本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種檢測肺癌相關(guān)基因熱點突變的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。隨著醫(yī)學診斷技術(shù)特別是分子診斷技術(shù)的不斷提高，針對肺癌的新的基因不斷被發(fā)現(xiàn)，基于驅(qū)動基因的新型靶向藥物不斷涌現(xiàn)，肺癌精準治療成為了關(guān)注的熱點。肺癌相關(guān)基因(alk，braf，egfr、kras和nras)的熱點突變，有如下：alk基因的熱點突變，涉及1151tins、l1152r、c1156y、f1174la、l1196m、g1202r、s1206y、g1269a等；braf基因的熱點突變，v600e；egfr基因的熱點突變，涉及g719a、g719c、g719s、a763_y764insfqea、t790m、l858r等；kras基因的熱點突變，涉及g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、q61k、q61l、q61r、q61h等。目前已報道的檢測肺癌相關(guān)基因突變的方法有：1)直接測序法。用pcr擴增產(chǎn)物進行測序和ta克隆并再次測序以最終確定突變的堿基位置。該方法比較繁瑣、耗時長，而且由于自身的限制導致其靈敏度不高，只能對含量大于20％的基因突變進行檢測。因此，此法不適合在臨床中應(yīng)用。2)變性高效液相色譜法(dhplc)。該方法對已知和未知的突變位點均可以檢測，靈敏性在5％左右，但檢測過程中需要打開反應(yīng)管，容易造成污染，而且陽性結(jié)果不能確認具體位置，最終需要測序確認。3)高分辨率溶解曲線(hrm)是基于核酸的物理性質(zhì)，通過飽和染料結(jié)合于pcr擴增產(chǎn)物，監(jiān)控產(chǎn)物溶解曲線的變化分析基因突變。檢測敏感性在5％左右，對于陽性結(jié)果并不能確認具體位置，最終需要測序確認。4)探針擴增組織突變法(arms)。利用引物的3’端末位堿基必須與其模板dna互補才能有效擴增的原理，設(shè)計針對突變位點的特異性pcr擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物的3’堿基與模板配對時pcr擴增反應(yīng)才能正常進行，從而檢測出突變。通過設(shè)計兩個5’端引物，一個與正常dna互補，一個與突變dna互補，對于純合性突變，分別加入兩種引物及3’端引物進行兩個平行的pcr，結(jié)合有與突變dna完全互補的引物才可以延伸并得到pcr擴增產(chǎn)物，該檢測方法的靈敏度在1％左右。5)等位基因特異的taqman聚合酶鏈式反應(yīng)(cast-pcr)。該方法采用優(yōu)化taqman探針，通過一段特異設(shè)計的mgb探針來阻止引物與野生型dna結(jié)合，選擇性的優(yōu)化擴增突變型dna，該檢測方法的靈敏度在1～0.1％左右。這些技術(shù)的靈敏度都不高，檢測的特異性差，不能滿足對肺癌檢測的需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種檢測肺癌相關(guān)基因熱點突變的試劑盒及其應(yīng)用。首先，本發(fā)明要求保護引物對組和/或記載有“檢測待測者的肺癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變的方法”的可讀性載體在制備用于檢測肺癌相關(guān)基因突變的試劑盒中的應(yīng)用；所述肺癌相關(guān)基因為alk基因、braf基因、egfr基因和kras基因。所述引物對組由(1)-(4)所示的特異于alk基因的4個引物對、(5)所示的特異于braf基因的1個引物對、(6)-(12)所示的特異于egfr基因的7個引物對和(13)-(14)所示的特異于kras基因的2個引物對組成；(1)由序列表中序列1和序列2所示的兩個單鏈dna組成的引物對1；(2)由序列表中序列3和序列4所示的兩個單鏈dna組成的引物對2；(3)由序列表中序列5和序列6所示的兩個單鏈dna組成的引物對3；(4)由序列表中序列7和序列8所示的兩個單鏈dna組成的引物對4；(5)由序列表中序列9和序列10所示的兩個單鏈dna組成的引物對5；(6)由序列表中序列11和序列12所示的兩個單鏈dna組成的引物對6；(7)由序列表中序列13和序列14所示的兩個單鏈dna組成的引物對7；(8)由序列表中序列15和序列16所示的兩個單鏈dna組成的引物對8；(9)由序列表中序列17和序列18所示的兩個單鏈dna組成的引物對9；(10)由序列表中序列19和序列20所示的兩個單鏈dna組成的引物對10；(11)由序列表中序列21和序列22所示的兩個單鏈dna組成的引物對11；(12)由序列表中序列23和序列24所示的兩個單鏈dna組成的引物對12；(13)由序列表中序列25和序列26所示的兩個單鏈dna組成的引物對13；(14)由序列表中序列27和序列28所示的兩個單鏈dna組成的引物對14。所述檢測待測者的肺癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變的方法，具體可包括如下步驟：(a)從待測者的血漿樣本中提取游離核酸為模板，以所述引物對組中的各引物進行pcr擴增，得到擴增產(chǎn)物；(b)對所述擴增產(chǎn)物進行磁珠純化回收，得到回收產(chǎn)物1；(c)對所述回收產(chǎn)物1進行pcr富集，得到富集產(chǎn)物；(d)對所述富集產(chǎn)物進行磁珠純化回收，得到回收產(chǎn)物2；(e)對所述回收產(chǎn)物2進行高通量測序，根據(jù)測序結(jié)果確定所述待測者的肺癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變。步驟(a)中，進行所述pcr擴增時，所述引物對組中的各引物對被分在兩組分別進行多重pcr擴增；其中一組中的引物有所述引物對1、所述引物對3、所述引物對5、所述引物對7、所述引物對9、所述引物對11和所述引物對13，另一組中的引物有所述引物對2、所述引物對4、所述引物對6、所述引物對8、所述引物對10、所述引物對12和所述引物對14。兩組多重pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系，各引物均為等摩爾使用。兩組多重pcr反應(yīng)的反應(yīng)程序，退火溫度均為65℃。其中，所述高通量測序可為illumina測序，具體如nextseq500測序。其次，本發(fā)明還要求保護一種用于檢測肺癌相關(guān)基因突變的試劑盒。所述肺癌相關(guān)基因為alk基因、braf基因、egfr基因和kras基因。本發(fā)明所提供的用于檢測肺癌相關(guān)基因突變的試劑盒中含有前文所述的引物對組。根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有前文所述的記載有“檢測待測者的肺癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變的方法”的可讀性載體。另外，為了便于判斷所述待測者的肺癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變，所述試劑盒中還可含有正常人基因組dna對照品。當然，所述試劑盒中還可含有pcr反應(yīng)所需的常規(guī)試劑。再次，本發(fā)明還要求保護一種檢測待測者的肺癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變的方法。該方法可為非疾病診斷治療方法，也可為疾病診斷治療方法。當該方法為疾病診斷治療方法時，該方法具體為通過檢測待測者的肺癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變來診斷所述待測者是否患有肺癌。本發(fā)明所提供的檢測待測者的肺癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變的方法，具體可包括如下步驟：(a)從待測者的血漿樣本中提取游離核酸為模板，以所述引物對組中的各引物進行pcr擴增，得到擴增產(chǎn)物；(b)對所述擴增產(chǎn)物進行磁珠純化回收，得到回收產(chǎn)物1；(c)對所述回收產(chǎn)物1進行pcr富集，得到富集產(chǎn)物；(d)對所述富集產(chǎn)物進行磁珠純化回收，得到回收產(chǎn)物2；(e)對所述回收產(chǎn)物2進行高通量測序，根據(jù)測序結(jié)果確定所述待測者的肺癌相關(guān)基因是否發(fā)生突變。步驟(a)中，進行所述pcr擴增時，所述引物對組中的各引物對被分在兩組分別進行多重pcr擴增；其中一組中的引物有所述引物對1、所述引物對3、所述引物對5、所述引物對7、所述引物對9、所述引物對11和所述引物對13，另一組中的引物有所述引物對2、所述引物對4、所述引物對6、所述引物對8、所述引物對10、所述引物對12和所述引物對14。兩組多重pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系，各引物均為等摩爾使用。兩組多重pcr反應(yīng)的反應(yīng)程序，退火溫度均為65℃。其中，所述高通量測序可為illumina測序，具體如nextseq500測序。本發(fā)明以血漿作為檢測樣本，有多種優(yōu)勢，首先可以替代有風險的侵入性組織活檢，并且不會受到病灶位置的局限，同時檢測到多個轉(zhuǎn)移病灶的遺傳變化，還可在整個治療過程中進行多次檢測。本發(fā)明方法克服了傳統(tǒng)檢測方法的不足(如由于ctdna在血液樣本中的含量非常低(<1.0％)，檢測難度大，并且大多數(shù)針對ctdna的檢測只能識別單一的熱點突變或少數(shù)幾個基因突變)，針對肺癌相關(guān)基因(alk基因、braf基因、egfr基因和kras基因)熱點突變設(shè)計特異性引物14對，可準確有效地監(jiān)測肺癌相關(guān)基因的突變，該檢測方法的靈敏度在0.05％?？蓽蚀_有效地監(jiān)測肺癌相關(guān)基因的突變。將來自患者的基因文庫進行分析，全面、系統(tǒng)、準確地解讀腫瘤藥物與基因的關(guān)系，獲得患者特異性腫瘤突變位點。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、本發(fā)明檢測肺癌相關(guān)基因突變的方法的建立及應(yīng)用一、供試樣本來源于中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院被臨床診斷為肺癌的患者的血漿樣本，編號為2015-r-oncoamp067(患者知情且同意)。采用康為世紀游離dna提取試劑盒cw2603s提取血漿游離dna，備用。二、檢測待測樣本肺癌相關(guān)基因突變情況其中，本發(fā)明涉及肺癌相關(guān)基因(alk，braf，egfr、kras和nras)的熱點突變，具體如下：(1)alk基因的熱點突變：涉及1151tins、l1152r、c1156y、f1174la、l1196m、g1202r、s1206y、g1269a等；(2)braf基因的熱點突變：v600e；(3)egfr基因的熱點突變：涉及g719a、g719c、g719s、a763_y764insfqea、t790m、l858r等；(4)kras基因的熱點突變：涉及g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、q61k、q61l、q61r、q61h等。本發(fā)明所提供的檢測待測樣本肺癌相關(guān)基因突變情況的大體流程如下：(1)step1pcr擴增，擴增目的基因片段；(2)瓊脂糖凝膠電泳，并磁珠純化回收；(3)pcr富集；(4)瓊脂糖凝膠電泳和磁珠純化回收；(5)高通量測序。1、肺癌相關(guān)基因突變檢測引物共14對，分別放在2個pool。具體見表1。表114對肺癌相關(guān)基因突變檢測引物2、將2ml血漿游離dna平分為2份，分別作為每個pool的模板。具體反應(yīng)體系如表2和表3所示。反應(yīng)程序如表4所示。表2pool-1的pcr反應(yīng)體系組成體積(μl)5×phusionhfbuffer40dntps(2.5mm)19.2pool-1fpmix(1μm)4pool-1rpmix(1μm)4phusionhotstartⅱdnapolymerase4dna1ml血漿游離dnaddh2o補足到200μl表3pool-2的pcr反應(yīng)體系表4pool-1和pool-2的pcr反應(yīng)程序3、2％凝膠電泳制備2％瓊脂糖凝膠，pool-1和pool-2反應(yīng)體系各取3.5μlpcr產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。電壓設(shè)置：200v；時間：10min。檢測結(jié)果可目的條帶約200bp，或者只有引物二聚體沒有目的條帶(產(chǎn)物量較低，凝膠無法顯示)均屬正?，F(xiàn)象，可繼續(xù)下步實驗。4、產(chǎn)物純化將同一待檢樣本的pool-1產(chǎn)物和pool-2產(chǎn)物混合于1.5mlep管中；進行磁珠純化，具體步驟如下：1)瓊脂糖凝膠電泳檢測確定擴增有效后，對剩余pcr產(chǎn)物進行磁珠純化；2)向pcr產(chǎn)物中加入1.2倍體積的磁珠(beckman公司的ampure，貨號是a63881)，上下抽吸混勻至少二十次；3)將混合液放在室溫下5分鐘，使dna充分被吸附在磁珠上。4)吸附結(jié)束后，置于磁力架上室溫放置5分鐘(不要旋轉(zhuǎn)tube)5)待溶液變得清澈后，用移液器將澄清的液體移棄(注意：槍頭不要碰到磁珠)。6)保持8連管在磁力架上不動，加入200μl80％酒精(酒精配置時間在兩周以內(nèi)，并確保封閉好)，室溫放置30秒后移棄澄清液。7)重復步驟6)一次，并將管底的殘留液體徹底吸干。8)將反應(yīng)管從磁力架上移開，室溫放置5分鐘(此步驟是為了徹底揮發(fā)掉殘留的酒精，以免影響后續(xù)反應(yīng)實驗)。9)加入33μl的ddh2o，槍頭吹打充分混勻，室溫放置3分鐘。10)將反應(yīng)管置于磁力架上，室溫放置5分鐘。11)轉(zhuǎn)移步驟10)反應(yīng)管中30μl澄清液與對應(yīng)的已經(jīng)貼好條形碼編號的離心管中，蓋上管蓋；12)文庫樣本可置于-20℃長期保存。5、pcr富集具體反應(yīng)體系如表5所示。反應(yīng)程序如表6所示。表5pcr富集的反應(yīng)體系組成體積(μl)5×phusionhfbuffer10dntps(2.5mm)4.8富集反應(yīng)fprimer(50μm)2富集反應(yīng)rprimer(50μm)2phusionhotstartⅱdnapolymerase1step1pcr產(chǎn)物100ngddh2o補足至50表6pcr富集的反應(yīng)程序6、2％凝膠電泳制備2％瓊脂糖凝膠，取3.5μlpcr產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。電壓設(shè)置：200v；時間：10min。使用凝膠成像系統(tǒng)對其進行掃描，在200～300bp之間有目的條帶。7、產(chǎn)物純化詳細步驟參見“4、產(chǎn)物純化”。8、qubit測定濃度使用invitrogenqubit(q32857)測定文庫濃度。9、高通量測序使用nextseq500進行高通量測序，獲得待檢樣本的序列信息。10、生物信息分析使用生物信息學軟件對待檢樣本序列信息進行分析，結(jié)果如表7所示。表7待測樣本肺癌相關(guān)基因突變情況檢測結(jié)果注：實驗過程中pcr及相關(guān)步驟會產(chǎn)生部分背景突變，經(jīng)過研究對比在0.05％以下；因此該檢測中0.05％以下突變頻率的可信度會降低。<110>邁基諾（重慶）基因科技有限責任公司<120>一種檢測肺癌相關(guān)基因熱點突變的試劑盒及其應(yīng)用<130>gncln171096<160>28<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1tacctgatgatcagggcttccat23<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2ctctgtaggctgcagttctcag22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3tctctcggaggaaggacttgag22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4cctctctgctctgcagcaaatt22<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5actcttgctccttccatccttg22<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6gttcatcctgctggagctcat21<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>7gggtgaggcagtctttactcac22<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>8cctttcttcccagagacattgctg24<210>9<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223><400>9tcagtggaaaaatagcctcaattcttacc29<210>10<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>10cttcatgaagacctcacagtaaaaataggt30<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>11gcctcttacacccagtggagaa22<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>12tgtgccagggaccttaccttat22<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>13gcaccatctcacaattgccagt22<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>14ccttgttggctttcggagatgt22<210>15<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>15aaattcccgtcgctatcaaggaat24<210>16<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>16ctgccagacatgagaaaaggtg22<210>17<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>17catgcgaagccacactgac19<210>18<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>18ggcatgagctgcgtgatga19<210>19<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>19tacgtgatggccagcgtgg19<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>20ccaatattgtctttgtgttcccgg24<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>21gcctcctggactatgtccg19<210>22<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>22ggatcctggctccttatctccc22<210>23<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>23gccaggaacgtactggtgaaaa22<210>24<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>24cctaaagccacctccttactttgc24<210>25<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223><400>25tacctctattgttggatcatattcgtcca29<210>26<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223><400>26attataaggcctgctgaaaatgactga27<210>27<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>27tcctcatgtactggtccctcat22<210>28<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223><400>28gtttctcccttctcaggattcctac25當前第1頁12