一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，涉及電化學(xué)免疫分析領(lǐng)域。首先合成石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球，利用鏈霉親和素將其生物功能化并修飾于玻碳電極表面，通過鏈酶親和素對生物素的特異親和作用，將生物素化的抗體固定于功能化界面上，用牛血清蛋白封閉得到無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器。石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球電化學(xué)界面具有大的比表面積，良好的生物相容性，表現(xiàn)出優(yōu)異的電化學(xué)性能。用該復(fù)合納米球所制得的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，在鐵氰化鉀溶液體系中，可快速簡便地實現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物的高靈敏度無標(biāo)記檢測。
【專利說明】
一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免 疫傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域和電化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于石墨烯包裹聚苯 乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及在腫瘤標(biāo)志物中的檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 1990年，Henry等提出了免疫傳感器的概念，它是將高靈敏的傳感技術(shù)與特異性免 疫測定技術(shù)結(jié)合起來，用于檢測抗原-抗體反應(yīng)的新型生物傳感器。腫瘤標(biāo)志物是指由腫瘤 細(xì)胞產(chǎn)生，與腫瘤組織性質(zhì)相關(guān)的物質(zhì)，這些物質(zhì)存在于腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞的胞核、胞質(zhì) 和胞膜上或分泌在體液中。腫瘤標(biāo)志物的存在或含量變化可以提示腫瘤的存在及其階段。 電化學(xué)免疫傳感器將電化學(xué)分析技術(shù)和免疫測試技術(shù)相結(jié)合，因制作簡單、損耗小及靈活 便攜等優(yōu)點而備受關(guān)注是目前研究最多的較為成熟的一類免疫傳感器，廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo) 志物的檢測。
[0003] 無標(biāo)記免疫分析是利用抗體與待測抗原發(fā)生特異性結(jié)合時，導(dǎo)致界面物理或化學(xué) 性能發(fā)生變化，根據(jù)待測物濃度對該變化的影響關(guān)系實現(xiàn)免疫檢測，相對于標(biāo)記型免疫分 析，極大地簡化了制備和操作過程，具有操作簡便，成本低廉，檢測時間短等優(yōu)勢。
[0004] 納米材料，尤其是新型的納米材料和納米復(fù)合材料，由于其特殊的結(jié)構(gòu)層次，具有 較強(qiáng)的吸附能力，良好的定向能力和生物兼容性，而廣泛應(yīng)用于生物傳感器中。石墨烯是一 種只有一個碳原子厚度的二維材料，由于石墨烯的特殊結(jié)構(gòu)，石墨烯表現(xiàn)出優(yōu)異的導(dǎo)電性、 高比表面積、電子的快速運輸性、良好的機(jī)械特性、穩(wěn)定的熱學(xué)性以及特殊的化學(xué)性質(zhì)。將 石墨烯與聚苯乙烯球復(fù)合得到球狀石墨烯復(fù)合材料，基于該復(fù)合納米材料的優(yōu)良性能，可 以很好的應(yīng)用在生物傳感器領(lǐng)域。生物素與親和素之間具有很強(qiáng)的特異性親和作用，且一 個鏈酶親和素可以結(jié)合四個生物素，利用鏈霉親和素將納米結(jié)構(gòu)材料進(jìn)行生物功能化，將 其應(yīng)用在生物傳感器中，可以提高靈敏度，并達(dá)到信號放大的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué) 免疫傳感器的制備方法。其基本思路為:先合成石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球，利用鏈霉 親和素將石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球生物功能化并修飾于潔凈的玻碳電極表面，通過 鏈酶親和素對生物素的特異親和作用，將生物素化的抗體固定于功能化界面上，用牛血清 蛋白封閉得到該無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器。將制得的傳感器溫育抗原，抗體與抗原特異性 反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物阻礙電子傳遞，從而引起響應(yīng)電流減小，利用電信號的減小和抗原 濃度直接的線性關(guān)系，可以實現(xiàn)對腫瘤標(biāo)志物的高靈敏度無標(biāo)記檢測。
[0006] 合成石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球：
[0007] 向乙醇水溶液加入溶有引發(fā)劑偶氮二異丁腈的苯乙烯單體，室溫攪拌、N2鼓泡后 將體系溫度升高至70°C，恒溫恒速預(yù)反應(yīng)2h，再加入甲基丙烯酰氧乙烯氯化銨，在N 2氛圍下 繼續(xù)反應(yīng)22h，將產(chǎn)物離心洗滌后得到聚苯乙烯球懸浮液液。將氧化石墨烯懸浮液和聚苯乙 烯球懸浮液液混合超聲，加入去離子水，在室溫下攪拌，將體系升溫至95°C，加入水合肼，回 流反應(yīng)，將產(chǎn)物離心洗滌后得到石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球懸浮液，石墨烯包裹聚苯 乙稀復(fù)合納米球粒徑為150_200nm 〇
[0008] 制備無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器具體包括以下步驟：
[0009] (1)將石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球超聲分散于二次去離子水中，取石墨烯包 裹聚苯乙烯復(fù)合納米球懸浮液與殼聚糖溶液等體積混合并超聲分散均勻，再將上述混合溶 液與鏈霉親和素溶液等體積混合；
[0010] (2)將玻碳電極先用氧化鋁粉拋光，用二次去離子水沖洗掉殘留的氧化鋁粉后，然 后依次用乙醇和二次蒸餾水超聲清洗玻碳電極，最后在氮氣下吹干；
[0011] (3)將鏈霉素生物功能化的石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的混合溶液滴涂于上 述潔凈的玻碳電極表面，并置于冷藏低溫環(huán)境下晾干；
[0012] (4)將生物素化的抗體滴涂在上述鏈霉素生物功能化的修飾材料表面，室溫下反 應(yīng)后，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗。
[0013] (5)將封閉液牛血清蛋白滴涂于上述修飾層表面，在室溫下封閉后，用磷酸鹽緩沖 溶液沖洗。
[0014] 進(jìn)一步地，所述無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器的制備方法的步驟（1)中，所述聚苯乙 烯/石墨烯復(fù)合粒子用量為2.0~4. Omg/mL，殼聚糖溶液的濃度為1.0~2. Owt%，鏈霉親和 素的濃度為400~600yg/mL，步驟(2)中，所述的氧化鋁粉粒徑為0.05mm。
[0015] 進(jìn)一步地，所述無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器的制備方法的步驟(3)中，所述冷藏低溫 為4°C ;步驟(4)中，所述生物素化的抗體濃度為1~10yg/mL。
[0016] 進(jìn)一步地，所述無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器的制備方法的步驟(5)中，所述牛血清蛋 白溶液濃度為1.0~2. Owt %。
[0017]本發(fā)明還公開了一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫 分析方法，包括如下分析步驟：
[0018] a.將如權(quán)利要求1或2所述的基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化 學(xué)免疫傳感器在抗原的溫育液溫育，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗；
[0019] b.以制得的電化學(xué)生物傳感器為工作電極，飽和甘汞電極作為輔助電極，鉑片電 極作為對電極，在鐵氰化鉀測試液中，用差示脈沖伏安法檢測電化學(xué)信號。
[0020] 進(jìn)一步地，步驟a中，溫育時間為30~40min。
[0021] 進(jìn)一步地，步驟b中，鐵氰化鉀測試液由5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1M KC1 混合液組成，溶液的pH為6.5，體積為10mL。
[0022] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：
[0023] (1)本發(fā)明使用的材料為石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球，一方面石墨烯具有優(yōu) 異的導(dǎo)電性、高比表面積、電子的快速運輸性等優(yōu)點，能夠在界面上固定更多的鏈霉親和 素，固定更多的抗體，也能夠促進(jìn)電子的傳遞，從而構(gòu)建更高效的傳感界面，另一方面將石 墨稀包裹在聚苯乙稀球上，聚苯乙稀球粒徑為150_200nm，與微米級聚苯乙稀球相比，本發(fā) 明合成的石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球電化學(xué)界面具有大的比表面積，良好的生物相容 性，表現(xiàn)出優(yōu)異的電化學(xué)性能。
[0024] (2)另外，生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)由于具有高特異性且一分子鏈霉親和素可以結(jié) 合四分子生物素，在鏈霉親和素功能化的石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球界面上可以固定 大量的生物素化抗體，從而構(gòu)建更高效的傳感平臺，所形成的免疫復(fù)合物可以顯著的抑制 界面上的電子傳遞作用。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明電化學(xué)免疫傳感器的制作和免疫分析示意圖。
[0026]圖2為本發(fā)明AFP標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測的線性曲線。
[0027]具體實施方法
[0028] 為了更好的闡明本發(fā)明的技術(shù)過程和目的，下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā) 明進(jìn)行詳細(xì)介紹。
[0029] 實施例1
[0030] 本發(fā)明提供了一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的AFP無標(biāo)記電化學(xué)免疫 傳感器的制備方法，該AFP無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法包括以下步驟：
[0031] (1)制備石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球
[0032]取136g體積分?jǐn)?shù)為30 %的乙醇水溶液于250mL的三口燒瓶中，接著加入溶有0.5g 引發(fā)劑偶氮二異丁腈的苯乙稀單體27mL，室溫攪拌(400r/min)、N2鼓泡30min后將體系溫度 升高至70°C，恒溫恒速預(yù)反應(yīng)2h。再加入0.75g甲基丙烯酰氧乙烯氯化銨，在N 2氛圍下繼續(xù) 反應(yīng)22h，將產(chǎn)物離心洗滌后得到聚苯乙稀球懸浮液液。將10mL 0. lwt%的氧化石墨稀懸浮 液和5g 10wt%的聚苯乙稀粒子的分散液混合在一起，超聲30min，隨后加入120mL去離子 水，在室溫下攪拌6h，將體系升溫至95 °C，加入200yL 80wt %的水合肼，回流反應(yīng)4h，將產(chǎn)物 離心洗滌后得到石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球懸浮液。
[0033] (2)將濃度為2.0mg/mL的石墨稀包裹聚苯乙稀復(fù)合納米球懸浮液與1 .Owt%殼聚 糖溶液等體積混合后超聲分散。
[0034] (3)取30yL上述混合液和30yL 600yg/mL鏈霉親和素溶液等體積混合。
[0035] (4)取5yL上述鏈霉親和素功能化的混合溶液均勻滴涂于潔凈的玻碳電極表面，然 后放置在4 °C下干燥。
[0036] (5)取10yL lyg/mL生物素化的AFP抗體均勻滴涂于上述修飾材料的表面，室溫下 溫育lh，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗。
[0037] (6)取10yL l.Owt%牛血清蛋白均勻滴涂于上述修飾層表面，在室溫下封閉lh，用 磷酸鹽緩沖溶液沖洗，制得該AFP無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器。
[0038] 實施例2
[0039]對實施例1中的基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的AFP無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫 傳感器進(jìn)行免疫分析方法包括：
[0040] (1)將上述制得的AFP無標(biāo)記免疫傳感器在含不同AFP抗原的溫育液中溫育，溫育 時間為30~40min，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗；
[0041] (2)以制得的AFP無標(biāo)記免疫傳感器為工作電極，飽和甘汞電極作為輔助電極，鉑 片電極作為對電極，在含有5mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1M KC1測試液中，用差示脈 沖伏安法檢測其電化學(xué)信號。
[0042]如圖2為AFP標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性曲線。為考察該電化學(xué)傳感器的實際應(yīng)用的可靠性， 進(jìn)行了人血清實際樣品的檢測，并與標(biāo)準(zhǔn)方法(表1中樣品1-5的參考值由江蘇省腫瘤醫(yī)院 提供，由商品化的電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測量)進(jìn)行了比較，兩者檢測結(jié)果具有良好的一致 性，相對誤差小于10 %。如表1所示：
[0043] 表1. AFP實際樣品的測定
[0045] 實施例3
[0046] 本發(fā)明提供了一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的CEA無標(biāo)記電化學(xué)免疫 傳感器制備方法，該CEA無標(biāo)記免疫傳感器的制備方法包括以下步驟：
[0047] (1)將濃度為2. Omg/mL的石墨稀包裹聚苯乙稀復(fù)合納米球懸浮液與1. Owt %殼聚 糖溶液等體積混合后超聲分散。
[0048] (2)取30yL上述混合液和30yL 600yg/mL鏈霉親和素溶液等體積混合。
[0049] (3)取5yL上述鏈霉親和素功能化的混合溶液均勻滴涂于潔凈的玻碳電極表面，然 后放置在4 °C下干燥。
[0050] (4)取10yL lyg/mL生物素化的CEA抗體均勻滴涂于上述修飾材料的表面，室溫下 溫育lh，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗。
[0051 ] (5)取10yL l.Owt%牛血清蛋白均勻滴涂于上述修飾層表面，在室溫下封閉lh，用 磷酸鹽緩沖溶液沖洗，制得該CEA無標(biāo)記免疫傳感器。
[0052]將制得到的CEA無標(biāo)記免疫傳感器在含不同CEA抗原的溫育液中溫育，該無標(biāo)記免 疫傳感器進(jìn)行免疫分析的方法如實施例2。
【主權(quán)項】
1. 一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器的制備方法， 其特征在于，利用粒徑為150-200nm的石墨稀包裹聚苯乙稀復(fù)合納米球修飾電極界面固定 抗體分子，制備得到無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免 疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 將石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球超聲分散于二次去離子水中，取石墨烯包裹聚 苯乙烯復(fù)合納米球懸浮液與殼聚糖溶液等體積混合并超聲分散均勻;再將上述混合溶液與 鏈霉親和素溶液等體積混合； (2) 將玻碳電極先用氧化鋁粉拋光，用二次去離子水沖洗掉殘留的氧化鋁粉后，然后依 次用乙醇和二次蒸餾水超聲清洗玻碳電極，最后在氮氣下吹干； (3) 取步驟（1)中制得的鏈霉素生物功能化的石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的混合 溶液滴涂于步驟(2)中所得潔凈的玻碳電極表面，并置于冷藏低溫的環(huán)境下晾干； (4) 在步驟(3)所修飾后的玻碳電極表面滴涂生物素化的抗體，室溫下反應(yīng)后，用磷酸 鹽緩沖溶液沖洗； (5) 將牛血清蛋白溶液滴涂于步驟(4)中所得到的玻碳電極表面，在室溫下封閉后，用 磷酸鹽緩沖溶液沖洗，得到該無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器。3. 如權(quán)利要求2所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫 傳感器方法，其特征在于，步驟（1)中，所述聚苯乙烯/石墨烯復(fù)合粒子用濃度為2.0~ 4. Omg/mL，殼聚糖溶液的濃度為1.0~2. Owt %，鏈霉親和素的濃度為400~600yg/mL;步驟 (2)中，所述的氧化鋁粉粒徑為0.05_。4. 如權(quán)利要求2所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫 傳感器制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述冷藏低溫為4°C;步驟(4)中，所述生物素化 的抗體濃度為1~I Oyg/mL。5. 如權(quán)利要求2所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫 傳感器制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述牛血清蛋白溶液濃度為1.0~2.Owt%。6. -種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫分析方法，其特征在 于，包括如下分析步驟： a. 將如權(quán)利要求1或2所述的基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免 疫傳感器在抗原溫育液中溫育，然后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗。 b. 以制得的該無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器為工作電極，飽和甘汞電極作為輔助電極，鉑 片電極作為對電極，在鐵氰化鉀測試液中，用差示脈沖伏安法檢測電化學(xué)信號。7. 如權(quán)利要求6所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫 分析方法，其特征在于，步驟a中，溫育時間為30~40min。8. 如權(quán)利要求6所述的一種基于石墨烯包裹聚苯乙烯復(fù)合納米球的無標(biāo)記電化學(xué)免疫 分析方法，其特征在于，步驟b中，鐵氰化鉀測試液由5mM K3 [Fe (CN) 6 ] /K4[Fe (CN) 6 ]和0.1 M KCl混合液組成，溶液的pH為6.5，體積為10mL。
【文檔編號】G01N27/48GK105891483SQ201610211760
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】楊占軍, 藍(lán)慶春, 李娟 , 胡效亞
【申請人】揚州大學(xué)