本發(fā)明屬于釀酒酵母工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種釀酒酵母的met6過表達突變株的構(gòu)建方法，還涉及met6過表達釀酒酵母突變株的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

硒是人體的必需元素之一，具有抗氧化，增強免疫，解毒，促進基礎(chǔ)代謝等功能。硒攝入不足會導(dǎo)致克山病，癌癥，心血管等一系列疾病。因此，硒的足夠攝入量對于人維持健康具有重要作用。中國營養(yǎng)學(xué)會制定了中國居民膳食硒的參考攝入量，提出成人膳食硒平均需要量為41μg/d，推薦攝入量為50μg/d。硒代甲硫氨酸是一種低毒性的有機硒化物，可以在人體和動物體內(nèi)被代謝和保留，在營養(yǎng)方面優(yōu)于其它硒化合物，是一種理想的硒補充劑。

作為發(fā)酵工業(yè)的主要菌種，釀酒酵母同時也具有強大的硒耐受性和富集能力。富硒能力高達3000μg/g，可將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，其中90%以上的硒存在形式以硒代甲硫氨酸。富硒酵母由于食用安全性強、生物利用率高等優(yōu)點而成為首選的補硒添加劑，被廣泛地應(yīng)用于動物，家禽的飼養(yǎng)，以及人體的硒元素補充。

提升酵母富硒能力是一個重要課題，而傳統(tǒng)的解決方法一般從培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，培養(yǎng)條件的優(yōu)化（溫度，轉(zhuǎn)速，通氣量，ph等）方面入手。本技術(shù)利用強大的酵母遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，對胞內(nèi)硒代甲硫氨酸合成進行進一步的調(diào)控，對細(xì)胞硒代謝進行了改造，從而提高了胞內(nèi)硒代甲硫氨酸的合成能力。

met6基因編碼的甲硫氨酸合酶能夠催化同型半胱氨酸生成甲硫氨酸，是釀酒酵母胞內(nèi)甲硫氨酸合成的主要途徑之一。目前未見對釀酒酵母met6基因進行改造提升胞內(nèi)硒代甲硫氨酸的合成能力的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是構(gòu)建一種釀酒酵母的met6過表達突變株，該突變株met6基因過表達，富硒時合成硒代甲硫氨酸的能力提高。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種釀酒酵母的met6過表達突變株的構(gòu)建方法，利用微生物遺傳學(xué)方法構(gòu)建釀酒酵母細(xì)胞met6過表達突變株后，再將突變株用于富硒時高產(chǎn)硒代甲硫氨酸。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種釀酒酵母的met6基因過表達突變株在提高硒代甲硫氨酸合成的應(yīng)用。

一種釀酒酵母met6基因過表達突變株的構(gòu)建方法，其步驟如下：通過同源重組將含有強啟動子的目的片段與酵母基因組上met6基因的啟動子區(qū)域交換，獲得met6過表達菌株。

一種釀酒酵母met6基因過表達突變株sz1的構(gòu)建方法，其步驟如下：

釀酒酵母met6過表達突變株sz1構(gòu)建：釀酒酵母基因同源重組敲除原理、引物設(shè)計、敲除片段轉(zhuǎn)化方法按照文獻所描述的方法進行（yeast,1998,14:953-962），該方法是目前釀酒酵母中基因敲除的通用方法；

1）引物設(shè)計：依據(jù)釀酒酵母met6基因序列（genbank:bk006943.1）設(shè)計引物：

上游引物met6-p1：

tttttgttaaactcttcctttatcataaaaaagcaagcatctaagagcataaagggaataagggcgacac；

下游引物met6-p2：

tgatatgtactttgaaattatattggtattttgtttcttagagtgttgtcggttttttctccttgacgtt；

2）pcr擴增：利用上游引物met6-p1和下游引物met6-p2對質(zhì)粒psp72-ura3-pgal1（可通過addgene獲得）進行pcr擴增，獲得含釀酒酵母met6基因的啟動子上下游序列的gal1強啟動子片段；

3）met6基因的過表達：通過liac/peg的轉(zhuǎn)化方法將pcr擴增得到的敲除片段導(dǎo)入釀酒酵母by4742菌株細(xì)胞（by4742菌株來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，可以通過購買獲得），并通過ura標(biāo)記篩選得到具有ura合成基因的釀酒酵母的met6過表達突變株sz1（saccharomycescerevisiaesz1），此菌株已保藏，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期：2017年6月12日，保藏編號cctccno：m2017326，分類命名：釀酒酵母sz1(saccharomycescerevisiaesz1)。

一種利用釀酒酵母的met6基因過表達突變株sz1在提高硒代甲硫氨酸合成的應(yīng)用，其步驟是：

1）富硒過程：將met6過表達突變株sz1和by4742菌株分別從平板上接種于2mlypgal培養(yǎng)基（酵母提取物：1%，蛋白胨：2%，半乳糖：2%）中，200rpm/min，30°c振蕩培養(yǎng)24h；向培養(yǎng)基中添加終濃度為2.5mm的na2seo3，繼續(xù)200rpm/min，30°c振蕩培養(yǎng)24h，完成富硒；

2）胞內(nèi)硒代甲硫氨酸的收集：收集硒化后的酵母細(xì)胞（0.5g，濕重），用pbs溶液洗滌后分裝至裝好酸洗玻璃珠（sigma）的凍存管，用mini-beadbeater-16型玻璃珠細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，震蕩1min，冰上孵育1min；離心后收集上清，加入200mg的trypsin和10×tcsbuffer（1mtris-clph7.5,100mmcacl2,5%sds）于37°c孵育18h；離心后上清用0.22μm濾膜過濾后，加入40mg的蛋白酶14于37℃孵育24h；離心后上清用0.22μm濾膜過濾后，利用尺寸排阻色譜除去未被完全消解的蛋白質(zhì)（色譜柱為superdex200hr10/30column；儀器為島津公司色譜分離系統(tǒng)），其流動相組成為0.05mnah2po4-na2hpo4(ph7.2)，流動相流速為0.5ml/min，柱溫30°c，紫外檢測波長設(shè)定為220nm和280nm，收集保留時間為80-89min及101-104.5min的樣品；

3）將收集的樣品繼續(xù)注入高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀(hplc-icp-ms)中進行進一步的確認(rèn)，其流動相組成為甲酸/甲酸銨（25mm），0.1%（v/v）tfa，ph3.1，3%（v/v）甲醇；硒代甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購于sigma公司；得到野生型釀酒酵母細(xì)胞by4742和met6過表達突變株sz1富硒后胞內(nèi)的硒代甲硫氨酸含量分別為7.806μg/gsemet和21.15μg/gsemet。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果：

本發(fā)明首次將釀酒酵母met6基因和釀酒酵母富硒相關(guān)聯(lián)。利用強大的酵母遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，構(gòu)建了met6過表達突變株sz1，過表達met6基因，對胞內(nèi)硒代甲硫氨酸合成進行進一步的調(diào)控，對細(xì)胞硒代謝進行了改造，從而提高了胞內(nèi)硒代甲硫氨酸的合成能力。該菌株富硒后胞內(nèi)的硒代甲硫氨酸含量相對于野生型酵母細(xì)胞提升至少2倍。

附圖說明

圖1為一種pcr鑒定met6基因重組菌株sz1的電泳示意圖。

通過met6基因啟動子特異性同源重組驗證引物進行pcr，可以發(fā)現(xiàn)，在sz1模板的泳道中出現(xiàn)了大小為2200bp的特異性擴增條帶。

具體實施方式

下面以一種高產(chǎn)硒代甲硫氨酸富硒釀酒酵母的構(gòu)建及應(yīng)用為例，參照附圖進一步闡述本發(fā)明。

釀酒酵母by4742菌株和質(zhì)粒psp72-ura3-pgal1來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

【實施例1】一種釀酒酵母met6過表達突變株sz1的構(gòu)建方法

釀酒酵母met6過表達突變株sz1構(gòu)建：釀酒酵母基因同源重組敲除原理、引物設(shè)計、敲除片段轉(zhuǎn)化方法按照文獻所描述的方法進行（yeast,1998,14:953-962），該方法是目前釀酒酵母中基因敲除的通用方法；

1）引物設(shè)計：依據(jù)釀酒酵母met6基因序列（genbank:bk006943.1）設(shè)計引物：

上游引物met6-p1：

tttttgttaaactcttcctttatcataaaaaagcaagcatctaagagcataaagggaataagggcgacac；

下游引物met6-p2：

tgatatgtactttgaaattatattggtattttgtttcttagagtgttgtcggttttttctccttgacgtt；

2）pcr擴增：利用上游引物met6-p1和下游引物met6-p2對質(zhì)粒psp72-ura3-pgal1（可通過addgene獲得）進行pcr擴增，獲得含釀酒酵母met6基因的啟動子上下游序列的gal1強啟動子片段；

3）met6基因的過表達：通過liac/peg的轉(zhuǎn)化方法將步驟2）pcr擴增得到的敲除片段導(dǎo)入釀酒酵母by4742菌株細(xì)胞（by4742菌株來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，可以通過購買獲得），并通過ura標(biāo)記篩選得到具有ura合成基因的釀酒酵母的met6過表達突變株sz1（saccharomycescerevisiaesz1），保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2017326。

【實施例2】一種利用釀酒酵母的met6過表達突變株在提高硒代甲硫氨酸合成的應(yīng)用

將met6過表達突變株sz1和by4742菌株分別從平板上接種于2mlypgal培養(yǎng)基（酵母提取物：1%，蛋白胨：2%，半乳糖：2%）中，200rpm/min，30°c振蕩培養(yǎng)24h；向培養(yǎng)基中添加終濃度為2.5mm的na2seo3，繼續(xù)200rpm/min，30°c振蕩培養(yǎng)24h，完成富硒。收集硒化后的酵母細(xì)胞（0.5g，濕重），用pbs溶液洗滌后分裝至裝好酸洗玻璃珠（sigma）的凍存管，用mini-beadbeater-16型玻璃珠細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，震蕩1min，冰上孵育1min；離心后收集上清，加入200mg的trypsin和10×tcsbuffer（1mtris-clph7.5,100mmcacl2,5%sds）于37°c孵育18h。離心后上清用0.22μm濾膜過濾后，加入40mg的蛋白酶14于37℃孵育24h。離心后上清用0.22μm濾膜過濾后，利用尺寸排阻色譜除去未被完全消解的蛋白質(zhì)（色譜柱為superdex200hr10/30column；儀器為島津公司色譜分離系統(tǒng)），其流動相組成為0.05mnah2po4-na2hpo4(ph7.2)，流動相流速為0.5ml/min，柱溫30°c，紫外檢測波長設(shè)定為220nm和280nm，收集保留時間為80-89min及101-104.5min的樣品。

將收集的樣品繼續(xù)注入高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀(hplc-icp-ms)中進行進一步的確認(rèn)，其流動相組成為甲酸/甲酸銨（25mm），0.1%（v/v）tfa，ph3.1，3%（v/v）甲醇。硒代甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購于sigma公司。得到野生型釀酒酵母細(xì)胞by4742和met6過表達突變株sz1富硒后胞內(nèi)的硒代甲硫氨酸含量分別為7.806μg/gsemet和21.15μg/gsemet。

以上描述是對本發(fā)明的解釋，不是對本發(fā)明的限定，本發(fā)明所限定的范圍參見權(quán)利要求，在不違背本發(fā)明的精神的情況下，本發(fā)明可以做任何形式的修改。

sequencelisting

<110>武漢大學(xué)

<120>一種高產(chǎn)硒代甲硫氨酸釀酒酵母的構(gòu)建及應(yīng)用

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