鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了人源蛋白鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白(GBP5)蛋白的抗病毒作用。本發(fā)明證實(shí)流感病人臨床樣本血液及咽拭子中高表達(dá)GBP5，且流感病毒感染上調(diào)GBP5在A549細(xì)胞和PBMC中的表達(dá)；用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCMV?GBP5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞，能誘導(dǎo)表達(dá)干擾素I型和III型干擾素，同時(shí)可以激活其下游基因OAS、PKR、Mx的表達(dá)。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)GBP5具有抗病毒的生物學(xué)功能，為臨床上病毒感染誘發(fā)的細(xì)胞因子檢測(cè)提供了新靶標(biāo)，也為臨床治療病毒感染提供潛在的策略。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5(GBP5)的藥物新用途，具體是其 在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白（guanylate binding proteins ,GBPs)最早發(fā)現(xiàn)由干擾素γ誘導(dǎo) 產(chǎn)生的，是干擾素誘導(dǎo)蛋白（interferon stimlate gene, ISG)的一員。干擾素γ誘導(dǎo)包括 Mx蛋白在內(nèi)的大量三磷酸鳥(niǎo)苷酶(Guanosine triphosphate enzyme ,GTPase)，這些GTP酶 包括p47免疫相關(guān)GTP酶（immunity-related GTPase，IRG)和鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白（guanylate binding proteins,GBP) XBP蛋白家族目前已經(jīng)鑒定出11種鼠源的GBP蛋白以及7種人源的 GBP蛋白。人源鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5屬于干擾素γ誘導(dǎo)的p65三磷酸鳥(niǎo)苷酶家族，與GTP、⑶P和 GMP有較強(qiáng)的親緣關(guān)系，具有與鳥(niǎo)嘌呤結(jié)合的能力。GBP5被證明對(duì)γ磷酸基、β磷酸基有較強(qiáng) 的連續(xù)水解功能。近年來(lái)的一些研究表明GBP5能促進(jìn)炎癥小體的形成，刺激炎癥因子的表 達(dá)。
[0003] I型干擾素包括IFNa、IFNP、IFN-δ、IFN-ε、IFN-ζ、IFN-K、IFN-v、IFN-τ、和IFN- ω。I 型干擾素運(yùn)用兩條信號(hào)通路，Toll樣受體(TLRs)和胞衆(zhòng)受體(cytosolic receptor)。1型干 擾素有多種功能，例如抗病毒、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)作用。III型干擾素（Type III interferon，IFNs)，是一個(gè)新型的干擾素家族，位于第19號(hào)染色體ql3上，包括3種λ干擾素： IFN-λΙ (也被稱(chēng)為 IL-29)、IFN-X2(也被稱(chēng)為 IL-28A)和 IFN-X3(也被稱(chēng)為 IL-28B)<JII 型干 擾素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與I型干擾素類(lèi)似，激活Jak/STAT信號(hào)通路，轉(zhuǎn)錄多種IFN相關(guān)的基因。III 型干擾素抑制病毒的復(fù)制保護(hù)宿主細(xì)胞免于病毒感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5(GBP5)在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流感病毒感染細(xì)胞后誘導(dǎo)GBP5上調(diào)，然后促進(jìn)I型及III 干擾素表達(dá);以及GBP5能刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生I型和III型干擾素而具有廣譜抗病毒功效。
[0006] 具體采用以下技術(shù)方案：
[0007] GBP5在細(xì)胞和分子水平上對(duì)流感病毒復(fù)制有抑制作用，預(yù)示GBP5可以做為臨床抗 病毒藥物而進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。首先我們?cè)诩竟?jié)性流感病人的臨床樣本包括血液PBMC和咽拭 子中發(fā)現(xiàn)了 GBP5的高表達(dá)，且與流感病毒呈正相關(guān)。然后我們?cè)贏549細(xì)胞、人外周血淋巴細(xì) 胞和人肺泡二型原代細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)A型流感病毒感染時(shí)誘導(dǎo)GBP5在mRNA和蛋白水平上的 高表達(dá)。GBP5過(guò)表達(dá)能激活I(lǐng)型和III型干擾素以及干擾素誘導(dǎo)基因PKR、0AS、Mx的表達(dá)進(jìn)而 抑制病毒的復(fù)制，包括EV71、VSV、IAV等病毒。總體實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了 GBP5能促進(jìn)免疫細(xì)胞產(chǎn) 生干擾素且激活下游通路而達(dá)到廣譜抗病毒效果的機(jī)制。
[0008]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供GBP5在制備檢測(cè)病毒感染的試劑盒中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明揭示了 GBP5的一種新的生物學(xué)功能，能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾素且激活 干擾素下游通路進(jìn)而發(fā)揮廣譜抗病毒的作用，這一新發(fā)現(xiàn)為研制抗病毒藥物提供理論基 礎(chǔ)。
[0010]本發(fā)明采用體內(nèi)天然存在的蛋白GBP5,促進(jìn)人體免疫細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，不僅保證 了其完整的生物學(xué)功能，而且避免了因引入異源性的成分而導(dǎo)致產(chǎn)生毒副作用。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖IA型流感病毒可以上調(diào)GBP5在病人和原代細(xì)胞中的表達(dá)
[0012] A. A型流感病人和正常人咽拭子樣本中GBP5的檢測(cè)
[0013] B.臨床水平上，A型流感病人咽拭子中GBP5與NP mRNA相關(guān)性分析 [0014] C.A/Hong Kong/H3N2感染PBMC細(xì)胞后，激活GBP5的表達(dá)
[0015] D.A/Hong Kong/H3N2感染ATII細(xì)胞后，激活GBP5的表達(dá) [0016] E.A/Hong Kong/H3N2感染A549細(xì)胞后，激活GBP5的表達(dá) [0017] F.A/Hong Kong/H3N2感染A549細(xì)胞后，激活GBP5蛋白水平的表達(dá) [0018]圖2 GBP5在A549細(xì)胞中能激活干擾素通路
[0019] A.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GBP5蛋白到293T細(xì)胞中，IFN0，IL29(IFNAl)，ISRE，NF-KB的啟動(dòng)子活 性增強(qiáng)
[0020] B.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GBP5蛋白到A549細(xì)胞中，I和III型干擾素mRNA水平表達(dá)上升 [0021] C.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GBP5蛋白到A549細(xì)胞中，干擾素下游產(chǎn)物0ASl、PKR、MxA的mRNA和蛋白 水平表達(dá)上升
[0022]圖3 GBP5蛋白具有廣譜抗病毒功能
[0023] A.A549細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GBP5蛋白后感染A/Hong Kong/H3N2病毒，病毒三種RNA復(fù)制 水平均被抑制
[0024] B.Huh7細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GBP5蛋白后感染VSV病毒24小時(shí)后收集上清檢測(cè)VSV病毒含 量
[0025] C.Huh7細(xì)胞瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染GBP5和HBVl. 3倍體，36小時(shí)后收集上清檢測(cè)HBV的表面抗 原和核心抗原，HBV的復(fù)制水平被抑制
[0026] D.RD細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GBP5蛋白后感染EV71病毒12小時(shí)后收集細(xì)胞檢測(cè)病毒VPl蛋 白，病毒復(fù)制水平被抑制
【具體實(shí)施方式】
[0027]通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施 例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。
[0028]【實(shí)施例1】流感病毒感染上調(diào)GBP5在A549細(xì)胞和PBMC中的表達(dá)
[0029] 實(shí)驗(yàn)材料 [0030] 1、臨床樣本
[0031 ] 健康人全血和咽拭子來(lái)自獻(xiàn)血志愿者，流感病人血清、咽拭子來(lái)自醫(yī)院。
[0032] 2、細(xì)胞、病毒毒株及質(zhì)粒
[0033] 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和A型流感病毒毒株A/HongKong/498/97H3N2由中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心(CCTCC)提供，由本實(shí)驗(yàn)室保存。ATII細(xì)胞購(gòu)自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限 公司。
[0034] 3、生化試劑及試劑盒
[0035] F12K培養(yǎng)基，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco-BRL,Gaithersburg ,MD)購(gòu)自武 漢生命生物技術(shù)公司
[0036] 4、逆轉(zhuǎn)錄酶等
[0037] M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA抑制劑(RNas in)購(gòu)自Promega公司
[0038] Trizol、dNTP和Oligo dT(18T)購(gòu)自 Invitrogen公司
[0039] SYBR Green PCR Master Mix，購(gòu)自ABI公司
[0040] 5、耗材及儀器
[0041 ]細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)皿和細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自Corning公司
[0042] 4°C高速離心機(jī)、小型高速離心機(jī)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱和細(xì)胞操作臺(tái)購(gòu)自Herus
[0043] 超純水系統(tǒng)購(gòu)自mi Ilipore
[0044] 熒光定量 PCR 系統(tǒng) LightCycler480II 購(gòu)自 Roche
[0045] RNA提取所使用的RNase free的各種型號(hào)槍頭和EP管購(gòu)自Eppendorf
[0046] ELx800?酶標(biāo)儀購(gòu)自 BioTek⑧.Instruments，Inc
[0047] 常規(guī)PCR儀購(gòu)自東勝創(chuàng)新 [0048]實(shí)驗(yàn)方法
[0049] 1、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(貼壁)的培養(yǎng)
[0050] 細(xì)胞復(fù)蘇
[0051] 1)預(yù)先準(zhǔn)備好37°C_38°C溫水，從液氮罐中取出需要復(fù)蘇的細(xì)胞，用眼科手術(shù)鑷子 固定，迅速置于水中，保證凍存管完全浸沒(méi)于水中，使其均勻受熱，直到凍存管內(nèi)的細(xì)胞完 全融化；
[0052] 2)用酒精消毒凍存管；
[0053] 3)用吸管預(yù)先吸取5ml細(xì)胞培養(yǎng)基于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再用新的吸管將融化的細(xì) 胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞瓶中并輕輕吹打一遍；
[0054] 4)蓋好細(xì)胞瓶蓋，將細(xì)胞瓶放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37°C，5%C02靜置培養(yǎng)；
[0055] 5)約6-8小時(shí)后(取決于不同的細(xì)胞），更換新培養(yǎng)基以消除細(xì)胞凍存液中存留的 DMSO對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
[0056]細(xì)胞的傳代和凍存
[0057] 1)當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)T25細(xì)胞瓶后，用吸管吸取培養(yǎng)基并棄去；
[0058] 2)加入IOml的PBS，輕柔洗滌細(xì)胞后用吸管吸取并棄去；
[0059] 3)用吸管吸取1-1.5ml胰酶，使其覆蓋住細(xì)胞瓶底部，將細(xì)胞瓶放入37°C，5%⑶2 細(xì)胞培養(yǎng)箱靜止3_5min(消化時(shí)間的長(zhǎng)短取決于細(xì)胞種類(lèi)）；
[0060] 4)顯微鏡觀察，貼壁細(xì)胞變圓并且全部從細(xì)胞瓶壁脫離；
[0061] 5)在細(xì)胞操作臺(tái)內(nèi)，用吸管吸取約4ml培養(yǎng)基，加入細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，輕柔的吹打，以吹散 細(xì)胞和中和胰酶的消化效果；
[0062 ] 6)用吸管吸取吹勻的細(xì)胞懸液(體積約1 /3-2/3)到另一新的細(xì)胞瓶，再補(bǔ)加5ml的 培養(yǎng)基，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 °C，5 % CO2的環(huán)境下繼續(xù)靜置培養(yǎng)。
[0063] 2、H3N2 感染 A549細(xì)胞
[0064] H3N2感染A549前，將含有胎牛血清的完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，H3N2感染的 劑量為IMOI，感染或處理24h后，收集培養(yǎng)上清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0065] 3、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染（以L(fǎng)ipofectamine 2000轉(zhuǎn)染6孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例）
[0066] 1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，調(diào)整細(xì)胞密度，達(dá)到85%_90%，并將含胎牛血清的全培養(yǎng)基更換 為無(wú)血清培養(yǎng)基；
[0067] 2)按轉(zhuǎn)染6孔板所需的質(zhì)粒DNA的量和轉(zhuǎn)染試劑的量分別稀釋質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試 劑；6空板每空需4yg質(zhì)粒DNA，用250yL opti-MEM稀釋?zhuān)D(zhuǎn)染試劑需要8yL，用250M1 opti-MEM稀釋?zhuān)?br>[0068] 3)將稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑溶液逐滴滴加到稀釋好的質(zhì)粒DNA溶液中，一邊滴加一邊 輕彈EP管，注意，滴加的順序一定不能反；
[0069] 4)滴加混合好質(zhì)粒DNA/轉(zhuǎn)染試劑混合物后，放置室溫孵育15-20min;
[0070] 5)孵育完成后，將質(zhì)粒DNA/轉(zhuǎn)染試劑混合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕柔混勻，放置 37 °C，5 % CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4-6h;
[0071] 6)如果細(xì)胞株很敏感，培養(yǎng)培養(yǎng)4_6h后應(yīng)更換培養(yǎng)液，除去轉(zhuǎn)染復(fù)合物并加入新 鮮含胎牛血清的完全培養(yǎng)基；
[0072] 7)培養(yǎng)24_48h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0073] 4、逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)水平
[0074] 1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下
[0076] 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 °C Ih，75°C IOmin
[0077] 2)Real_time 反應(yīng)體系
[0078] ①目的基因的檢測(cè)引物和內(nèi)參引物
[0079] GBP5:57-TCCTCGGATTATTGCTCGGC-37(sense)
[0080] 5/-CCTTTGCGCTTCAGCCTTTT-37(antisense)
[0081 ] NP:5，-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3，（ sense)，
[0082] 5'-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3'（antisense)
[0083] GAPDH:5，-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3,（sense)
[0084] 5，-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3,（antisense)
[0085]②反應(yīng)體系
[0089] 5、H3N2拷貝數(shù)快速檢測(cè)方法(Real time PCR)
[0090] 1)質(zhì)粒濃度與拷貝數(shù)換算
[0091] ①在分光光度計(jì)上，取2yL質(zhì)粒溶液測(cè)定其濃度，重復(fù)幾次，要求測(cè)得濃度值穩(wěn)定， 初步估計(jì)質(zhì)粒純度以及是否有蛋白質(zhì)污染的狀況。
[0092] ②配制瓊脂糖凝膠，檢測(cè)質(zhì)粒純度及條帶亮度。
[0093] ③根據(jù)以下公式將濃度換算為質(zhì)?？截悢?shù)： amount X 6.022 X Kr1
[0094] 拷貝數(shù)=----- length X ? X 10' X 650
[0095] amount:0D值（ng/yL);
[0096] length:質(zhì)粒DNA堿基對(duì)數(shù)目（bp)。
[0097] 2)標(biāo)準(zhǔn)品制備
[0098]將上述已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒用滅菌去離子水進(jìn)行稀釋?zhuān)缦♂尩絣X101()C〇pieSAiL， 然后再進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑵舛纫来螢?IO9，IO8，IO7，IO6，IO6，IO 5，IO4，IO3，IO2，IO1CopiesAiL t3 以 此作為測(cè)定H3N2拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0099] 3)ReaI-time PCR
[0100] ①反應(yīng)體系：
[0102] ②NP檢測(cè)片段引物：
[0103] NP:5，-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3，（ sense)，
[0104] 5'-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3'（antisense)
[0105] ③反應(yīng)程序：
[0107] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
[0108] 用檢測(cè)試劑盒檢測(cè)18份正常人和19份A型流感病人血清中的GBP5含量，發(fā)現(xiàn)流感 病人組血清中的GBP5含量要明顯高于正常人組（圖1A)。收集了 19份A型流感病人和正常人 的咽拭子樣本后，提取mRNA后用realtime PCR進(jìn)行拷貝數(shù)絕對(duì)定量分析，發(fā)現(xiàn)A型流感的特 異性基因NP與GBP5有顯著的相關(guān)性（圖1B)。當(dāng)A型流感病毒IMOI A/Hong Kong/H3N2感染 PBMC，ATII和A549細(xì)胞24小時(shí)發(fā)現(xiàn)GBP5的RNA水平（圖IC，ID，1E)和蛋白水平（圖IF)的表達(dá) 量都有顯著提高。
[0109] 該部分實(shí)驗(yàn)表明臨床結(jié)果中A型流感病人血清中GBP5水平要高于正常人，且咽拭 子定量分析表明NP與GBP5具有相關(guān)性。而流感病毒感染A549細(xì)胞后也能上調(diào)GBP5的表達(dá)則 為我們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，即A549細(xì)胞可以作為細(xì)胞模型來(lái)研究流感病毒誘導(dǎo)GBP5表達(dá)的分子機(jī) 制。
[0110]【實(shí)施例2】GBP5可以激活干擾素及其下游通路反應(yīng)
[0111] 實(shí)驗(yàn)材料
[0112] 1、細(xì)胞
[0113] PBMC來(lái)自獻(xiàn)血志愿者、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549來(lái)自保藏中心
[0114] 2、生化試劑及試劑盒
[0115] Mx、PKR、0AS 和 IFNaR2 抗體購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology, Inc.
[0116]人外周血單核細(xì)胞（PBMC)分離試劑pyrogen-free saline over Histopaque (Sigma, St. Louis ,MO ,USA)購(gòu)自武漢天源生物技術(shù)公司
[0117] 熒光素酶活性報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自Promega公司
[0118] 3、耗材及儀器
[0119] 超聲破碎儀購(gòu)自Fisher公司
[0120]凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀及Western轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自北京君意東方公司 [0121] Western掃描系統(tǒng)購(gòu)自日本富士公司
[0122] 實(shí)驗(yàn)方法
[0123] 1、逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)水平
[0124] 1)細(xì)胞RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄方法同前所述
[0125] 2)熒光定量PCR引物
[0126] IFNa:5，-TTTCTCCTGCCTGAAGGACAG-3，（sense)，
[0127] 5，-GCTCATGATTTCTGCTCTGACA-3,（antisense)
[0128] IFN0:5 '-AAAGAAGCAGCAATTTTCAGC-3 '（ sense)，
[0129] 5，-CCTTGGCCTTCAGGTAATGCA-3,（antisense)
[0130] IFNAl:5，-CTTCCAAGCCCACCCCAACT-3，（ sense)，
[0131] 5'-GGCCTCCAGGACCTTCAGC-3'（antisense)
[0132] IFNA2:5 '-TTAAGAGGGCCAAAGATGC-3 '（ sense)，
[0133] 5，-TGGGCTGAGGCTGGATACAG-3,（antisense)
[0134] PKR:5 '-AGAGTAACCGTTGGTGACATAACCT-3 '(sense)，
[0135] 5，-GCAGCCTCTGCAGCTCTATGTT-3,（antisense)
[0136] OAS:5，-AGAAGGCAGCTCACGAAACC-3，（ sense)，
[0137] 5，-CCACCACCCAAGTTTCCTGTA-3,（antisense)
[0138] Mx:5，-GCCGGCTGTGGATATGCTA-3，（ sense)，
[0139] 5，-TTTATCGAAACATCTGTGAAAGCAA-3,（antisense)
[0140] 2、焚光素酶活性的測(cè)定（以Promega Luciferase試劑盒為例）
[0141 ] 1)取出Luciferase試劑盒，室溫平衡Ih;
[0142] 2)熒光測(cè)定儀開(kāi)機(jī)自檢，并設(shè)定相應(yīng)的參數(shù)；
[0143] 3)待測(cè)細(xì)胞樣品，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的I3BS洗滌一次，加入Luciferase細(xì) 胞裂解液，輕柔混勻，37 °C裂解15min;
[0144] 4)用移液槍吹打裂解物，并轉(zhuǎn)移到新的EP管中；
[0145] 5)4°C，12000rpm離心lmin，轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中，棄去沉淀；
[0146] 6)取樣品IOOyU加入Luciferase底物IOOyU移液槍吹打混勻后，上機(jī)測(cè)定；
[0147] 7)每次測(cè)定設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，最后的數(shù)據(jù)以L(fǎng)ucif erase的讀值和Reni Ia讀值的比 值來(lái)表示。
[0148] 3、Western檢測(cè)蛋白表達(dá)水平
[0149] 1)蛋白制樣（以6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞為例）：
[0150] ①貼壁細(xì)胞棄去培養(yǎng)基貼壁細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌一次，再加入一定 量的PBS，細(xì)胞刮輕柔刮動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)面，收集細(xì)胞；
[0151 ] ②4°C，2000rpm離心10min，收集細(xì)胞，棄去PBS上清；
[0152] ③加入60-80yL已預(yù)先加好蛋白酶抑制劑Cocktail和終濃度為0.5mMDTT，預(yù)冷的 細(xì)胞裂解液，用移液槍吹打，重懸細(xì)胞；
[0153] ④超聲破碎儀調(diào)至3檔，冰上超聲，每次3_5s，重復(fù)3次；
[0154] ⑤4°C，12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至另一新的EP管，即得到細(xì)胞總蛋白；
[0155] ⑥測(cè)定樣品蛋白濃度；
[0156]⑦按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的上樣量分裝，加入loading buffer，煮沸樣品5min制樣，2)SDS-PAGE分離蛋白和轉(zhuǎn)膜曝光：
[0157] ①SDS-PAGE膠上樣，Tris-gly緩沖液系統(tǒng)電泳分離蛋白，90V進(jìn)濃縮膠，110V進(jìn)分 離膠，以預(yù)染的蛋白質(zhì)marker為指示；
[0158] ②將SDS-PAGE膠從電泳系統(tǒng)中取下，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，同時(shí)將相應(yīng)大小的NC 膜也浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡；
[0159]③按轉(zhuǎn)膜墊、三層濾紙、NC膜、SDS-PAGE膠、三層濾紙、轉(zhuǎn)膜墊的三明治模型制備轉(zhuǎn) 膜芯體系，放入轉(zhuǎn)膜槽，負(fù)極對(duì)SDS-PAGE膠，正極對(duì)NC膜，并且NC膜和SDS-PAGE膠的接觸面 事先做好標(biāo)記；
[0? 60]④4°C，70V恒壓轉(zhuǎn)膜2h;轉(zhuǎn)膜結(jié)束，撤下NC膜，用圓珠筆根據(jù)預(yù)染的蛋白質(zhì)marker 的位置，劃定標(biāo)識(shí)，用麗春紅預(yù)染，粗略判斷目的蛋白是否轉(zhuǎn)膜成功；
[0161] ⑤PBS洗去麗春紅，5 %的脫脂牛奶室溫封閉1-2h; PBS洗去脫脂牛奶，用PBS根據(jù)說(shuō) 明書(shū)的介紹稀釋一抗，室溫孵育Ih;
[0162] ⑥TBS-T洗膜緩沖液，搖床洗膜5次，每次5min;用PBS根據(jù)說(shuō)明書(shū)的介紹稀釋二抗， 室溫孵育30min;
[0163] ⑦TBS-T洗膜緩沖液，搖床洗膜5次，每次IOmin;
[0164] ⑧濾紙吸干膜上的洗膜緩沖液，按比例加入曝光底物，暗處孵育5min;
[0165] ⑨Western掃描系統(tǒng)采集信號(hào)分析
[0166] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
[0167] 通過(guò)前面的實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)證明，A型流感病毒感染A549細(xì)胞后會(huì)上調(diào)GBP5,作為一 種炎癥因子，在病毒刺激后高水平的表達(dá)，必然會(huì)激活下游的特定的通路來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥 因子網(wǎng)絡(luò)以達(dá)到一種動(dòng)態(tài)的平衡或者起到抑制病毒復(fù)制的效果。在A549中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GBP5蛋 白，在啟動(dòng)子水平檢測(cè)了IFN0，IFNAl (IL29)，ISRE和NF-κΒ啟動(dòng)子的活性，在mRNA水平檢測(cè) 了 IFNa、IFNi3、IFNAl (IL29)三種干擾素的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)GBP5能激活干擾素啟動(dòng)子的表達(dá) (圖2A)以及mRNA水平的表達(dá)（圖2B)。于是為了進(jìn)一步確定GBP5是否能促進(jìn)干擾素通路的激 活，我們做了干擾素下游產(chǎn)物OASl、PKR、MxA的mRNA水平和蛋白水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GBP5蛋白 確實(shí)能夠在A549細(xì)胞中促進(jìn)I型干擾素的表達(dá)并激活其下游的通路（圖2C)。
[0168] 綜合這部分的實(shí)驗(yàn)，我們可以得出A型流感病毒感染細(xì)胞后促進(jìn)GBP5表達(dá)，從而上 調(diào)干擾素，激活干擾素下游通路，這可能為后續(xù)研究GBP5在免疫炎癥網(wǎng)絡(luò)中的新的生物學(xué) 功能提供了前提。
[0169] 【實(shí)施例3】GBP5具有廣譜抗病毒的功效
[0170] 實(shí)驗(yàn)材料
[0171] 1、細(xì)胞、病毒株及質(zhì)粒
[0172] 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞、Huh7細(xì)胞和A型流感病毒毒株A/ HongKong/498/97H3N2均由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)提供，由本實(shí)驗(yàn)室保存；
[0173] EV71(C4型）：由湖北省襄樊市一例EV71感染死亡幼兒腦內(nèi)分離得到，本實(shí)驗(yàn)室保 存；
[0174] VSV-eGFP:由武漢大學(xué)陳明周實(shí)驗(yàn)室提供，本實(shí)驗(yàn)室保存；
[0175] pBlue-HBVl .3-NE0質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室任文丹構(gòu)建并保存；
[0176] 2、生化試劑及試劑盒
[0177] 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 reagent( Invitrogen)
[0178] 高純度轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博大泰克公司
[0179]乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒和乙型肝炎病毒s抗原診斷試劑盒購(gòu)自上?？迫A 生物工程股份有限公司 [0180] 3、耗材及儀器
[0181] 熒光顯微鏡
[0182] 熒光定量PCR儀
[0183] ELx800? 酶標(biāo)儀
[0184] 實(shí)驗(yàn)方法
[0185] 1、熒光定量PCR測(cè)定H3N2病毒各種RNA含量(Real-Time PCR)
[0186] 1)H3N2感染A549細(xì)胞前，將含有胎牛血清的完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基，H3N2 感染的劑量為IMOI，感染或處理3h后，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；
[0187] 2)按照說(shuō)明書(shū)提取RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以及Real-time PCR，方法同前所述;3)熒光 定量PCR中所使用的引物：
[0188] 逆轉(zhuǎn)錄:1111?熟（5'-1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'1'-3'），
[0189] CRNA(5 '-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCAT-3 '），
[0190] VRNA(5 '-CTCACCGAGTGACATCAACATCATG-3 '），
[0191 ]定量PCR:NP(sense 5 ' -GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3 '
[0192] antisense 5'-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3'）
[0193] γ-actin(sense 5'-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3'
[0194] antisense 5'-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3'），
[0195] 2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
[0196] 同前所述。
[0197] 3、乙型肝炎病毒e/s抗原診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法）
[0198] 1)每孔加入待測(cè)樣品50yL，設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照各2孔，每孔加入陰性對(duì)照（或陽(yáng)性對(duì) 照）各50yL，并設(shè)空白對(duì)照1孔；
[0199] 2)每孔加入酶結(jié)合物50yL(空白對(duì)照孔除外），充分混勻，封板，置37度孵育30分 鐘；
[0200] 3)手工洗板:棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿(mǎn)各孔，靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干；
[0201] 4)每孔加顯色劑A液、顯色劑B液各50yL，充分混勻，封板，置37度孵育15分鐘；
[0202] 5)每孔加入終止液50yL，混勻；
[0203] 6)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450nm，參考波長(zhǎng)630nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔 OD值；
[0204] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論
[0205] 已有很多研究結(jié)果報(bào)道干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對(duì)多種病毒如DNA病毒和 RNA病毒均有抑制作用，而前面的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明GBP5能夠在A549細(xì)胞中上調(diào)干擾素并激活 其下游通路。所以我們進(jìn)一步研究GBP5是否能夠通過(guò)介導(dǎo)干擾素而發(fā)揮廣譜抗病毒的功 效。
[0206]為了驗(yàn)證是否sGBP5激活的I型干擾素能夠發(fā)揮抗病毒作用，我們首先瞬轉(zhuǎn)GBP5到 A549細(xì)胞中，然后用IMOI A/Hong Kong/H3N2感染A549細(xì)胞1.5h，孵育6h后收集細(xì)胞，檢測(cè) 病毒3種RNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了GBP5蛋白與對(duì)照相比，細(xì)胞感染病毒后的 mRNA、cRNA、vRNA水平均被明顯抑制（圖3A)，這說(shuō)明GBP5在A549細(xì)胞中對(duì)A/Hong Kong/H3N2 病毒復(fù)制有抑制作用。
[0207] 其次，Huh7細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GBP5蛋白后，用IMOI的VSV病毒感染24小時(shí)后收集上清， 接著同時(shí)用上清稀釋成不同濃度感染vero細(xì)胞2小時(shí)候洗去，用病毒噬斑檢測(cè)VSV病毒含 量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了GBP5的huh7細(xì)胞能抑制VSV的復(fù)制（圖3B)。然后，我們用構(gòu)建的HBV侵染性克 隆質(zhì)粒pBlue-HBVl. 3-NE0瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞同時(shí)瞬轉(zhuǎn)GBP5蛋白，收集上清用ELISA法檢測(cè) HBeAg和HBsAg的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)GBP5在Huh7細(xì)胞中對(duì)乙肝病毒有抑制作用（圖3C)。最后，RD細(xì) 胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GBP5蛋白后，加入IMOI EV71 (C4型）病毒感染12h，再收集細(xì)胞，western檢測(cè)病 毒VPl蛋白，發(fā)現(xiàn)病毒VPl蛋白含量同樣減少，表明轉(zhuǎn)染GBP5后在RD細(xì)胞中對(duì)EV71 (C4型）病 毒復(fù)制有抑制作用。（圖3D)。
[0208] 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GBP5對(duì)H3N2、EV71、HBV和VSV病毒復(fù)制都具有一定程度的抑制 作用，對(duì)GBP5具有廣譜抗病毒效果做了驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究其抗病毒機(jī)制以及生物醫(yī)藥應(yīng) 用提供了依據(jù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5用于制備激活I(lǐng)型和 III型干擾素的藥物。3. 鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5在制備檢測(cè)病毒感染的診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K49/00GK105963682SQ201610303268
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】朱應(yīng), 馮暕, 佘應(yīng)龍
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)