一種NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素K₂的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素K2的方法，(1)維生素K3溶解于乙醇水溶液中，加入NaBH4，在N2保護(hù)下，控制溫度不超過50℃，攪拌反應(yīng)至體系呈淡綠色透明液體，中和至pH4.0后，用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物，濃縮后冷凍結(jié)晶，過濾除清液得到維生素K3氫醌；(2)將維生素K3氫醌和DMAPP加入酶促反應(yīng)體系中，反應(yīng)在密閉和N2保護(hù)條件下進(jìn)行，反應(yīng)完成后，加入Fe3+，去除N2保護(hù)，充分氧化后，使用乙酸乙酯萃取得到產(chǎn)物。本發(fā)明核心環(huán)節(jié)為生物酶催化工程技術(shù)，利用廉價(jià)的維生素K3催化合成高值的維生素K2。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，生產(chǎn)過程綠色環(huán)保。CCTCC M 201610520160311
【專利說明】
-種NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶催化合成精細(xì)化學(xué)品領(lǐng)域，具體設(shè)及一種NovQ 芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素 K2是維生素 K家族中的一員，其分子結(jié)構(gòu)特征為2位被多聚異戊二締側(cè)鏈取 代的3-甲基-1,4-糞釀。根據(jù)其多聚異戊二締側(cè)鏈聚合單元數(shù)目，可W分為MKi、MK2、MK4等14 種。在自然界中，維生素 K2主要存在于原核生物中，為細(xì)胞膜上電子傳遞鏈組成成分，同時(shí) 也是各種維生素 K在人體內(nèi)被利用的最終活性形式。
[0003] 維生素 K最早被人們所認(rèn)知是因?yàn)槠淠钚裕悄蜃友疽淮鼗傅妮o酶， 同時(shí)也是凝血因子7、9、10合成的必需條件。缺乏維生素 K會(huì)導(dǎo)致凝血時(shí)間延長，嚴(yán)重者甚至 無法凝血。在防止新生兒出血疾病，預(yù)防內(nèi)出血及持瘡，減少女性生理期大量出血，促進(jìn)血 液正常凝固方面具有重要作用。隨后人們發(fā)現(xiàn)維生素 K2對(duì)治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松有明顯效 果，可W促進(jìn)成骨細(xì)胞巧化，增加骨密度，防止骨折。近些年來，維生素 K2在抗肝癌方面的作 用逐漸顯現(xiàn)出來，研究證實(shí)了其對(duì)人肝癌細(xì)胞的生長增殖抑制作用和誘導(dǎo)調(diào)亡作用。最近 神經(jīng)科學(xué)方面的研究表明，維生素 K2能恢復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能，可能在帕金森癥治 療方面具有重要意義。
[0004] 維生素 K2目前可W通過化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法來合成，現(xiàn)階段國內(nèi)W化學(xué)法 為主?；瘜W(xué)法合成的維生素 K2產(chǎn)品存在異構(gòu)體、副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、帶來環(huán)境污染等問題，且 受化學(xué)前體原料來源限制。利用微生物發(fā)酵法制備維生素 K2,發(fā)酵原料易得、條件溫和、環(huán) 境壓力低，同時(shí)因?yàn)楸旧韥碓从谏?，制備的維生素 K2具有高生物活性和高生物相容性，易 于人體吸收與利用。然而微生物發(fā)酵制備維生素 K2代謝過程非常冗長，且分支節(jié)點(diǎn)多，受多 種代謝物抑制，整體合成效率低下，后續(xù)純化工藝復(fù)雜，目前難W滿足大規(guī)模生產(chǎn)需要。目 前國內(nèi)外利用單酶體外催化法合成維生素 K2還未見有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種使用NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2 的方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了 W下方案:一種NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶催化 合成維生素 K2的方法，包括W下步驟：
[0007] (1)維生素 K3溶解于乙醇水溶液中，加入化B也，在化保護(hù)下，控制溫度不超過50°C， 攬拌反應(yīng)至體系呈淡綠色透明液體，中和至PH4.0后，用乙酸乙醋萃取產(chǎn)物，濃縮后冷凍結(jié) 晶，過濾除清液得到維生素 K3氨釀；
[000引（2)將維生素 K3氨釀和DMAPP加入酶促反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系包含NovQ芳香族異戊 締基轉(zhuǎn)移酶，pH緩沖液，Mg2+，抗氧化劑;反應(yīng)在密閉和化保護(hù)條件下進(jìn)行，反應(yīng)完成后，加入 化 3+，去除化保護(hù)，充分氧化后，使用乙酸乙醋萃取得到產(chǎn)物；
[0009] 所述的NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶為重組NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶或天然 NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶(來源自雪白色鏈霉菌Str邱tomycesniveus)，濃度為0.1~4g/ L。
[0010] 優(yōu)選地，步驟(1)所述乙醇水溶液乙醇與水的體積比為1~3:1。
[00川優(yōu)選地，步驟（1)加入化BH4濃度為600~150(Mmol/L，維生素 K3濃度為750~ 800mmol/L，NaBH4與維生素拉摩爾比為2:1~3:4，反應(yīng)時(shí)間為6~1她。
[0012]優(yōu)選地，步驟(1)所述濃縮倍數(shù)為4.5~5.5倍，冷凍結(jié)晶溫度為-20~-80°C。
[001引優(yōu)選地，步驟（2)所述維生素 K3氨釀加入濃度為5~20mmol/L，DMAP巧日入濃度為5 ~10mmol/L0
[0014]優(yōu)選地，pH緩沖液為化i S-HCl、憐酸鹽緩沖液、巧樣酸鹽緩沖液中的一種，pH范圍 6.5~7.5，濃度 50~200mmol/l;所述 Mg2+由MgCl2 或MgS〇4提供，Mg2+濃度為 5~20mmol/l;抗 氧化劑為還原型谷脫甘膚、抗壞血酸、Q-生育酪中的一種，濃度為5~20mmol/L;
[0015] 優(yōu)選地，步驟(2)反應(yīng)條件為25~4(TC，反應(yīng)時(shí)長24~4她。
[0016] 優(yōu)選地，步驟(2)加入的化由FeCl3或化2(S〇4)3提供，F(xiàn)e3+加入濃度為7~20mmol/ L。
[0017] 優(yōu)選地，NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO:7所示。
[0018] 本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)：
[0019] 本發(fā)明核屯、環(huán)節(jié)為生物酶催化工程技術(shù)，利用廉價(jià)的維生素 K3催化合成高值的維 生素 K2。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，生產(chǎn)過程綠色環(huán)保。在維生素 K3氨釀和DMAPP 底物濃度均為IOmmo 1/L情況下，30°C反應(yīng)24h，反應(yīng)液中維生素 K2含量可達(dá)0.989g/L，轉(zhuǎn)化 率為41.2%。本發(fā)明對(duì)維生素 K2工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。
【附圖說明】
[0020] 圖1為HPLC維生素 K3譜圖
[0021] 圖2 HPLC反應(yīng)液譜圖
[0022] 圖3為novQ基因片段電泳圖
[0023] 圖4為novQ基因改造修飾電泳圖
[0024] 圖5為巧ic9酶切線性化電泳圖 [00巧]圖6為巧ic9-novQ重組質(zhì)粒電泳圖 [00%] 圖7為NovQ蛋白western-blot檢測(cè)圖譜
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 將5.17g(30mmol)維生素 K3溶解于40mL乙醇水溶液（1:1，v/v)中，分次加入1.13g (30mmol)化肌4，在化保護(hù)下，控制溫度不超過50°C攬拌反應(yīng)12h至體系呈淡綠色透明液體。 用lOOmmol/L稀鹽酸中和至抑4.0后，用120mL乙酸乙醋分S次萃取產(chǎn)物，萃取液在氮?dú)獗Ｗo(hù) 下濃縮至約8mL，-8(TC冷凍結(jié)晶，過濾保留晶體，清液再濃縮至1.6mL，-8(TC冷凍結(jié)晶，過 濾，合并兩次過濾的晶體得到4.73g維生素 K3氨釀，產(chǎn)率89.5 %。空氣中氧化后，經(jīng)HPLC檢 巧Ij，其出峰特征如圖1所示（出峰時(shí)間3.19min，檢測(cè)器A248nm)。
[0030] 實(shí)施例2.
[0031] 將107.44g(780mmol)維生素 K3溶解于SOOmL乙醇水溶液（3:l，v/v)中，分次加入 45.40g(1200mmol)NaBH4，在化保護(hù)下，控制溫度不超過50°C，攬拌反應(yīng)化至體系呈淡綠色透 明液體。用lOOmmol/L稀鹽酸中和至抑4.0后，用2.化乙酸乙醋分S次萃取產(chǎn)物，萃取液在化 保護(hù)下濃縮至約0.17化，-20°C冷凍結(jié)晶，過濾保留晶體，清液再濃縮至約0.03化，-20°C冷 凍結(jié)晶，過濾，合并兩次過濾的晶體得到96.07g維生素 K3氨釀，產(chǎn)率90.9 %。
[0032] 實(shí)施例3.
[0033] 將68.87g(400mmol)維生素 K3溶解于SOOmL乙醇水溶液（2:l，v/v)中，分次加入 11.35g(300mmol)NaBH4,在化保護(hù)下，控制溫度不超過50°C，攬拌反應(yīng)1她至體系呈淡綠色透 明液體。用IOOmmo 1 /L稀鹽酸中和至pH4.0后，用1 SOOmL乙酸乙醋分S次萃取產(chǎn)物，萃取液在 化保護(hù)下濃縮至約91mL，-5(TC冷凍結(jié)晶，過濾保留晶體，清液再濃縮至約16.5mL，-5(TC冷 凍結(jié)晶，過濾，合并兩次過濾的晶體得到57.85g維生素 K3氨釀，產(chǎn)率82.1 %。
[0034] 實(shí)施例4
[00巧]將0.2g的重組NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶(來源自專利菌種CCTCC M2016105,地 址:湖北省武漢市武昌區(qū)塔挪山八一路299號(hào)，中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、），溶解于IOOmL的 Tris-肥 1 緩沖液中（50mmol/L，pH 7.5)，加入0.20g( Immol)的MgCl2.細(xì)2〇,0.25g( Immol)的 DMAPP錠鹽，充分溶解后，在化保護(hù)下加入0.18g( Immol)實(shí)施例1中獲取的維生素 K3氨釀， 0.15g(0.5mmol)還原型谷脫甘膚?；Ｗo(hù)下密閉反應(yīng)2地，反應(yīng)溫度40°C。酶促反應(yīng)結(jié)束后， 撤去化保護(hù)，加入0.19g(0.7mmol )FeCl3.6出0,30°C下震蕩反應(yīng)地。使用200mL乙酸乙醋，分 S次萃取，合并有機(jī)相，得到維生素 K2與維生素 K3的混合物溶液。使用HPLC檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物含 量，參數(shù)為C18柱，流動(dòng)相為4:l(v/v)的甲醇/二氯甲燒，流速ImL/min，柱溫25°C，檢測(cè)波長 248nmdHPLC檢測(cè)出峰特征如圖2所示（維生素 K3出峰時(shí)間3 . 19min，維生素 K2出峰時(shí)間 3.49min，檢測(cè)器A248nm)。檢測(cè)結(jié)果萃取液中維生素 Ks(MKi)濃度為0.495g/L，換算為反應(yīng)液 中維生素 K2(MKi)濃度為0.989g/L。維生素拉氨釀和DMAPP轉(zhuǎn)化率為41.2%，全過程維生素1(3 轉(zhuǎn)化率為36.9%。
[0036] 實(shí)施例5
[0037] 將8 g的天然N O V Q芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶（來源自雪白色鏈霉菌 Streptomycesniveus)溶解于化的憐酸鋼鹽緩沖液中（IOOmmo 1/L，pH 7.0)，加入9.86g (40mmo 1)的MgS〇4.7出0，394g(16mmol)的DMAPP錠鹽，充分溶解后，在化保護(hù)下加入7.04g (40mmol)實(shí)施例2中獲取的維生素拉氨釀，3.52g(20mmol)抗壞血酸。N2保護(hù)下密閉反應(yīng)4她， 反應(yīng)溫度25°C，酶促反應(yīng)結(jié)束后，撤去化保護(hù)，加入加入10.81g(40mmol )FeCl3.6出0，25°C下 震蕩反應(yīng)4h。使用化乙酸乙醋，分四次萃取，合并有機(jī)相，得到維生素 K2與維生素 K3的混合物 溶液。使用HPLC檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物含量，參數(shù)為C18柱，流動(dòng)相為4:1 (v/v)的甲醇/二氯甲燒，流 速1血/min，柱溫25°C，檢測(cè)波長248nm。檢測(cè)結(jié)果萃取液中維生素 K2(MKi)濃度為0.582g/L， 換算為反應(yīng)液中維生素 Ks(MKi)含量為1.46g/L。維生素 K3氨釀轉(zhuǎn)化率為30.3% ,DMAPP轉(zhuǎn)化 率為60.6%，全過程維生素 K3轉(zhuǎn)化率為27.5 %。
[003引實(shí)施例6
[0039] 將O . Ig的天然No V Q芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶（來源自雪白色鏈霉菌 Sheptomycesniveus)溶解于IL的巧樣酸鋼鹽緩沖液中（200mmol/L，pH 6.5)，加入1.02g (5mmol)的MgCl2.細(xì)2〇，1.23g(5mmol)的DMAPP錠鹽，充分溶解后，在化保護(hù)下加入0.86g (5mmol)實(shí)施例3中獲取的維生素 K3氨釀，8.61g(20mmol)生育酪?；Ｗo(hù)下密閉反應(yīng)36h，反 應(yīng)溫度37°C，酶促反應(yīng)結(jié)束后，撤去化保護(hù)，加入3.04g( 11.25mmol )FeCl3.6出0，37°C下震蕩 反應(yīng)4h。使用化乙酸乙醋，分四次萃取，合并有機(jī)相，得到維生素 K2與維生素 K3的混合物溶 液。使用HPLC檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物含量，參數(shù)為C18柱，流動(dòng)相為4:1 (v/v)的甲醇/二氯甲燒，流速 ImL/min，柱溫25°C，檢測(cè)波長248nm。檢測(cè)結(jié)果萃取液中維生素 K2(MKi)濃度為0.129g/L，換 算為反應(yīng)液中維生素 Ks(MKi)含量為0.387g/L。維生素拉氨釀轉(zhuǎn)化率為21.5% ,DMAPP轉(zhuǎn)化率 為32.25%，全過程維生素 K3轉(zhuǎn)化率為17.7%。
[0040] 實(shí)施例7
[0041] 將4g的重組NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶(來源自專利菌種CCTCC M2016105,地址： 湖北省武漢市武昌區(qū)塔挪山八一路299號(hào)，中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、)溶解于化的憐酸鋼鹽 緩沖液中（1 OOmmo 1 /L，pH 7.0)，加入4.06g(20mmo 1)的MgCl2.細(xì)2〇，4.92g(20mmo 1)的DMAPP 錠鹽，充分溶解后，在化保護(hù)下加入3.52g(20mmol)實(shí)施例2中獲取的維生素 K3氨釀，3.52g (20mmol)抗壞血酸?；Ｗo(hù)下密閉反應(yīng)4她，反應(yīng)溫度40°C，酶促反應(yīng)結(jié)束后，撤去化保護(hù)，加 入8.00g(20mmol)Fe2(S化)3,40°C下震蕩反應(yīng)地。使用化乙酸乙醋，分四次萃取，合并有機(jī) 相，得到維生素 K2與維生素 K3的混合物溶液。使用HPLC檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物含量，參數(shù)為C18柱，流 動(dòng)相為4:1 (v/v)的甲醇/二氯甲燒，流速ImL/min，柱溫25°C，檢測(cè)波長248皿。檢測(cè)結(jié)果萃取 液中維生素 Ks(MKi)濃度為0.348g/L，換算為反應(yīng)液中維生素 Ks(MKi)含量為0.870g/L。維生 素 K3氨釀轉(zhuǎn)化率為36.2 %，DMAPP轉(zhuǎn)化率為36.2 %，全過程維生素拉轉(zhuǎn)化率為32.9 %。
[0042] 本發(fā)明的重組NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶是通過重組的畢赤酵母菌的生產(chǎn)的。重 組的畢赤酵母菌(GS115-ppic9-novQ)，其于2016年3月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 屯、(CCTCC，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)塔挪山八一路299號(hào)，中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、），保 藏編號(hào)為CCTCC M 2016105。
[0043] 由W下步驟構(gòu)建得到：
[0044] 步驟一:構(gòu)建重組畢赤酵母表達(dá)載體ppic9-novQ:
[0045] (1)異戊締基轉(zhuǎn)移酶novQ基因獲取
[0046] 使用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，50mL/250mL裝液量，28°C，180巧m搖瓶培養(yǎng)雪白鏈霉菌(購 買于中國藥學(xué)微生物菌種保藏管理中屯、）7化，過濾得到菌絲體，使用CTAB法提取菌絲體總 DNA。從當(dāng)DNA為模板，使用NovQ基因正向引物沈Q ID No.巧P反向引物沈Q ID No.2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)為95°C變性5min，95°C變性3〇3,52°(：退火3〇3,72°(：延長9〇3,72°(：延長 10min，32循環(huán)。獲取含novQ基因完整開放閱讀框的片段。該片段電泳結(jié)果如圖3所示，DNA測(cè) 序結(jié)果為SEQ ID No.3。
[0047] (2)novQ基因片段改造修飾
[004引 W含novQ基因完整開放閱讀框的片段為模板，使用正向修飾引物SEQ ID No.4和 反向修飾引物SEQ ID No.5進(jìn)行PCR，在novQ開放閱讀框5'端接上ppic9質(zhì)粒分泌信號(hào)膚a因 子C端基因同源片段，在3'端切除終止密碼子，接上六聚組氨酸標(biāo)簽和ppic9質(zhì)粒插入位點(diǎn) 下游同源序列片段。PCR參數(shù)為95°C變性5min，95°C變性303,48°(：退火303,72°(：延長903,3 循環(huán)，95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延長90s，72°C延長10min，29循環(huán)。得到改造修飾后 的novQ基因片段。該片段電泳結(jié)果如圖4所示。
[0049] (3)目的基因片段與載體連接
[0050] 使用限制性內(nèi)切酶趾O I和Not I將ppic9質(zhì)粒切割線性化后，瓊脂糖凝膠電泳割 膠回收大片段，該片段電泳結(jié)果如圖5所示。使用ez化Sion同源重組酶將改造修飾后的novQ 基因片段連入ppic9質(zhì)粒，連接反應(yīng)參數(shù)為25°C，40min。得到重組畢赤酵母表達(dá)載體ppic9- novQo
[0051 ] 步驟二：構(gòu)建重組畢赤酵母菌GS115-ppic9-novQ:
[0化2] (1)重組載體卵ic9-novQ擴(kuò)增
[0053]將畢赤酵母表達(dá)載體ppic9-novQ轉(zhuǎn)入大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞，使用含lOOmg/L 氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)后，挑取陽性克隆。獲得含ppic9-novQ的重組大腸桿菌D冊(cè) 口。挑取重組大腸桿菌D冊(cè)a單菌落接種到含50血LB培養(yǎng)基的250mLS角瓶中，200rpm，37°C震 蕩培養(yǎng)1她，1000 Og離屯、IOmin，得到重組大腸桿菌D冊(cè)a菌體。使用Axygen質(zhì)粒中量抽提試劑 盒，中量抽提質(zhì)粒，獲取足量PPic9-novQ載體。該載體電泳結(jié)果如圖6所示。
[0054] (2)ppic9-novQ轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌
[0055] ppic9-novQ載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶Stu I線性化后，電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌GS115感 受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入?yún)?shù)為1.化V，25iiF，放電時(shí)間4.5ms。使用MGY組氨酸營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基平板篩 選，得到重組畢赤酵母菌GSl 15-ppic9-novQ。
[0化6] 重組畢赤酵母菌GS115-ppic9-novQ用于生產(chǎn)重組NovQ芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶，包 括W下步驟：
[0057] (1)挑取重組畢赤酵母菌GS115-ppic9-novQ單菌落，接種于盛有25血的MGY培養(yǎng)基 的250mLS角瓶中，28°C，250巧m震蕩培養(yǎng)36h，得到活化的重組畢赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液。
[0化引 （2)將活化的重組畢赤酵母菌65115可9；[。9-]1〇￥9菌液^體積比10%的接種量接入 盛有25mL BMGY培養(yǎng)基的250mLS角瓶中，28°C，250巧m震蕩培養(yǎng)36h。將發(fā)酵液W4000g， 15min離屯、除去培養(yǎng)基，得到重組畢赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌體。
[0059] (3)將重組畢赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌體重懸于同離屯、前體積的BMMY培養(yǎng)基 中，25mL/250血裝液量，25°C，250rpm震蕩培養(yǎng)96h，培養(yǎng)期間每隔24小時(shí)加入0.25血甲醇誘 導(dǎo)劑。
[0060] (4)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，4000g，15min離屯、發(fā)酵液，棄去沉淀。上清液通過Ni-NTA His Bind Resin儀柱掛柱吸附，10倍柱體積20mM咪挫溶液洗雜，8倍柱體積250mM咪挫溶液洗脫， 透析袋透析脫鹽純化，-70°C冷凍干燥，即可得到可溶性的重組芳香族異戊締基轉(zhuǎn)移酶 NovQ。該蛋白western-blot檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。
[0061] W上所述僅為本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例而已，并不用W限制本發(fā)明創(chuàng)造，凡在本 發(fā)明創(chuàng)造的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明創(chuàng)造 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 維生素 Κ3溶解于乙醇水溶液中，加入NaBH4,在犯保護(hù)下，控制溫度不超過50°C，攪拌 反應(yīng)至體系呈淡綠色透明液體，中和至PH4.0后，用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物，濃縮后冷凍結(jié)晶，過 濾除清液得到維生素 K3氫醌； (2) 將維生素 Κ3氫醌和DMAPP加入酶促反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系包含NovQ芳香族異戊烯基 轉(zhuǎn)移酶，pH緩沖液，Mg 2+，抗氧化劑;反應(yīng)在密閉和他保護(hù)條件下進(jìn)行，反應(yīng)完成后，加入Fe3+， 去除N2保護(hù)，充分氧化后，使用乙酸乙酯萃取得到產(chǎn)物； 所述的NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶為重組NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶或天然NovQ芳 香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，濃度為〇. 1~4g/L。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法，其特征 在于，步驟(1)所述乙醇水溶液乙醇與水的體積比為1~3:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 Κ2的方法，其特征 在于，步驟（1)加入NaBH4濃度為600~1500mmol/L，維生素 Κ3濃度為750~800mmol/L，NaBH4 與維生素 K3摩爾比為2:1~3:4,反應(yīng)時(shí)間為6~18h。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法，其特征 在于，步驟(1)所述濃縮倍數(shù)為4.5~5.5倍，冷凍結(jié)晶溫度為-20~-80°C。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法，其特征 在于，步驟(2)所述維生素 Κ3氫醌加入濃度為5~20mmol/L，DMAPP加入濃度為5~lOmmol/ L〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法，其特征 在于，pH緩沖液為Tri s-HCl、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液中的一種，pH范圍6.5~7.5，濃 度50~200mmol/L;所述Mg2+由MgCh或MgSCU提供，Mg 2+濃度為5~20mmol/L;抗氧化劑為還原 型谷胱甘肽、抗壞血酸、α-生育酚中的一種，濃度為5~20mmol/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法，其特征 在于，步驟(2)反應(yīng)條件為25~40 °C，反應(yīng)時(shí)長24~48h。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法，其特征 在于，步驟⑵加入的Fe3+由FeCl3或Fe 2(S〇4)3提供，F(xiàn)e3+加入濃度為7~20mmol/L。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化合成維生素 K2的方法，其特征 在于，NovQ芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所 不。
【文檔編號(hào)】C12P7/66GK105861582SQ201610392463
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】鄭之明, 李哲敏, 趙根海, 劉會(huì), 王鵬, 王麗, 吳荷芳, 尉鴻飛, 孫孝娟, 王晗, 孫小雯
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院