Mdck細胞的凍存和復蘇的制作方法
【專利摘要】MDCK細胞的凍存和復蘇，它涉及MDCK細胞的凍存和復蘇。本發(fā)明的凍存方法為：通過限制凍存液在與細胞混合中的加入速率，防止細胞損壞，并通過調整降溫速率，防止細胞內產生冰晶，導致細胞死亡。并在細胞復蘇中，快速進行復蘇，保證了細胞的完整性，存活率。本發(fā)明的方法能夠很好的保持MDCK細胞活力。本發(fā)明的復蘇后的細胞活力達95％以上，保證了細胞質量，使其長期存活。
【專利說明】
MDCK細胞的凍存和復蘇
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種細胞的凍存和復蘇。
【背景技術】
[0002] 細胞的深低溫保存是困擾低溫生物學研究領域的復雜難題。細胞連接在組織中的 部位、結構和功能特殊，其對冷凍損傷的反應及冷凍損傷的保護機制也應具有其特殊性。因 此，有必要對深低溫保存中的細胞連接損傷特點和規(guī)律進行系統觀察和研究，建立針對性 的、有效的深低溫保存技術方案，提高和保證組織和器官的深低溫保存效果。研究表明，細 胞連接可能是深低溫保存過程中各種損傷因子作用靶點之一，并導致組織結構的損傷與破 壞。首先，細胞連接通過跨細胞膜蛋白，外聯相鄰細胞或基質，內聯細胞骨架蛋白，整個細胞 連接處于細胞內、外的不同部位，在深低溫保存過程中這些部位所受到的損傷壓力是不同 的，如水與離子運動導致的滲透壓變化、降溫和復溫過程中細胞體積變化造成的機械張力 等，增加了細胞連接組成蛋白結構的變化、破壞和變性等。
[0003] 在低于_70°C的超低溫條件下，有機體細胞內部的生化反應極其緩慢，甚至終止。 因此，采取適當的方法將生物材料降至超低溫，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老 死亡。當以適當的方法將凍存的生物材料恢復至常溫時，其內部的生化反應可恢復正常。細 胞凍存液是直接影響凍存后細胞活力、質量等的重要因素。冷凍速率直接決定這冷凍的效 果，細胞在冷凍過程中存在如下變化：當細胞被冷凍至-5°C時，因冷凍液中添加冷凍保護劑 而降低溶液的冰點，細胞內外溶液仍然沒有結冰，當被冷凍至_5°C~_15°C時，細胞外出現 結冰而細胞內并沒有出現結冰狀態(tài)，細胞內未結冰的水分子會比細胞外結冰的溶液中的水 分子具有更高的化學能，其結果是，細胞內的水分子為了和細胞外的水分子化學能保持平 衡，會向細胞外流動。冷凍速度不同，細胞內水分子向外流動的情況也不同，如果冷凍速度 慢，細胞內水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，細胞內溶質濃度增高，細胞內不會結冰;如果 冷凍速度快，細胞內水分沒有足夠的時間流出，結果隨著溫度的降低，細胞內結冰，如果冷 凍速度非常快，細胞內形成的冰晶非常小或者不結冰。
[0004] 現有常規(guī)的MDCK細胞凍存液有兩種，一種是由DMS0(二甲基亞砜）、FBS(胎牛血清） 和基礎培養(yǎng)基配制而成，另一種是由DMS0與FBS按體積比1:9配制而成。這是目前較為普遍 的細胞凍存方式，但是，采用上述凍存液進行凍存的操作，均是較為常規(guī)的方法進行的，使 得凍存的MDCK細胞復蘇后活率低，而且表面抗原丟失嚴重，影響實驗效果。因此，迫切需要 出現一種能夠效果保證凍存效果的方法，即能夠有效避免細胞連接受損的一種保護細胞連 接的深低溫保存方法。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明為了解決上述問題，而提供了一種有效的MDCK細胞的凍存和復蘇方法。
[0006] 本發(fā)明的MDCK細胞的凍存，它是按照以下步驟進行的：
[0007] -、取傳代培養(yǎng)至對數期的MDCK細胞，進行細胞消化培養(yǎng)后，離心，去上清，置于冰 浴中，加入凍存液重懸細胞，至細胞密度達5 X 106/mL，得細胞冷凍液;其中，凍存液采用滴 管沿凍存管壁滴加，滴加速度為:前3min按0.2mL/min的速度滴加，3~5min按0.5mL/min的 速度滴加，剩余時間按〇. 75mL/min的速度滴加；
[0008] 二、先將冷凍管降至4°C，然后以1.5°C/min的速度降至-8°C，再取出放入_10°C，然 后以1.0°C/min的速度降至-20°C，然后靜置30min，再以0.5°C/min的速度降至-80°C，最后 放入液氮保存；
[0009] 所述的凍存液由體積百分含量為10 %的DMS0和體積百分含量為90 %的胎牛血清 組成。
[0010] 本發(fā)明的MDCK細胞的復蘇，它是按照以下步驟進行的：
[0011] -、將細胞生長液放入37°C水浴中預熱，預熱后用75%的酒精擦拭盛有細胞生長 液的容器外壁，放入生物安全柜內；
[0012] 二、從液氮中取出權利要求1凍存的MDCK細胞，立即放入37 °C水浴解凍，輕搖使其 在lmin內全部融化，然后以75%的酒精擦拭保存管外部，置于生物安全柜內；
[0013] 三、將融化后的MDCK細胞懸液，加入到預熱至37°C的細胞生長液中，在lOOOrpm轉 速下離心5min，棄上清，再用預熱至37°C的含20 %胎牛血清細胞生長液重懸，即完成MDCK細 胞的復蘇。細胞復蘇后將在2-3小時貼壁，為保證細胞復蘇后良好快速的生長狀態(tài)，此時更 換含15 %胎牛血清細胞生長液，37 °C培養(yǎng)2-3小時，然后更換含10 %胎牛血清細胞生長液。
[0014] 所述的EDTA-胰酶為質量百分含量為0.25 %的EDTA-胰酶，其是由質量百分含量為 0.25 % 的胰酶和 0.53mMEDTA. 4Na 組成。
[0015] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0016] 本發(fā)明的凍存方法通過合理控制冷凍時的凍存速率，保持細胞內的水分不產生冰 晶，并能夠保證細胞處于冷凍狀態(tài)，而且本申請通過在凍存前對細胞進行處理，對凍存液加 入的速度進行限制，防止過度破壞細胞，如果加入快或者混合激烈，就會導致細胞損壞，導 致凍存過程中，細胞死亡。
[0017] 本發(fā)明的方法能夠很好的保持MDCK細胞活力。本發(fā)明的復蘇后的細胞活力達95% 以上，保證了細胞質量，使其長期存活。
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0018] 一:本實施方式的MDCK細胞的凍存，它是按照以下步驟進行的：
[0019] -、取傳代培養(yǎng)至對數期的MDCK細胞，進行細胞消化培養(yǎng)后，離心，去上清，置于冰 浴中，加入凍存液重懸細胞，至細胞密度達5 X 106/mL，得細胞冷凍液;其中，凍存液采用滴 管沿凍存管壁滴加，滴加速度為:前3min按0.2mL/min的速度滴加，3~5min按0.5mL/min的 速度滴加，剩余時間按〇. 75mL/min的速度滴加；
[0020] 二、先將冷凍管降至4°C，然后以1.5°C/min的速度降至-8°C，再取出放入_10°C，然 后以1.0°C/min的速度降至-20°C，然后靜置30min，再以0.5°C/min的速度降至-80°C，最后 放入液氮保存；
[0021] 所述的凍存液由體積百分含量為10 %的DMS0和體積百分含量為90 %的胎牛血清 組成。
[0022]
【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是：1 X l〇VmL的細胞密度 滴加 lOmL凍存液。其它與【具體實施方式】一相同。
[0023]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:在MDCK細胞凍存前，更 換細胞培養(yǎng)液，再進行細胞消化培養(yǎng)。其它與【具體實施方式】一相同。
[0024]【具體實施方式】四：本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:細胞消化過程如下： [0025] 一、首先將EDTA-胰酶在37 °C溫度下預熱，向傳代培養(yǎng)至對數期的MDCK細胞中加入 2ML的EDTA-胰酶，置于滅菌細胞瓶內，使EDTA-胰酶均勻分布在MDCK細胞薄層，37 °C lmin，然 后去除EDTA-胰酶；
[0026] 二、重新加入2mL預熱至37 °C的EDTA-胰酶，重復上述步驟；
[0027] 三、加入lmLEDTA-胰酶，搖勻，置于37 °C孵育3-5min，搖動細胞瓶至細胞成懸液，然 后加入lmL胎牛血清中和；
[0028]四、加入8mL細胞生長液，用移液管從細胞瓶底部的一邊向另一邊進行吹打，且避 免泡沫產生；
[0029] 五、吹打后再加入細胞生長液至細胞懸液濃度為1 X 106/mL細胞，即完成。
[0030] 其它與【具體實施方式】一相同。
[0031 ]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:傳代培養(yǎng)至對數期的 MDCK細胞是采用含10%胎牛血清的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的。其它與【具體實施方式】 一相同。
[0032]【具體實施方式】六:本實施方式的MDCK細胞的復蘇，它是按照以下步驟進行的：
[0033] 一、將細胞生長液放入37°C水浴中預熱，預熱后用75%的酒精擦拭盛有細胞生長 液的容器外壁，放入生物安全柜內；
[0034]二、從液氮中取出權利要求1凍存的MDCK細胞，立即放入37 °C水浴解凍，輕搖使其 在lmin內全部融化，然后以75%的酒精擦拭保存管外部，置于生物安全柜內；
[0035] 三、將融化后的MDCK細胞懸液，加入到預熱至37°C的細胞生長液中，在lOOOrpm轉 速下離心5min，棄上清，再用預熱至37°C的含20 %胎牛血清細胞生長液重懸，即完成MDCK細 胞的復蘇。細胞復蘇后將在2-3小時貼壁，為保證細胞復蘇后良好快速的生長狀態(tài)，此時更 換含15 %胎牛血清細胞生長液，37 °C培養(yǎng)2-3小時，然后更換含10 %胎牛血清細胞生長液。 [0036]本
【發(fā)明內容】
不僅限于上述各實施方式的內容，其中一個或幾個【具體實施方式】的組 合同樣也可以實現發(fā)明的目的。
[0037]通過以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：
[0038]以下實例所用的MDCK細胞均來源于國家⑶C流感中心。
[0039] 實施例1
[0040]在細胞凍存前，對MDCK細胞進行傳代培養(yǎng)：
[00411 1、將狀態(tài)良好，長成單層的MDCK細胞棄去細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用lmL的Hank's 平衡鹽溶液(購買自gibco公司，編號為14170-112)清洗細胞1次，棄掉洗液；
[0042] 2、向培養(yǎng)瓶內加入lmL預熱的胰酶，蓋好培養(yǎng)瓶，將其放入37°C溫箱lmin，棄掉胰 酶；
[0043] 3、重復步驟2;
[0044] 4、培養(yǎng)瓶內加入lmL預熱的胰酶，蓋好培養(yǎng)瓶，將其放入37 °C溫箱1~4min，期間顯 微鏡下觀察細胞狀態(tài)，當細胞出現明顯細胞間隙時終止消化過程，棄掉胰酶；
[0045] 5、加入0.2mL胎牛血清中和殘余胰酶的活性，再補加8mL的細胞培養(yǎng)液（當用于后 續(xù)傳代時，培養(yǎng)瓶內剩余細胞，需要補加8mL量的細胞培養(yǎng)液；當用于后續(xù)凍存時，培養(yǎng)瓶內 剩余細胞，需要補加8mL量的細胞培養(yǎng)液），將細胞瓶輕輕拍打制成細胞懸液分裝至T-25細 胞瓶中，在37°C溫箱培養(yǎng)，隔天更換細胞培養(yǎng)液，待MDCK細胞長成單層后停止培養(yǎng)，為分離 流感病毒備用；其中，步驟五中所述的細胞培養(yǎng)液的pH為7.5，細胞培養(yǎng)液為:每lmL細胞培 養(yǎng)液含有〇 . 84mL的MEM、0.1 lmL的胎牛血清、0.012mL的L-谷氨酰胺、0.0 lmL的青鏈霉素和 0.015mL的羥乙基哌嗪乙硫磺酸。
[0046]上述細胞培養(yǎng)液中的成分均購買自Gibco公司，其中，MEM的商品編號：933346，胎 牛血清(FBS)的商品編號：348555，L-谷氨酰胺(L-Gln)的商品編號:872417，青鏈霉素(？.5) 的商品編號:918576，羥乙基哌嗪乙硫磺酸(ifepes)的商品編號:908816。
[0047]將上述培養(yǎng)后的MDCK細胞進行凍存，過程如下：
[0048] 1、細胞凍存材料
[0049] 1)成片的MDCK細胞:80 %~90 %成片，細胞生長良好存活率高；
[0050] 2)體積百分含量為10 %的DMS0;體積百分含量為90 %的胎牛血清
[0051 ] 3)0.25%的EDTA-胰酶（質量百分含量為0.25%的胰酶;0.53mMEDTA.4Na)。
[0052] 4)無菌移液管：lmL和10mL;
[0053] 5)15mL無菌離心管。
[0054] 2、凍存過程如下：
[0055] 一、取傳代培養(yǎng)至對數期的MDCK細胞，進行細胞消化培養(yǎng)后，移入15mL無菌離心 管，lOOOrpm，離心5min，去上清，置于冰浴中，加入凍存液重懸細胞(添加過程中緩慢加入， 避免劇烈操作），至細胞密度達5X 106/mL，得細胞冷凍液;其中，凍存液采用滴管沿凍存管 壁滴加，滴加速度為:前3min按0 · 2mL/min的速度滴加，3~5min按0 · 5mL/min的速度滴加，剩 余時間按0.75mL/min的速度滴加；
[0056] 二、先將冷凍管降至4°C，然后以1.5°C/min的速度降至-8°C，再取出放入_10°C，然 后以1.0°C/min的速度降至-20°C，然后靜置30min，再以0.5°C/min的速度降至-80°C，最后 放入液氮保存；
[0057] 所述的凍存液由體積百分含量為10 %的DMS0和體積百分含量為90 %的胎牛血清 組成。
[0058]所述的細胞消化過程如下：
[0059] 一、首先將EDTA-胰酶在37 °C溫度下預熱，向傳代培養(yǎng)至對數期的MDCK細胞中加入 2ML的EDTA-胰酶，置于滅菌細胞瓶內，使EDTA-胰酶均勻分布在MDCK細胞薄層，37 °C lmin，然 后去除EDTA-胰酶；
[0060] 二、重新加入2ML預熱至37 °C的EDTA-胰酶，重復上述步驟；
[00611 三、加入lmLEDTA-胰酶，搖勻，置于37 °C孵育3-5min，搖動細胞瓶至細胞成懸液，然 后加入lmL胎牛血清中和；
[0062]四、加入8mL細胞生長液，用移液管從細胞瓶底部的一邊向另一邊進行吹打，且避 免泡沫產生；
[0063] 五、吹打后再加入細胞生長液至細胞懸液濃度為1 X 106/mL細胞，即完成。
[0064]傳代培養(yǎng)至對數期的MDCK細胞是采用含10%胎牛血清的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基進 行培養(yǎng)的。
[0065] 對上述凍存后的MDCK細胞進行復蘇，過程如下：
[0066] 一、將細胞生長液放入37°C水浴中預熱，預熱后用75%的酒精擦拭盛有細胞生長 液的容器外壁，放入生物安全柜內；
[0067]二、從液氮中取出凍存的MDCK細胞，檢查放置MDCK細胞的凍存管蓋子是否擰緊，避 免熱脹冷縮過程蓋子松掉，立即放入37°C水浴解凍，輕搖使其在lmin內全部融化，然后以 75 %的酒精擦拭保存管外部，置于生物安全柜內；
[0068] 三、將融化后的MDCK細胞懸液，加入到預熱至37°C的細胞生長液中，在lOOOrpm轉 速下離心5min，棄上清，再用預熱至37°C的含20 %胎牛血清細胞生長液重懸，即完成MDCK細 胞的復蘇。細胞復蘇后將在2-3小時貼壁，為保證細胞復蘇后良好快速的生長狀態(tài)，此時更 換含15 %胎牛血清細胞生長液，37 °C培養(yǎng)2-3小時，然后更換含10 %胎牛血清細胞生長液。 [0069] 實施例2
[0070] 本實施例采用常規(guī)凍存及復蘇方法，作為對照試驗。
[0071] 1、細胞凍存步驟
[0072] 凍存液的配置
[0073] 胎牛血清：9ml
[0074] 二甲基亞砜：1ml
[0075] (2)細胞消化。
[0076] (3)細胞消化后，加入配置好的細胞凍存液，混勻后分裝到細胞凍存管內。
[0077] 細胞凍存濃度為IX 106
[0078] (4)細胞凍存過程:4°C 2小時，-20 °C 2小時，放入液氮長期保存。
[0079] 2、細胞復蘇過程：
[0080] (1)將細胞生長液放入37 °C回溫，回溫后以70 %~75 %的酒精擦拭，放入生物安全 柜(或無菌的操作臺）內。
[0081] (2)自液氮中取出細胞凍存管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程蓋子容易松 掉。
[0082] (3)立即放入37 °C水浴中快速解凍，輕輕搖動使其在1分鐘內全部融化，以70 %~ 75%的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜(或無菌操作臺）。
[0083] (4)取出1.0ml解凍的細胞懸液，緩慢加入有生長液的細胞培養(yǎng)瓶內，混合均勻，放 入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0084] (5)次日，更換細胞生長液。
[0085]對復蘇后的MDCK細胞進行以下檢測：
[0086] 1、MDCK細胞敏感性檢測
[0087]選擇已知的TCID5Q的流感病毒，在同一條件下分別感染早代（小于30代）的細胞株 和現有的細胞株，對其進行TCID5Q測定。如果測試的TCID5Q比早代的低2個或以上Lg，表明其 對病毒的敏感性已經下降，不應繼續(xù)使用。如果兩者相差不超出一個Lg，表明可繼續(xù)使用。 [0088] 2、流感病毒分離
[0089] 采用MDCK細胞進行甲型H1N1流感病毒分離，通過MDCK細胞分離的流感病毒與原始 標本相似。另外，由于"〇"相毒株的重現，MDCK細胞對"0"相毒株的敏感性高，因此，采用MDCK 細胞分離病毒，對復蘇后的MDCK細胞效果進行驗證。
[0090] 1)實驗材料
[0091] 75~90%成片的MDCK細胞，T-25細胞瓶；TPCK處理胰酶（牛胰腺來源Vni)(SIGMA T8802); HEPES緩沖液，1M母液;D-MEM培養(yǎng)基(高糖，含有L-谷氨酰胺），HanK' s液;青、鏈霉素 母液(10000U/mL青霉素 G，10000yg/mL硫酸鏈霉素）；牛血清白蛋白組分V，7.5 %溶液(GIBC0 Cat No 15260);處理好的臨床標本0.5mL;無菌移液管。
[0092] 2)培養(yǎng)基和試劑的準備
[0093] a)青、鏈霉素母液(終濃度：100U/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素）
[0094] b)牛血清白蛋白組分V 12.5mL(終濃度:25mM)
[0095] c)HEPES 緩沖液12 · 5mL(終濃度：25mM)
[0096] d)加入7 · 5 % NaHC0310~15mL(終濃度：2~3 % )。
[0097] 3、流感病毒MDCK細胞分離過程
[0098] (1)75~90%成片細胞的準備
[0099] a)用40倍光學顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，選擇處于對數生長期的MDCK細胞用于病 毒分咼。
[0100] b)輕倒出細胞生長液，用10mL的無菌移液管吸6mLpH 7 · 4~7 · 6的HanK ' s液(或roS 緩沖液)清洗細胞3遍。
[0101] (2)接種與細胞培養(yǎng)瓶
[0102] a)用無菌的移液管將清洗細胞的HanK's液從細胞培養(yǎng)瓶中移出。
[0103] b)用無菌的移液管吸取500μ1臨床樣品置于細胞瓶中，溫和搖動數次，使之均與鋪 于細胞培養(yǎng)瓶底。
[0104] C)將步驟2)中培養(yǎng)瓶放入35°C，5%C02培養(yǎng)箱中吸附1~2h。
[0105] d)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，用10mL的無菌移液管吸取6mL pH 7.4-7.6的他111(、液 (或PBS緩沖液)清洗細胞，加入5mL含終濃度2yg/mLTPCK處理胰酶病毒生長液于細胞培養(yǎng)瓶 中。
[0106] e)放置于35°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0107] f)每日觀察細胞病變情況(細胞病變的特征是細胞腫脹圓化，細胞間隙增大成網 狀，細胞核固縮或破裂，嚴重時細胞部分或全部脫落）。
[0108] (3)細胞培養(yǎng)物的收獲
[0109] a)當75%~100%細胞出現病變時進行收獲，即使無細胞病變也應于第7天收獲。
[0110] b)進行紅細胞凝集實驗(HA)，用HI方法進行流感病毒的鑒定。對于HA彡8的細胞分 離物，進行ΚΓ1~10-3稀釋后，再感染細胞繼續(xù)進行細胞傳代，直至HA多8時才能利用HI方法 進行病毒的鑒定。經連續(xù)傳代2此以上，HA〈8者，可以用核酸檢測方法鑒定分型。
[0111] 流感病毒分離結果如表2所示，
[0112] 4、復蘇后的MDCK細胞存活率測定
[0113] 取細胞復蘇后的細胞懸液，按每mL細胞懸液加10yL的0.1 %臺盼藍溶液，混合均 勻，靜置10min。吸取混合液，滴入細胞計數板內，在顯微鏡下觀察計數。凡折光性強而不著 色者為活細胞，染藍色者為死細胞，計數1000個細胞，計算細胞存活力，具體公式為：
[0114]活細胞率（％ )=活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數）X 100;
[0115] 結果顯示:采用實施例1(即本發(fā)明的方法)的存活率能夠達到95%以上，而采用實 施例2的方法存活率最高能達到90%。
[0116] 5、復蘇后的MDCK細胞形態(tài)學觀察
[0117] 采用實施例1的凍存液凍存的細胞，在細胞復蘇過程，培養(yǎng)MDCK細胞開始貼壁，在 倒置顯微鏡下觀察復蘇后的細胞狀態(tài)，生長過程中仍舊保持幾個至十幾個細胞聚集生長的 特性，細胞形態(tài)良好;培養(yǎng)24h后，可見95%以上的MDCK細胞大面積貼壁生長，無懸浮細胞， 細胞呈鋪路石樣生長，大小均勻，折光性好，顯示活力旺盛;結果見表1所示;實施例2對比試 驗的凍存液，復蘇培養(yǎng)24h后，懸浮細胞較多，貼壁生長的細胞形狀不規(guī)則，折光性較差，活 力較低。
[0118] 表1復蘇后MDCK細胞狀態(tài)
[0119]
[0120] 表2甲型H1N1流感病毒分離對比 [0121]
[0122]~綜合以上分析，可知，采用本發(fā)明的技術方案MDCK細胞凍存復蘇效果，均優(yōu)于現有 方案。
【主權項】
1. MDCK細胞的凍存，其特征在于它是按照以下步驟進行的： 一、 取傳代培養(yǎng)至對數期的MDCK細胞，進行細胞消化培養(yǎng)后，離心，去上清，置于冰浴 中，加入凍存液重懸細胞，至細胞密度達5 X 106/mL，得細胞冷凍液;其中，凍存液采用滴管 沿凍存管壁滴加，滴加速度為：前3min按0.2mL/min的速度滴加，3~5min按0.5mL/min的速 度滴加，剩余時間按0.75mL/min的速度滴加； 二、 在步驟一處理后，先將冷凍管降至4°C，然后以1.5°C/min的速度降至-8°C，再取出 放入-10°C，然后以1.0°C/min的速度降至-20°C，然后靜置30min，再以0.5°C/min的速度降 至-80°C，最后放入液氮保存； 所述的凍存液由體積百分含量為10 %的DMSO和體積百分含量為90 %的胎牛血清組成。2. 根據權利要求1所述的MDCK細胞的凍存，其特征在于lX107/mL的細胞密度滴加10mL 凍存液。3. 根據權利要求1所述的MDCK細胞的凍存，其特征在于在MDCK細胞凍存前，更換細胞培 養(yǎng)液，再進行細胞消化培養(yǎng)。4. 根據權利要求1所述的MDCK細胞的凍存，其特征在于細胞消化過程如下： 一、 首先將EDTA-胰酶在37°C溫度下預熱，向傳代培養(yǎng)至對數期的MDCK細胞中加入2ML 的EDTA-胰酶，置于滅菌細胞瓶內，使EDTA-胰酶均勻分布在MDCK細胞薄層，37°C lmin，然后 去除EDTA-胰酶； 二、 重新加入2mL預熱至37 °C的EDTA-胰酶，重復上述步驟； 三、 加入lmL EDTA-胰酶，搖勻，置于37 °C孵育3-5min，搖動細胞瓶至細胞成懸液，然后 加入lmL胎牛血清中和； 四、 加入8mL細胞生長液，用移液管從細胞瓶底部的一邊向另一邊進行吹打，且避免泡 沫產生； 五、 吹打后再加入細胞生長液至細胞懸液濃度為IX 10%L細胞，即完成。5. 根據權利要求1所述的MDCK細胞的凍存，其特征在于傳代培養(yǎng)至對數期的MDCK細胞 是采用含10%胎牛血清的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的。 6. MDCK細胞的復蘇，其特征在于它是按照以下步驟進行的： 一、 將細胞生長液放入37 °C水浴中預熱，預熱后用75 %的酒精擦拭盛有細胞生長液的 容器外壁，放入生物安全柜內； 二、 從液氮中取出權利要求1凍存的MDCK細胞，立即放入37 °C水浴解凍，輕搖使其在 lmin內全部融化，然后以75%的酒精擦拭保存管外部，置于生物安全柜內； 三、 將融化后的MDCK細胞懸液，加入到預熱至37°C的細胞生長液中，在lOOOrpm轉速下 離心5min，棄上清，再用預熱至37°C的含20%胎牛血清細胞生長液重懸，即完成MDCK細胞的 復蘇。細胞復蘇后將在2-3小時貼壁，為保證細胞復蘇后良好快速的生長狀態(tài)，此時更換含 15 %胎牛血清細胞生長液，37 °C培養(yǎng)2-3小時，然后更換含10 %胎牛血清細胞生長液。
【文檔編號】A01N1/02GK105994255SQ201610656380
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月11日
【發(fā)明人】張崇華, 任莉娜, 魏麗娜
【申請人】哈爾濱市疾病預防控制中心