效果；蟬花棒束孢和黃粉蟲蛹為無菌培養(yǎng)，沒有雜菌影響蟬花棒束孢感染黃粉蟲蛹；另外，培養(yǎng)過程中控制好溫度、濕度等培養(yǎng)條件，促進(jìn)蟬花孢梗束的生長。以上關(guān)鍵點如能把握好，可以顯著提高蟬花棒束孢的產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0008]本發(fā)明操作簡便，效果良好，可應(yīng)用到大規(guī)模蟬花棒束孢的實際生產(chǎn)過程中。
【具體實施方式】
[0009]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。
[0010]實施例1:
(1)蟬花棒束孢分生孢子懸液制備:蟬花棒束孢菌株接種到PDA平皿培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)10天，用無菌水洗下孢子，稀釋調(diào)整使孢子終濃度達(dá)到5 X 17個/毫升；
(2)無菌黃粉蟲蛹制備:選取35只生長健壯的無菌黃粉蟲幼蟲，培養(yǎng)在滅菌的麩皮培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶為在100 ml罐頭瓶中裝入麩皮60 g，常規(guī)滅菌30 min ;黃粉蟲幼蟲化蛹后，選擇化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹，用無菌鑷子挑出，裝入無菌空罐頭瓶內(nèi)備用；
(3)蟬花棒束孢感染黃粉蟲蛹:用無菌鑷子將化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹在蟬花分生孢子懸液里蘸一下，控制黃粉蟲蛹浸沒在孢子懸液下的時間在3秒，避免黃粉蟲蛹被淹死，并使部分分生孢子附著在黃粉蟲蛹體表。迅速轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)瓶里，該培養(yǎng)瓶為在100 ml空罐頭瓶底部放一張無菌濾紙片，可以吸去黃粉蟲蛹體表多余的水分，控制黃粉蟲蛹數(shù)量在每瓶30只，避免濾紙片含水量過高影響黃粉蟲蛹呼吸。靜置培養(yǎng)，控制培養(yǎng)溫度在28°C，2-3天后，黃粉蟲蛹受蟬花棒束孢感染致死；
(4)蟬花孢梗束誘導(dǎo)培養(yǎng):待黃粉蟲蛹被蟬花棒束孢感染致死后，降低培養(yǎng)溫度至15°C，使黃粉蟲蛹上長出蟬花孢梗束。調(diào)控培養(yǎng)溫度至20°C，繼續(xù)培養(yǎng)20天，蟬花孢梗束長至2 cm,終止培養(yǎng)；
(5)培養(yǎng)后處理:將終止培養(yǎng)的蟬花孢梗束取出，50°C恒溫干燥至恒重，用自封袋分裝或粉碎至80目粉末后再分裝，置于4°C環(huán)境保存。
[0011]實施例2:
(1)蟬花棒束孢分生孢子懸液制備:蟬花棒束孢菌株接種到PDA平皿培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)15天，用無菌水洗下孢子，稀釋調(diào)整使孢子終濃度達(dá)到5 X 17個/毫升；
(2)無菌黃粉蟲蛹制備:選取35只生長健壯的無菌黃粉蟲幼蟲，培養(yǎng)在滅菌的麩皮培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶為在100 ml罐頭瓶中裝入麩皮60 g，常規(guī)滅菌30 min ;黃粉蟲幼蟲化蛹后，選擇化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹，用無菌鑷子挑出，裝入無菌空罐頭瓶內(nèi)備用；
(3)蟬花棒束孢感染黃粉蟲蛹:用無菌鑷子將化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹在蟬花分生孢子懸液里蘸一下，控制黃粉蟲蛹浸沒在孢子懸液下的時間在4秒，避免黃粉蟲蛹被淹死，并使部分分生孢子附著在黃粉蟲蛹體表。迅速轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)瓶里，該培養(yǎng)瓶為在100 ml空罐頭瓶底部放一張無菌濾紙片，可以吸去黃粉蟲蛹體表多余的水分，控制黃粉蟲蛹數(shù)量在每瓶35只，避免濾紙片含水量過高影響黃粉蟲蛹呼吸。靜置培養(yǎng)，控制培養(yǎng)溫度在28°C，2-3天后，黃粉蟲蛹受蟬花棒束孢感染致死；
(4)蟬花孢梗束誘導(dǎo)培養(yǎng):待黃粉蟲蛹被蟬花棒束孢感染致死后，降低培養(yǎng)溫度至180C，使黃粉蟲蛹上長出蟬花孢梗束。調(diào)控培養(yǎng)溫度至23°C，繼續(xù)培養(yǎng)18天，蟬花孢梗束長至3 cm,終止培養(yǎng)；
(5)培養(yǎng)后處理:將終止培養(yǎng)的蟬花孢梗束取出，50°C恒溫干燥至恒重，用自封袋分裝或粉碎至80目粉末后再分裝，置于4°C環(huán)境保存。
[0012]實施例3:
(1)蟬花棒束孢分生孢子懸液制備:蟬花棒束孢菌株接種到PDA平皿培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)13天，用無菌水洗下孢子，稀釋調(diào)整使孢子終濃度達(dá)到5 X 17個/毫升；
(2)無菌黃粉蟲蛹制備:選取35只生長健壯的無菌黃粉蟲幼蟲，培養(yǎng)在滅菌的麩皮培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶為在100 ml罐頭瓶中裝入麩皮60 g，常規(guī)滅菌30 min ;黃粉蟲幼蟲化蛹后，選擇化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹，用無菌鑷子挑出，裝入無菌空罐頭瓶內(nèi)備用；
(3)蟬花棒束孢感染黃粉蟲蛹:用無菌鑷子將化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹在蟬花分生孢子懸液里蘸一下，控制黃粉蟲蛹浸沒在孢子懸液下的時間在5秒，避免黃粉蟲蛹被淹死，并使部分分生孢子附著在黃粉蟲蛹體表。迅速轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)瓶里，該培養(yǎng)瓶為在100 ml空罐頭瓶底部放一張無菌濾紙片，可以吸去黃粉蟲蛹體表多余的水分，控制黃粉蟲蛹數(shù)量在每瓶40只，避免濾紙片含水量過高影響黃粉蟲蛹呼吸。靜置培養(yǎng)，控制培養(yǎng)溫度在28°C，2-3天后，黃粉蟲蛹受蟬花棒束孢感染致死；
(4)蟬花孢梗束誘導(dǎo)培養(yǎng):待黃粉蟲蛹被蟬花棒束孢感染致死后，降低培養(yǎng)溫度至200C，使黃粉蟲蛹上長出蟬花孢梗束。調(diào)控培養(yǎng)溫度至25°C，繼續(xù)培養(yǎng)15天，蟬花孢梗束長至4 cm,終止培養(yǎng)；
(5)培養(yǎng)后處理:將終止培養(yǎng)的蟬花孢梗束取出，50°C恒溫干燥至恒重，用自封袋分裝或粉碎至80目粉末后再分裝，置于4°C環(huán)境保存。
【主權(quán)項】
1.一種利用黃粉蟲蛹培養(yǎng)蟬花棒束孢的方法，其特征在于該方法的操作步驟包括: (1)蟬花棒束孢分生孢子懸液制備:蟬花棒束孢菌株接種到PDA平皿培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)10-15天，用無菌水洗下孢子，稀釋調(diào)整使孢子終濃度達(dá)到5 X 17個/毫升； (2)無菌黃粉蟲蛹制備:選取30-40只生長健壯的無菌黃粉蟲幼蟲，培養(yǎng)在滅菌的麩皮培養(yǎng)瓶中，該培養(yǎng)瓶為在100 ml罐頭瓶中裝入麩皮60 g，常規(guī)滅菌30 min ;黃粉蟲幼蟲化蛹后，選擇化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹，用無菌鑷子挑出，裝入無菌空罐頭瓶內(nèi)備用； (3)蟬花棒束孢感染黃粉蟲蛹:用無菌鑷子將化蛹8小時內(nèi)的黃粉蟲蛹在蟬花分生孢子懸液里蘸一下，控制黃粉蟲蛹浸沒在孢子懸液下的時間在3-5秒，避免黃粉蟲蛹被淹死，并使部分分生孢子附著在黃粉蟲蛹體表；迅速轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)瓶里，該培養(yǎng)瓶為在100 ml空罐頭瓶底部放一張無菌濾紙片，可以吸去黃粉蟲蛹體表多余的水分，控制黃粉蟲蛹數(shù)量在每瓶30-40只，避免濾紙片含水量過高影響黃粉蟲蛹呼吸；靜置培養(yǎng)，控制培養(yǎng)溫度在28°C, 2-3天后，黃粉蟲蛹受蟬花棒束孢感染致死； (4)蟬花孢梗束誘導(dǎo)培養(yǎng):待黃粉蟲蛹被蟬花棒束孢感染致死后，降低培養(yǎng)溫度至15-20°C，使黃粉蟲蛹上長出蟬花孢梗束；調(diào)控培養(yǎng)溫度至20-25°C，繼續(xù)培養(yǎng)15-20天，蟬花孢梗束長至2-4 cm,終止培養(yǎng)； (5)培養(yǎng)后處理:將終止培養(yǎng)的蟬花孢梗束取出，50°C恒溫干燥至恒重，用自封袋分裝或粉碎至80目粉末后再分裝，置于4°C環(huán)境保存。
【文檔編號】C12N1/14GK105861314SQ201510034720
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月24日
【發(fā)明人】陳自宏, 徐玲, 王國強
【申請人】保山學(xué)院