一種空間甲基桿菌lct?s10?2的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株“神舟九號”飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿菌LCT?S10?2，為好氧細(xì)菌，短桿狀的革蘭氏染色可變菌種（圖1），化能異養(yǎng)菌，兼性甲基營養(yǎng)菌和罕有兼性甲烷營養(yǎng)菌，菌株生長緩慢。對該菌進(jìn)行16S rRNA測序，鑒定其為甲基桿菌屬成員。進(jìn)行了全基因組測序分析，其基因組大小為4.57Mbp，GC含量為66.84%，預(yù)測基因數(shù)4946個，LCT?S10?2的蛋白被分類注釋為20類COG家族。LCT?S10?2菌在環(huán)氧樹脂、硫化天然橡膠表面能生長，有腐蝕生物膜生成；在酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、聚乙烯醇縮甲醛表面不能生長，無腐蝕生物膜生成。對研究密閉飛行器內(nèi)微生物種類分布、耐腐蝕材料的選擇等提供了一定幫助。CGMCC 1257620160601
【專利說明】
一種空間甲基桿菌LCT-S10-2
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域;更具體地，本發(fā)明涉及空間甲基桿菌LCT-S10-2及其生 物學(xué)特性、全基因組學(xué)測序。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著航天技術(shù)的發(fā)展，人類的外太空探索活動越來越頻繁。在地面上微生物幾乎 無處不在，大多數(shù)存在于人類皮膚、口腔、鼻咽部和胃腸道。盡管載人飛船及內(nèi)部物品等經(jīng) 過嚴(yán)格的真空消毒，載人航天器密閉環(huán)境條件下仍然容易滋生細(xì)菌和真菌等微生物，這些 微生物能在密閉艙室內(nèi)的金屬、高分子復(fù)合材料等表面形成生物膜，它們的生長繁殖和代 謝會對材料產(chǎn)生腐蝕，嚴(yán)重威脅空間站的長期在軌運(yùn)行安全，縮短空間站的服役時間。研究 密閉航天器內(nèi)的微生物種類對于航天器內(nèi)微生物的安全防護(hù)具有重要的意義。
[0003] 早期人們對許多環(huán)境微生物的認(rèn)識僅來自于對16S rRNA的研究，一些重要的遺傳 信息很難獲得?，F(xiàn)在越來越多的新的培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法，例如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、 宏基因組學(xué)等，被用來研究新獲得微生物的潛在特征和功能等。
[0004] 隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和進(jìn)行，生物體基因組研究已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的 前沿領(lǐng)域，而與之相對應(yīng)的微生物基因組研究正在廣泛開展。細(xì)菌是微生物的一種，其基因 組小、操作簡單且實(shí)驗(yàn)周期短，其研究的工作可為人類基因組研究提供有益的參考；同時隨 著測序技術(shù)的更新?lián)Q代和高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，細(xì)菌基因組的測序成本和所需時間已大 幅度降低。初步研究了該菌的表型及生理生化特征，對研究密閉飛行器內(nèi)微生物種類分布、 材料的微生物腐蝕等提供了幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的菌株LCT-S10-2為"神舟九號"飛船的返回艙內(nèi)冷凝水分離得到。
[0006] 本發(fā)明提供的該菌株，其保藏號為CGMCC No. 12576。
[0007] 菌株LCT-S10-2為好氧細(xì)菌，短桿狀的革蘭氏染色可變菌種（圖1)，化能異養(yǎng)菌，兼 性甲基營養(yǎng)菌和罕有兼性甲烷營養(yǎng)菌，菌株生長緩慢。菌體呈桿狀，表面沒有鞭毛、菌毛等 結(jié)構(gòu)。LCT-S10-2菌在環(huán)氧樹脂、硫化、硫化天然橡膠表面能生長，有腐蝕生物膜生成;在酯 類聚氨酯、醚類聚氨酯、聚乙烯醇縮甲醛表面不能生長，無腐蝕生物膜生成。
[0008] 所述的菌株LCT-S10-2菌株，進(jìn)行全基因組測序，并進(jìn)行分析，其基因組大小為 4.57Mbp，GC含量為66.84%，預(yù)測基因數(shù)4946個(表1)，310-2的蛋白被分類注釋為20類〇?家 族(圖2)。
[0009] 表1 Methylobacterium sp. LCT-S10-2菌株核苷酸含量和基因水平的基因組

說明：Gene Number預(yù)測結(jié)果的基因個數(shù);Gene Length (bp)預(yù)測得到的基因總長 度；GC Content in Gene Region (%)預(yù)測基因的GC含量；Gene Length / Genome (%):基 因占組裝序列的比例;Gene Average Length (bp):預(yù)測基因的平均長度。
【附圖說明】
[0010] 圖1 LCT-S10-2的革蘭氏染色結(jié)果。
[0011] 圖2 LCT-S10-2基因組20個C0G分類的基因數(shù)統(tǒng)計(jì)。
[0012] 圖3環(huán)氧樹脂為唯一碳源培養(yǎng)條件下LCT-S10-2的增長曲線。
[0013] 圖4 LCT-S10-2對環(huán)氧樹脂腐蝕的SEM觀察。
[0014] 圖5酯類聚氨酯為唯一碳源培養(yǎng)下LCT-S10-2的增長曲線。
[0015] 圖6 LCT-S10-2對酯類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0016] 圖7醚類聚氨酯為唯一碳源培養(yǎng)下LCT-S10-2的增長曲線。
[0017] 圖8 LCT-S10-2對醚類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0018] 圖9硫化天然橡膠為唯一碳源培養(yǎng)下LCT-S10-2的增長曲線。
[0019] 圖10 LCT-S10-2對硫化天然橡膠腐蝕的SEM觀察。
[0020]圖11聚乙烯醇縮甲醛為唯一碳源培養(yǎng)下LCT-S10-2的增長曲線。
[0021] 圖12 LCT-S10-2對聚乙烯醇縮甲醛腐蝕SEM觀察。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下述實(shí)施實(shí)例中所用的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0023] 下述實(shí)施實(shí)例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0024] 實(shí)施實(shí)例一:菌株LCT-S10-2培養(yǎng)。
[0025]菌株LCT-S10-2為"神舟九號"飛船的返回艙內(nèi)冷凝水分離得到。菌株分別于 37°C培養(yǎng)箱或搖床中進(jìn)行靜置或振蕩培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基為腦心浸出液培養(yǎng)基 (BHI，0xi〇d)，配方為37 g/L BHI;固體培養(yǎng)基為MH平板。
[0026] 實(shí)施實(shí)例二:菌株LCT-S10-2菌種鑒定。
[0027] 菌株LCT-S10-2接種至BHI液體培養(yǎng)基，37°C，180 rpm過夜培養(yǎng)，6000 rpm離 心5 min收集菌體，棄上清。利用Qiagen公司的基因組DNA提取試劑盒（Code No . 51304，詳細(xì)步驟見產(chǎn)品說明書）提取收集的菌體的基因組DNA。以LCT-S10-2的基因組 DNA為模板，利用細(xì)菌16s rRNA通用測序引物27F(5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R (5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增其 16s rRNA片段并測序，得到其堿 基序列。
[0028] 實(shí)施實(shí)例三:菌株LCT-S10-2的革蘭氏染色。
[0029] 采用革蘭氏染色試劑盒(Code No. G1060，Solarbio)對LCT-S10-2菌體進(jìn)行染 色。
[0030] BHI液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)菌體，將菌液滴于載玻片中央，在酒精燈上略加溫，使之 迅速干燥。結(jié)晶紫、沙黃染色液對干燥菌體一次染色脫色，詳細(xì)步驟見產(chǎn)品說明書。染色完 成并晾干后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。
[0031]實(shí)施實(shí)例四：菌株LCT-S10-2的電子顯微鏡觀察。
[0032] 分別在透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡（SEM)下觀察菌體形態(tài)。1ml培養(yǎng) 至穩(wěn)定前期的菌液，6000 rpm離心5 min收集菌體，棄上清;PBS緩沖液洗滌一次后將菌體懸 浮至合適濃度。菌懸液等體積與4%多聚甲醛+0.5%戊二醛溶液混合，滴在有支持膜的銅網(wǎng) 上，15 min后用濾紙吸取未吸附樣品；吸取磷鎢酸染液小心滴在銅網(wǎng)上，染色1 min后用濾 紙吸取未吸附的樣品；樣品干燥后在Philips EM 400T型透射電子顯微鏡(TEM)下觀察菌體 形態(tài)。首先用2.5%戊二醛、PBS緩沖液以及1%鋨酸清洗菌體，乙醇梯度脫水并乙酸異戊酯置 換，樣品干燥后做噴金處理(4)，處理好的樣品置于FEI Quanta 200型掃描電鏡下觀察。 [0033]實(shí)施實(shí)例五:菌株LCT-S10-2對5種高分子材料腐蝕實(shí)驗(yàn)觀察。
[0034]對照組：向100 mL無菌三角燒瓶中倒入40 mL無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)瓶中加 入10個試樣，透氣膜封口，放入32°C，相對濕度為75%的恒溫培養(yǎng)箱中。每株菌和每個材料準(zhǔn) 備3個平行樣品。設(shè)置4個時間點(diǎn)：1、3、6、10周取樣。
[0035]實(shí)驗(yàn)組：向100 mL無菌三角燒瓶中倒入40 mL無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)瓶中加 入10個試樣，接種5 mL菌懸液，透氣膜封口，放入32°C，相對濕度為75%的恒溫培養(yǎng)箱中。每 株菌和每個材料準(zhǔn)備3個平行樣品。設(shè)置4個時間點(diǎn)：1、3、6、10周取樣。
[0036]在各個時間點(diǎn)測定培養(yǎng)液600 nm波長下的吸光度，判斷細(xì)菌利用高分子材料作為 唯一碳源的生長情況。
[0037]表面微生物膜和腐蝕形態(tài)SEM觀察：在各個時間點(diǎn)，分別從對照組和實(shí)驗(yàn)組的3個 平行樣中分別取出一塊試樣，在無菌操作臺中進(jìn)行。生物膜固定:將樣品置于培養(yǎng)皿，沿壁 緩加固定液(0.1 M，pH 7.0的磷酸鹽緩沖的2.5%戊二醛），將樣品淹沒至少5 mm，固定4 h。 脫水:從固定液中取出樣品，蒸餾水清洗樣品膜3次，每次15 min。依次用30%、50%、70%、85% 和95%的乙醇溶液脫水，每級15~20 min，用100%的乙醇溶液脫水2次，每次15~20 min。 干燥:將試樣放入培養(yǎng)皿中，倒入5 mL六甲基二娃胺燒浸沒3min，通風(fēng)處干燥。噴金:樣品做 SEM觀察時，樣品必須有良好的導(dǎo)電性，對于不導(dǎo)電樣品，要設(shè)法使其具有導(dǎo)電性。完成這個 過程就要在樣品表面噴鍍一層導(dǎo)電層。對朝上面噴金處理。然后利用SEM觀察。
[0038]實(shí)施實(shí)例六:菌株LCT-S10-2的基因組測序、組裝及注釋。
[0039] 基因組DNA樣品委托安諾優(yōu)達(dá)有限公司進(jìn)行全基因組序列測定、基因預(yù)測、基因功 能注釋、非編碼RNA預(yù)測等工作，序列分析工作委托安諾優(yōu)達(dá)有限公司完成。
[0040] 基因組DNA提取后進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在濃度和純度達(dá)到測序要求后進(jìn)行全基因組測 序。利用Covaris進(jìn)行基因組DNA片段化，構(gòu)建插入片段約300-500 bp的基因組測序文庫， 通過橋式PCR擴(kuò)增得至ijDNA簇，然后采用Illumina Hiseq2000測序技術(shù)完成該菌株的基因組 掃描測序，獲得約1 Gb的原始測序數(shù)據(jù)。Illumina HiSeq2000測序得到的原始圖像數(shù)據(jù) 經(jīng)過Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，結(jié)果以FASTQ文件格式來存儲，包含測序read的序 列信息以及測序質(zhì)量信息；原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理去除接頭、引物及低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，利用 SOAPdenovo (http: //soap · genomics · org · cn/)拼接軟件對優(yōu)化序列進(jìn)行多個Kmer參數(shù) 的拼接，得到最優(yōu)的組裝結(jié)果，并運(yùn)用GapCloser軟件對組裝結(jié)果進(jìn)行局部內(nèi)洞填充和堿 基校正；分別利用RNAmmer和tRNAscan-SE軟件對基因組中包含的rRNA和tRNA進(jìn)行預(yù) 測；利用Glimmer 3 · 0(http: //www. cbcb · umd · edu/sof tware/glimmer/)軟件進(jìn)行基因預(yù) 測;利用各種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋和分類。
[0041] 關(guān)于保藏的LCT-S10-2菌株的說明 A. 菌種的保藏單位名稱和地址 名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所 B. 交機(jī)構(gòu)保藏的日期 2016年6月1日 C. 保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號 CGMCC No.12576 D. 分類命名 甲基桿菌 Methylobacterium sp.〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種"神舟九號"飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿菌LCT-S10-2,其保藏 號為 CGMCC 12576。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種"神舟九號"飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿 菌LCT-S10-2，為好氧細(xì)菌，短桿狀的革蘭氏染色可變菌種，化能異養(yǎng)菌，兼性甲基營養(yǎng)菌和 罕有兼性甲烷營養(yǎng)菌，菌株生長緩慢;對該菌進(jìn)行16S rRNA測序，鑒定其為甲基桿菌屬成 員。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種"神舟九號"飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿 菌LCT-S10-2,進(jìn)行全基因組測序并進(jìn)行分析。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種"神舟九號"飛船返回艙中分離得到下行菌株空間甲基桿 菌LCT-S10-2,進(jìn)行高分子材料腐蝕特性試驗(yàn)并分析。
【文檔編號】C12R1/01GK106085910SQ201610455941
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】劉長庭, 徐綢, 張學(xué)林, 周宏 , 方向群, 姜學(xué)革, 劉巖, 潘磊, 黃兵, 李佳, 余昳
【申請人】中國人民解放軍總醫(yī)院