專利名稱：一種殺蟲綠僵菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物新菌株，具體涉及一種殺蟲綠僵菌菌株及其應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
稻縱卷葉螟是水稻主要害蟲之一，國內(nèi)稻縱卷葉螟廣泛分布于全國各稻區(qū)，嚴(yán)重的威脅著我國糧食生產(chǎn)。目前，主要施用廣譜性化學(xué)農(nóng)藥控制稻縱卷葉螟，不僅直接影響人體健康和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的安全，而且由于稻縱卷葉螟產(chǎn)生抗藥性和化學(xué)農(nóng)藥大量殺傷稻縱卷葉螟天敵，破壞稻田生態(tài)平衡，嚴(yán)重削弱田間自然控制能力，容易導(dǎo)致稻縱卷葉螟的再猖獗、難以控制。昆蟲病原真菌是最重要的殺蟲微生物類群，在自然條件下約70%的昆蟲病害是真菌引起的，是唯一具有觸殺特性和流行性的病原微生物，其致病機制復(fù)雜，因而盡管它是最早應(yīng)用于害蟲防治的微生物，但是仍未發(fā)現(xiàn)有抗性害蟲產(chǎn)生，對解決害蟲的抗藥性問題極具潛力。因此，真菌作為重要的替代農(nóng)藥，近年來受到廣泛關(guān)注；國內(nèi)對生防真菌的研究始于20世紀(jì)50年代，目前在殺蟲真菌液固兩相生產(chǎn)技術(shù)、制劑研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)等方面處于國際領(lǐng)先地位。迄今為止，國內(nèi)外先后登記注冊殺蟲真菌農(nóng)藥100多個。殺蟲真菌具有較強的垂直和水平擴散能力，容易形成流行病，有助于害蟲的持續(xù)控制，對于遷飛性害蟲稻縱卷葉螟的控制尤為有利，但利用真菌控制稻縱卷葉螟尚未見到相關(guān)報道，其主要原因之一是缺乏高毒力殺蟲真菌菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對稻縱卷葉螟具有殺蟲效果好、生產(chǎn)性狀好的綠僵菌菌株 CQMa421。本發(fā)明菌株是通過采集自然感染的稻縱卷葉螟僵蟲直接分離篩選出的一株生產(chǎn)性狀好、對稻縱卷葉螟具有高毒力的金龜子綠僵菌小孢變種(Me tarhizium anisopliae var. miso/^iae)菌株CQMa421，已于2011年02月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號CGMCC NO. 4609。本發(fā)明綠僵菌菌株CQMa421接種在1/4SDA平板上，培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)特征， 顯示在1/4SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期菌落呈白色棉絮狀，產(chǎn)孢時橄欖綠色；菌絲具有分隔和分支、透明，直徑為1. 5-2. OMffl ；分生孢子孢子梗單生或聚集或緊密排列，呈帚狀分支，直徑約為2. OMffl，其末端產(chǎn)生瓶形小梗，8-16 X 1. 5-2Mfli ；從瓶梗的末端以向基式連續(xù)形成串鏈的分生孢子，分生孢子單細胞，長橢圓形，大小4. 8-7 X 2-3 Mm。本發(fā)明綠僵菌菌株CQMa421具體如下的有益效果
本發(fā)明從自然感染的稻縱卷葉螟僵蟲直接分離篩選的綠僵菌菌株CQMa421，產(chǎn)孢能力強、產(chǎn)孢率可達6. 8%、其生產(chǎn)性狀好、生長迅速，同時殺蟲活性強、殺蟲效果好。利用該菌株
3生產(chǎn)的殺蟲真菌制劑，有效地控制了稻縱卷葉螟種群數(shù)量。


圖1 CQMa421菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與孢子形態(tài)大??；
圖2 綠僵菌屬OfeiarAiziws)的ITSl — 5. 8S — ITS2 rDNA區(qū)域分支系統(tǒng)樹； 圖3 CQMa421對稻縱卷葉螟殺蟲活性測定結(jié)果； 圖4 CQMa421對稻縱卷葉螟室外防治生測結(jié)果。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1 菌株的分離
將采集到的自然感染的稻縱卷葉螟僵蟲用70%酒精表面消毒，放入培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)3-5天，使其昆蟲表面生長出新鮮孢子；在無菌條件下，用接種環(huán)挑取微量新鮮孢子在含有100微克/毫升氨芐青霉素的1/4SDA培養(yǎng)基平板上劃線；將劃線好的培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于恒溫箱中培養(yǎng)；3—4日后挑選長出的典型而無雜菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中央，28°C恒溫培養(yǎng)10-15天。實施例2菌株的鑒定 (1)、形態(tài)鑒定
將分離到的CQMa421菌株接種在1/4SDA平板上，28°C培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)特征，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形狀與大小。結(jié)果顯示在1/4SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)初期菌落呈白色棉絮狀，產(chǎn)孢時橄欖綠色。菌絲具分隔和分支，透明，直徑為1.5-2. OMffl。分生孢子孢子梗單生或聚集或緊密排列，呈帚狀分支，直徑約為2. OMffl，其末端產(chǎn)生瓶形小梗，8-16 X1.5-2Mffl。從瓶梗的末端以向基式連續(xù)形成串鏈的分生孢子(參見圖1中的左圖)。分生孢子單細胞，長橢圓形，大小 4.8-7 X2-3 Mm (參見圖1中的右圖)。從以上特征看，菌株CQMa421應(yīng)該為金龜子綠僵菌 ^""ife^ft Metarhizium anisopliae var. anisopliaeο(2)、CQMa421菌株的ITS序列擴增、序列測定及分子分類
將CQMa421在1/4SDAY液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)3天(180rpmJ8°C)，離心(10000 g， 20min)收集菌絲，液氮研磨破碎后采用DNA提取試劑盒提取菌株CQMa421的總DNA。以總的DNA為模板，參照Curran擴增綠僵菌ITS1-5. 8S-ITS2 rDNA區(qū)域。所用引物為TW81 5‘ -gtttccgtaggtgaacctgc _3，和 AB28 5‘ -atatgcttaagttcagcgggt _3，，產(chǎn)生 547bp 擴增條帶。PCR反應(yīng)在PCR儀上的反應(yīng)程序95°C 4min, 1個循環(huán)；94°C 0. 5min, 53°C 0. 5min， 72°C 0.5min，30循環(huán)；最后72°C IOmin0將擴增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收純化，由上海生工進行雙向脫氧法測序。CQMa421 ITS1-5. 8S-ITS2測序結(jié)果見SEQ ID No. 1。該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已之序列比對，符合預(yù)期長度，無與其序列相同的菌株。該序列5，端包含18S rDNA部分基因序列(1-34)，3，端包含部分^S rDNA基因序列 (504-549)，其余的分別為ITSl區(qū)域(35-167)，5. 8S rDNA基因全序列(168-3 )以及ITS2
4區(qū)域(327-519)。利用 MEGA v4. 1 (www.megasoftware.net)軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹(1000 次重復(fù))證實CQMa421 W^kMetarhizium anisopliae·. anisopliae 金龜子綠僵菌小孢變種(圖2所示)。
實施例3 CQMa421對稻縱卷葉螟室內(nèi)殺蟲活性的測定
收集在1/4SDA平板上培養(yǎng)的CQMa421成熟孢子，用0. 05% (W/V)吐溫-80分散，配置成終濃度為IX IO8個孢子/ml的懸浮液。采用點滴法稻縱卷葉螟幼蟲，每頭試蟲用微量點樣器點滴藥劑2 μ 1，接種30頭，接種后在室溫^°C，濕度50-70%的條件下飼養(yǎng)，設(shè)5個重復(fù)，以清水為空白對照。記錄死蟲數(shù)，計算存活率，經(jīng)DPS2000軟件統(tǒng)計分析得到真菌LT5tl (致死中時)和LT9tl (致死終時)。從圖3可以看出，綠僵菌CQMa421菌株對稻縱卷葉螟有明顯的殺蟲活性。接種后 5-7天死亡高峰期，稻縱卷葉螟幼蟲感病死亡后蟲體僵硬，保濕培養(yǎng)3天后長出白色菌絲， 5-7天蟲體長滿綠色孢子。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，其CQMa421菌株對稻縱卷葉螟幼蟲的LT5tl (致死中時)和LT9tl (致死終時)分別為5. 3天和9. 1天。實施例4 CQMa421菌株產(chǎn)孢特性
將濃度為IX IO8個孢子/ml的CQMa421孢子懸浮液接種在1/4SDA平板上(100 μ 1/ 皿)，在不同溫度(15°C，200C，240C ,26°C, 28°C，30°C，37°C )的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15天后測定單位面積上的產(chǎn)孢量，確定CQMa421菌株在條件下產(chǎn)孢最佳。分別配制pH為4. 5,5.0, 5. 5，6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，8. 0，8. 5的1/4SDA平板，按上述方法測定產(chǎn)孢量，確定CQMa421菌株在pH為6. 5條件下產(chǎn)孢最佳。實施例5 CQMa421菌株固體發(fā)酵物料的優(yōu)化
液體培養(yǎng)CQMa421菌絲作為發(fā)酵種子。固體發(fā)酵物料配置在培養(yǎng)固體物料大米或碎玉米或小麥中分別加入15%或20%或25%或30% (V/W)的營養(yǎng)液(pH 6.5)或水；營養(yǎng)液為1/4SDAY或1/8SDA或1/6SDA或1/32SDAY。拌勻后裝入兩端透氣的聚丙烯袋袋中，121°C高壓濕熱滅菌30 min ；自然冷卻后加入按培養(yǎng)物料與菌液=10 1的比例(W/V) 接種綠僵菌CQMa421菌液并拌勻均勻，置于^TC的發(fā)酵室中靜止發(fā)酵15天后升溫干燥 (30°C _34°C)，至物料含水量低于5%。隨機抽取物料發(fā)酵樣品，混勻后取5g左右的樣品，放入裝有20mL 0. 05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混勻后用血球計數(shù)板測定產(chǎn)品的含孢量，按200 X IO8個/g換算出固體發(fā)酵的產(chǎn)孢率。以產(chǎn)孢率為優(yōu)化指標(biāo)，最后確定CQMa421 的固體發(fā)酵物料配方為大米加入25% (V/W)的1/16SDA營養(yǎng)液(pH 6. 5)。實施例6 CQMa421菌株的室外防治效果
CQMa421接種在1/4SDAY平板上液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)3天(180rpm，28 V )；將菌液接種在滅菌的大米上，拌勻后^TC下培養(yǎng)15天；收集孢子后用色拉油配制成終濃度為2 X 101° 個孢子/ml油懸浮劑。選擇稻縱卷葉螟幼蟲發(fā)生較重的稻田，隨機選擇4個IOmX IOm小區(qū)，間隔5米。 每個小區(qū)放置1個觀測網(wǎng)罩(lmXaii，間距1米以上)，采集幼蟲接種于網(wǎng)罩內(nèi)(50-100頭 /網(wǎng)罩)，24小時后采用泰山-18型機動噴霧器進行超低容量噴施CQMa421孢子油懸浮劑 QX IO13個孢子/公頃)。以噴施清水為空白對照。施藥后每天調(diào)查網(wǎng)罩內(nèi)蟲情。根據(jù)室外生測結(jié)果表明施藥后12天，綠僵菌CQMa421菌株對稻縱卷葉螟的防治效果達到90%以上(圖4)。綠僵菌CQMa421菌株處理組的成蟲數(shù)(/百叢)約為1. 5只，而對照組的成蟲數(shù)(/百叢)達到13. 6只。實施例7 CQMa421菌株固體發(fā)酵產(chǎn)孢率
配制PH初始值為6.5的1/16SDA營養(yǎng)液，按25% (V/W)的比例加入大米中，拌勻后裝入兩端透氣的聚丙烯袋中，121°C高壓濕熱滅菌30 min;自然冷卻后按1:10 (菌液大米， V /W)比例接種綠僵菌CQMa421菌液并拌勻均勻，置于^TC的發(fā)酵室中靜止發(fā)酵15天后升溫干燥(30°C _34°C)，至物料含水量低于5%。隨機抽取10袋發(fā)酵料，混勻后每袋混勻后各取5g左右的樣品，放入裝有20mL 0. 05%Tween-80的50ml三角瓶中，充分混勻后用血球計數(shù)板測定產(chǎn)品的含孢量，按200 X IO8個/g換算出固體發(fā)酵的產(chǎn)孢率。以清水代替1/16SDA 營養(yǎng)液設(shè)為對照。表1 CQMa421菌株固體發(fā)酵產(chǎn)孢率
固體培養(yǎng)物料_產(chǎn)孢率(％)顯荖性檢驗(P=OiOl)
權(quán)利要求
1.一ft^iBliiliitt {Metarhizium anisopIiae var. anisopIiae) CQMa421, 1 ! j^f 為 CGMCC NO. 4609。
2.如權(quán)利要求1所述的綠僵菌菌株，其特征在于該菌株的適宜產(chǎn)孢溫度為^TC,適宜產(chǎn)孢PH為6. 5。
3.如權(quán)利要求1所述菌株在對稻縱卷葉螟防治中的應(yīng)用。
全文摘要
一種綠僵菌菌株(Metarhiziumanisopliaevar.anisopliae)CQMa421，保藏編號為CGMCCNO.4609，其在對稻縱卷葉螟防治中的應(yīng)用。本發(fā)明菌株生產(chǎn)性狀好、生長迅速，產(chǎn)孢能力強、產(chǎn)孢率可達6.8%，具有高毒力；從而利用該菌株生產(chǎn)的殺蟲真菌制劑，有效地控制了稻縱卷葉螟種群數(shù)量。
文檔編號C12N1/14GK102212483SQ20111010546
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者夏玉先, 彭國雄 申請人:重慶大學(xué)