專利名稱：一種藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有生長激素的穩(wěn)定的藥物制劑、制備該制劑的方法，含有組氨酸或其一種衍生物的生長激素晶體、制備該晶體的方法和組氨酸或其衍生物穩(wěn)定生長激素制劑的用途。
源于人和普通家養(yǎng)動(dòng)物的生長激素(GH)是約191個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，合成并分泌于垂體的前葉。人生長激素由191個(gè)氨基酸組成。
生長激素是一種不僅涉及軀體生長的調(diào)節(jié)而且涉及蛋白質(zhì)、糖類和脂類代謝調(diào)節(jié)的重要激素。生長激素的主要作用是促進(jìn)生長。
受生長激素影響的機(jī)體系統(tǒng)包括骨胳、結(jié)締組織、肌肉和內(nèi)臟如肝，腸和腎。
在現(xiàn)在重組技術(shù)和生長激素基因克隆的發(fā)展而導(dǎo)致了如人生長激素(hGH)和Met-hGH的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)之前，人生長激素只能由人尸體垂體中提取得到。生長激素的這種非常有限的供應(yīng)限制了在幼童期和青春期用它來促進(jìn)縱向生長而治療侏儒癥，甚至盡管已特別建議將它用于治療矮小身材(由于生長激素缺乏、正常的矮小身材和特納氏綜合癥)、成人生長激素缺乏、不育癥、燒傷的治療、傷口愈合、營養(yǎng)不良、骨愈合、骨質(zhì)疏松、彌散性胃出血和假關(guān)節(jié)。
而且，生長激素已被推薦用于增加家養(yǎng)動(dòng)物的生長速度或降低屠宰供人類消費(fèi)的動(dòng)物體內(nèi)脂肪的比例。
生長激素的藥物制劑往往是不穩(wěn)定的。特別是在生長激素溶液中會(huì)產(chǎn)生降解產(chǎn)物如脫酰胺或次硫酸化產(chǎn)物和二聚物或多聚物的形式。
hGH的主要降解反應(yīng)是1)直接水解或經(jīng)環(huán)狀琥珀酰胺中間體脫去酰氨基而形成不同量的L-asp-hGH，L-iso-asp-hGH，D-asp-hGH和D-iso-asp-hGH，(參考文獻(xiàn)1-3)，2)氧化14和125位上的蛋氨酸殘基(參考文獻(xiàn)4-9)，以及3)裂解肽鍵。
脫酰胺特別易于發(fā)生在149位的Asn上。
hGH在14和125位上相當(dāng)容易被氧化，特別是在溶液中(4-8)。
hGH在溶液中氧化成亞砜一般是由于該制劑中溶有氧。蒸餾水中氧的溶解度約為200μM(9)。因?yàn)樵诤?IU/ml制劑中hGH的濃度為1.3mg/ml相當(dāng)于60nmhGH，在一般貯藏條件下，氧將以超過氧化hGH化學(xué)用量約3000倍的量存在。用在壓蓋和包裝該制劑前給溶液除氣的方法來試圖解決這個(gè)問題是不容易的。
目前，未以為這些降解產(chǎn)物具有毒性或改變了生理活性或具有結(jié)合受體的特性。但有跡象表明與原始hGH相比有降低亞砜構(gòu)象穩(wěn)定性的作用。
為了研制一種穩(wěn)定的溶解的hGH的制劑，了解亞砜形成速度以及控制氧化的方法是很重要的。
在hGH制劑中降解動(dòng)力學(xué)取決于溫度、PH和各種附加劑或賦形劑。
由于生長激素的不穩(wěn)定性，目前把它凍干并在4℃溫度下以凍干形式貯存直到使用時(shí)重新再配制以便使降解減到最小。
目前由患者重新配制凍干的hGH藥物制劑，然后在多達(dá)14天的使用期內(nèi)以溶液在低溫下貯存，通常在約4℃的冰箱中，在此期間將會(huì)發(fā)生某些降解。
而且，對患者來說凍干生長激素的重新配制過程往往是困難的。
因此，目前最好是在使用前盡可能晚地重新配制生長激素并最好以凍干狀態(tài)貯存和運(yùn)送該制劑，從生產(chǎn)廠家到藥房易于在可控制的低溫如4℃操作管理該制劑，使其具有長達(dá)兩年的有效期限。
然而，筆筒體系(pensystem)自身治療的推廣使用和該制劑應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)大要求在那些并不能總得到“足夠”冷凍條件下對最終使用者來說具有在足夠長的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定的制劑。
優(yōu)選地在藥筒使用的有效期內(nèi)，以凍干狀態(tài)放置約一個(gè)月又在筆筒裝置中以重新配制的形式放置一個(gè)月，對最終使用者來說該制劑應(yīng)當(dāng)仍是穩(wěn)定的。
因而，需要一種更加穩(wěn)定的生長激素制劑，它能以凍干狀態(tài)在較高溫度下穩(wěn)定一段時(shí)間并以溶液形式在較高溫度下穩(wěn)定另一段使用時(shí)間。當(dāng)把生長激素的使用從診所移到得不到如上所述的適宜存放的被治療的個(gè)人家庭中時(shí)，這種穩(wěn)定性是非常重要的。
而且，使用筆筒裝置服用生長激素的方式的改變要求一種穩(wěn)定溶解的生長激素制劑以便患者易于進(jìn)行操作。可以生產(chǎn)一種穩(wěn)定溶解的生長激素制劑而便于以安裝在病人使用的筆筒裝置中的藥筒方式來使用，患者可避免重新配制該制劑并且因而不需要凍干制劑、重新配制用的適宜的載體以及滅菌重新配制制劑所必需的技術(shù)和滅菌設(shè)備。
出于安全的原因，也需要避免在使用該制劑之前重新配制該凍干制劑。
而且，在生長激素制劑的生產(chǎn)中避免凍干步驟也是有益的。凍干是一個(gè)耗時(shí)并耗錢的步驟并因冷凍干燥機(jī)有限的容量而在生產(chǎn)中也經(jīng)常是一個(gè)影響生產(chǎn)流程的環(huán)節(jié)。
所以，為了使溶解的hGH制劑在貯存期和長達(dá)一個(gè)月的使用期內(nèi)穩(wěn)定，就需要降低降解過程的速度。
以前穩(wěn)定hGH的濃度在防止二聚體的形成方面沒有完全成功，與二聚體形成的有關(guān)問題如在Becker，G.W.(BiotechnologyandAppliedBiochemistry9，478(1987))中有所記錄。
國際專利公開WO89/09614和奧大利亞專利申請30771/89中公開了一種含有人生長激素、甘氨酸和甘露醇的穩(wěn)定藥物制劑。此制劑在常規(guī)制備過程中和以凍干態(tài)貯存期間以及重新配制后的使用期內(nèi)表現(xiàn)良好的穩(wěn)定性。
已公開的歐洲專利申請303746公開了用各種穩(wěn)定劑穩(wěn)定動(dòng)物生長激素以減少不溶物的形成并保持在水溶液環(huán)境中的溶解性，這類穩(wěn)定劑包括特定的多元醇、氨基酸、在生理PH值時(shí)具有帶電側(cè)基的氨基酸多聚物和膽鹼鹽。多元醇選自非還原性糖類、糖醇類、糖酸類、季戊四醇、乳糖、水溶性右旋糖酐類和Ficoll;氨基酸選自甘氨酸、肌氨酸、賴氨酸或其鹽、絲氨酸、精氨酸或其鹽、甜菜堿、N，N-二甲基-甘氨酸、天冬氨的或其鹽、谷氨酸或其鹽;在生理PH值具有帶電側(cè)基的氨基酸多聚物選自聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸及其鹽;以及膽鹼衍生物選自氯化膽鹼、檸檬酸二氫膽鹼、酒石酸氫膽鹼、碳酸氫膽鹼、檸檬酸三膽鹼、抗壞血酸膽鹼、硼酸膽鹼、葡萄糖酸膽鹼、磷酸膽鹼、硫酸二膽鹼和粘酸二膽鹼(dicholinemucate)。
EP374120公開了一種含有緩沖性多元醇賦形劑的穩(wěn)定的生長激素制劑，該賦型劑含有具有三個(gè)羥基的多元醇和可使PH達(dá)到在足夠長時(shí)期內(nèi)保持生長激素生物活性的范圍的緩沖劑。提及組氨酸作為具有三個(gè)羥基的多元醇緩沖劑。
現(xiàn)在已驚奇地發(fā)現(xiàn)以每mg生長激素加0.1到12mg組氨酸或其衍生物的只含有組氨酸或其衍生物作為附加劑或緩沖物的人生長激素的制劑具有高度抗脫酰胺，氧化和肽鍵裂解的穩(wěn)定性。該產(chǎn)品的穩(wěn)定性允許以凍干狀態(tài)或已溶解或再溶解制劑形式貯藏和運(yùn)送。
EP303746提到了聚組氨酸作為動(dòng)物生長激素潛在的穩(wěn)定劑，但沒有指明是能穩(wěn)定動(dòng)物生長激素還是人生長激素。
EP374120教導(dǎo)了鹽酸組氨酸可用作緩沖劑緩沖有三個(gè)羥基的多種元醇來提高濃度的生長激素和一種多元醇作為穩(wěn)定劑的溶液形式的生長激素制劑的穩(wěn)定性。必須以約3%(溶液重量)(相當(dāng)于～0.15M鹽酸組氨酸濃度的溶液)用量加入鹽酸組氨酸。EP374120也指出了單獨(dú)組氨酸不會(huì)帶給生長激素制劑化學(xué)和物理穩(wěn)定性。
本發(fā)明制劑可以是凍干粉末的形式，然后用常規(guī)載體如蒸餾水或注射用水重新配制，或者可以是含有生長激素晶體的溶液或懸浮液形式。這類載體，可以包括常規(guī)的防腐劑如間甲酚和苯甲醇。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是以組氨酸緩沖劑緩沖的緩沖性生長激素水溶液形式的含有組氨酸或其衍生物的人生長激素藥物制劑的形式。這種制劑是一種備用形式并可以水溶液的形式貯存和運(yùn)送而沒有任何顯著的降解。L-組氨酸pKA為6.0因而在PH6.5作為緩沖劑是適宜的。
認(rèn)為PH6.5的組氨酸制劑在25℃溫度下大約穩(wěn)定50天。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是以組氨酸緩沖劑緩沖的緩沖性生長激素晶體的水懸浮液形式的含有組氨酸或其衍生物的人生長激素藥物制劑形式。該制劑是非常穩(wěn)定的并且在以備用形式貯存和運(yùn)送期間能將生長激素保持在晶體相中而產(chǎn)生一個(gè)更低的降解趨向。該制劑在注射時(shí)類似一種溶解制劑，即，人生長激素不是持續(xù)釋放的。
為了穩(wěn)定，溶液或懸浮液制劑的PH值優(yōu)選調(diào)到2-9之間。PH5到8特別是PH6到7的制劑為更優(yōu)選。
為達(dá)到穩(wěn)定的效果，組氨酸的濃度優(yōu)選從1mM到100mM。更優(yōu)選的是，所加的組氨酸濃度為2到20mM，最好為5到15mM。
加入10%乙醇或5%甲醇能使脫酰胺降低20%以上。
本發(fā)明制劑也可以是凍干的粉狀或餅狀形式，它含有生長激素或生長激素衍生物和每mg生長激素或生長激素衍生物為0.1到12mg組氨酸或其衍生物用量的組氨酸或其衍生物以及凍干用的膨脹劑，該膨脹劑選自糖醇類和二糖及其混合物。糖醇優(yōu)選甘露醇。
含有蔗糖的本發(fā)明凍干制劑是優(yōu)選的，這是因?yàn)樗幸粋€(gè)非常高的穩(wěn)定性，而且含有蔗糖和甘露醇的制劑是特別優(yōu)選的，它把非常高的穩(wěn)定性和非常好的加工性能結(jié)合在一起而得到易溶并溶解后在溶液中長時(shí)期內(nèi)非常穩(wěn)定的堅(jiān)固的凍干產(chǎn)品。更進(jìn)一步本發(fā)明優(yōu)選的制劑是含有甘露醇和海藻糖作為冷凍膨脹劑的制劑。含有甘露醇和二糖的本發(fā)明制劑含有大約等量的兩種組份(以重量計(jì))。
本發(fā)明制劑中蔗糖含量可以在很大的范圍內(nèi)變化。生長激素與蔗糖之比可以在0.005到1.5之間變化(按重量計(jì))。因此，蔗糖用量可以是每mg生長激素0.67到200mg，優(yōu)選每mg生長激素在1.1到50mg之間。
在組氨酸緩沖劑中凍干的hGH不會(huì)產(chǎn)生任何問題。再溶解后與磷酸緩沖劑相比，脫酰胺速度仍然降低20%。
本發(fā)明藥物制劑可進(jìn)一步含有常用的鹽以便易于其制備(如凍干或重新配制)。
按照本發(fā)明，穩(wěn)定生長激素的另一個(gè)方法是形成生長激素的晶體來抗降解得到更好的保護(hù)作用。已意外地發(fā)現(xiàn)含有組氨酸的晶體形式的生長激素制劑可滿足以上所提到的要求。干燥形式的晶體可直接用來作為使用前以常規(guī)方法重新配制的GH制劑。
所以，本發(fā)明也涉及含有組氨酸或其衍生物和一種有機(jī)或無機(jī)陽離子的生長激素或生長激素衍生物的晶體。已經(jīng)表明這種結(jié)晶的性能優(yōu)于用上述制劑所達(dá)到的性能。
盡管可以容易地得到足量的結(jié)晶，但至今為止沒有報(bào)道成功的GH結(jié)晶。已在各種出處報(bào)道了微晶，或非晶形物質(zhì)Jones等，Biotechnology(1987)5，499-500;Wilhelmi等，J.Biol..Chem.(1984)176，735-745;Clarkson等，J.Mol.Biol.(1989)208，719，721;和Bell等，J.Biol.Chem.(1985)260;8520-8525。
懸垂滴落法是試圖結(jié)晶GH所用的最普通的方法。顯然由于生長激素制劑的不均勻性，所報(bào)道的該晶體的大小和形狀也變化顯著。由Jones等(1987)報(bào)道了最大的晶體。在他們成功的試驗(yàn)中他們使用了中性PH值的聚乙二醇3500和β-辛基葡萄糖甙混合物。
Clarkson等(1989)報(bào)道了使用低級醇和丙酮可產(chǎn)生0.001到0.005mm3不同形狀的晶體。然而沒有一種已知方法適于商業(yè)化生產(chǎn)GH結(jié)晶，這是因?yàn)樾枰獛字艿揭荒甑纳a(chǎn)周期。
在二價(jià)離子和一種油的混合物中已配制了為獸醫(yī)使用的牛生長激素(EP343696)。在類脂存在下將ZnCL2加到?；蛘哓i的生長激素中制備成不確定的顆粒來形成一種長效釋放制劑。用這一方法把該生長激素分散在載體中使每個(gè)生長激素分子包圍1到4個(gè)Zn分子。該溶液是在不同濃度的變性溶質(zhì)(1到4M的尿素)及高PH值(9.5)條件下配制的。用hGH重復(fù)這一過程已表明該方法不可能產(chǎn)生晶體。
從文獻(xiàn)中已熟知在胰島素的結(jié)晶過程中存在二價(jià)陽離子不僅可以在分析中有極好的定向作用，而且能改善結(jié)晶的物理?xiàng)l件(如參見美國專利2174862)。但是，生長激素比胰島素大三倍多并且有完全不同的構(gòu)象?，F(xiàn)在已意外地發(fā)現(xiàn)在含有hGH和組氨酸或其衍生物的溶液中加入陽離子來高產(chǎn)率地生產(chǎn)穩(wěn)定的均勻的生長激素結(jié)晶成為可能。而且，生成高質(zhì)量hGH晶體所需時(shí)間周期相對縮短。
本發(fā)明的另一方面是制備生長激素和組氨酸或組氨酸衍生物晶體的方法，它包括的步驟有a)在一種溶劑中配成生長激素或生長激素衍生物的溶液并加入組氨酸或其衍生物，再用鹽酸適當(dāng)調(diào)節(jié)PH值為5到8。
b)加入有機(jī)或無機(jī)陽離子。
c)在約0℃到約30℃溫度下使溶液結(jié)晶，和d)用已知的方法分離所形成的晶體。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在組氨酸或其一種衍生物存在時(shí)結(jié)晶hGH獲得比在制備hGH制劑常用的磷酸緩沖液存在時(shí)結(jié)晶更大更純更均勻晶體形式的較高產(chǎn)量的晶體。因此，該晶體的分離和純化變得更為方便。
當(dāng)在組氨酸存在下進(jìn)行結(jié)晶時(shí)晶體產(chǎn)率比以前制劑結(jié)晶產(chǎn)率增加約20%。
原料(生長激素)可以是直接從發(fā)酵液中直接得到的濃縮物或者是溶于溶劑中并調(diào)節(jié)到一定濃度的常用凍干制劑，該濃度優(yōu)選大于0.1mg/ml，優(yōu)選濃度為4到7mg/ml，最佳濃度為6mg/ml。步驟a)中所適用的溶劑是一種含水緩沖液如磷酸緩沖液或組氨酸緩沖液。
在某一溫度下允許結(jié)晶進(jìn)行1到120小時(shí)，優(yōu)選為5到72小時(shí)，最佳為20到48小時(shí)。該溫度優(yōu)選4到25℃。
步驟a)中組PH值一般為5.0到7.5，優(yōu)選5.0到6.8，更好為5.8到6.5，最好為6.0到6.3。
步驟a)中組氨酸或組氨酸衍生物的濃度可在5-25mM之間變化，優(yōu)選5-15mM，以便形成具有如上所述的適當(dāng)大小和性能的晶體。
二價(jià)陽離子是優(yōu)選的并已發(fā)現(xiàn)無機(jī)陽離子如Zn++特別適于快速形成穩(wěn)定的GH晶體。也可以使用陽離子的混合物。
應(yīng)以提供快速有效地形成好的所定義的晶體的量來加入該陽離子。所加陽離子量的上限是能引起大量非結(jié)晶物非特異性沉淀的量。
使用Zn++時(shí)，合適的濃度一般約為0.2到10mol Zn++/mol GH。然而，如果該結(jié)晶反應(yīng)混合物含有能夠與該陽離子結(jié)合(如以絡(luò)合形式)的緩沖劑或其它化合物，為補(bǔ)償這種結(jié)合在結(jié)晶過程中需加入較高濃度的陽離子。
優(yōu)選以能引起GH晶體形成的用量來使用Zn++，該晶體的Zn++和GH摩爾比約為0.2到10，較優(yōu)選約為0.5到5，最佳為約0.5到約2。
當(dāng)使用其他無機(jī)陽離子時(shí)，濃度可在0.5和10mol陽離子/molGH之間變化。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是在步驟a)中加入一種有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物。
為結(jié)晶而加的合適有機(jī)溶劑可以從短鏈的脂族、脂環(huán)或芳香醇類和酮類如甲醇、乙醇、1-和2-丙醇、環(huán)己醇、丙酮和苯酚或間甲酚中選擇。優(yōu)選的有機(jī)溶劑為乙醇和丙酮，最佳為乙醇。
該溶液可以通過加入少量好的所定義的六角或針狀hGH晶體來放入晶種，但最好不要加入晶種。
該有機(jī)溶劑的濃度可以從0.1到50%V/V，優(yōu)選從0.1到30%，較好為0.1到20%，更好為5到15%，最佳為6到12%V/V。
由于在較大體積的溶液中形成結(jié)晶，本方法可以用作所述生長激素快速有效的器流工藝。
當(dāng)使用乙醇作為有機(jī)溶劑時(shí)，它的合適濃度為0.1到20%，優(yōu)選5到15%，最佳為6到12%(V/V)。
所形成的結(jié)晶可以用常規(guī)方法分離，如離心或過濾、洗滌并任意凍干除去微量的有機(jī)溶劑。
晶體的大小將取決于該過程中所用的Zn++與GH之比和所使用溶劑的選擇和用量。
本發(fā)明的hGH晶體在體外試驗(yàn)中顯示具有類似于經(jīng)典的溶解性hGH的生物功效。所以新的GH晶體能夠適用于與商業(yè)上購得的hGH制劑相同的癥狀。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面涉及組氨酸或其衍生物在制備穩(wěn)定生長激素制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的藥物制劑優(yōu)選為單位劑量的形式，每個(gè)單位劑量含有4IU到100IU生長激素。
在本文中“生長激素”可以是來源于如鳥、牛、馬、人、羊、豬、鮭、真鱒或金槍魚的任何生物的生長激素，優(yōu)選牛、人或豬的生長激素，人生長激素為最好。按照本發(fā)明所用的生長激素可以是從自然資源中分離的天然生長激素，如，用常規(guī)方法提取垂體獲得的，或者是用重組技術(shù)生產(chǎn)的生長激素，如E.B.Jensen和S.Carlsen在BiotechandBioeng.36，1-11(1990)所述的?！吧L激素衍生物”可以是一種截?cái)嘈问降纳L激素，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被刪除;一種生長激素的類似物，其中天然分子中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被另一個(gè)氨基酸殘基(優(yōu)選天然產(chǎn)生的氨基酸殘基)取代，只要這種取代沒有任何付作用如抗原性或降低作用;或者是一種生長激素的衍生物，如該生長激素的脫酰胺或亞砜化形式或具有N或C-末端延長如Met-hGH，Met-Glu-Ala-Glu-hGH或Ala-Glu-hGH的形式。優(yōu)選的生長激素是hGH。
為本發(fā)明目的，術(shù)語“組氨酸衍生物”是指組氨酸的酰胺類和酯類如甲基或乙基酯，二肽如His-Gly、His-Ala、His-Leu、His-Lys、His-Ser和His-Phe，以及組氨酸的類似物或衍生物如咪唑，脫氨基-組氨酸或聚組氨酸。為了方便的緣故，本發(fā)明制劑中組氨酸或其衍生物的含量被計(jì)算出來并使用組氨酸本身的摩爾重量。
使用術(shù)語“鹽類”來表示為方便藥物制劑的加工或重新配制所加的附加劑，它包括常規(guī)附加劑如有機(jī)酸如檸檬酸、酒石酸或醋酸的堿金屬、堿土金屬或銨鹽、如檸檬酸鈉、酒石酸鈉或醋酸鈉、或無機(jī)酸如鹽酸的堿金屬、堿土金屬或銨鹽，如氯化鈉。
該本文中的“高穩(wěn)定性”是當(dāng)制劑比含有磷酸緩沖液的常規(guī)制劑穩(wěn)定時(shí)認(rèn)可的。
“糖醇”可以是甘露醇、木糖醇、赤鮮醇、蘇糖醇、山梨醇或丙三醇。
本文中的“二糖”是指天然產(chǎn)生的二糖，如，蔗糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、瓊脂糖、松二糖、昆布雙糖、異麥芽糖、龍膽二糖或密二糖。
本發(fā)明制劑中所用的溶劑可以是水、醇類如乙醇、正丙醇或異丙醇、丁醇或其混合物。該溶劑可含有防腐劑如間甲酚或苯甲醇。
參考附圖可以更詳細(xì)地描述本發(fā)明

圖1.顯示了未加組氨酸所制備晶體的照片。
圖2.顯示了本發(fā)明hGH晶體的照片。
在下列說明本發(fā)明的實(shí)施例中更詳細(xì)地解釋了本發(fā)明。它們并不被認(rèn)為是限制由所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1脫酰胺的降低作用在37℃溫度下對在PH6.5的組氨酸緩沖液中含有4IU和12IU的hGH制劑與在相同PH值的磷酸緩沖液中的相同hGH制劑進(jìn)行比較來檢測脫酰胺速度。
把15.5mg組氨酸溶于10ml的含有0.9%苯甲醇的去離子水中并加0.1N鹽酸到PH為6.5來制得10mM組氨酸緩沖液，再把13.3mghGH溶于10ml的10mM組氨酸緩沖液中來制備組合物A的含有4IU的hGH制劑。把40mghGH溶于如上所述的相同緩沖液中制得含12IU制劑。
把17.8mg磷酸氫二鈉溶于10ml含有0.9%(V/V)苯甲醇的去離子水中并加0.1N的磷酸到PH值為6.5制得10mM的磷酸氫二鈉緩沖液，在10ml該緩沖液中溶解13.3mghGH制得組合物B的含4IU的hGH制劑。把40mghGH溶于如上所述的相同緩沖液中制得含12IU的制劑。
組合物A10mM組氨酸(His)0.9%苯甲醇HCl加至PH為6.5組合物B10mM磷酸氫二鈉0.9%苯甲醇磷酸加至PH為6.5在重新配制后馬上和在37℃放置7天后用IE-HPLG檢測該制劑中脫酰胺-hGH的含量。結(jié)果顯示于下表1中。
表1.脫酰胺制劑脫酰胺%緩沖液A4IU/ml1.7開始12IU/ml2.1緩沖液A4IU/ml10.17天后(37℃)12IU/ml10.4緩沖液B4IU/ml1.8開始12IU/ml2.3緩沖液B4IU/ml16.97天后(37℃)12IU/ml14.9
上表表明在37℃與磷酸緩沖液相比，組氨酸緩沖液中hGH的脫酰胺作用顯著降低。
實(shí)施例2在組氨酸或其衍生物存在下脫酰胺的降低作用在25℃下檢測5mM、10mM和100mM組氨酸緩沖液PH7.3和PH6.5時(shí)含有6IUhGH的hGH制劑脫酰胺速度，并與相同PH8mM磷酸緩沖液進(jìn)行比較。而且，測試了組氨酸衍生物His-Gly、His-Ala、His-Leu、His-Lys、His-Phe、His-Ser、組氨酸甲基酯、組氨醇、咪唑、咪唑-4-乙酸和組胺。
分別把7.8mg、15.5mg和155.2mg的組氨酸溶于10ml含0.9%(V/V)的苯甲醇的去離子水中并加0.1N的鹽酸至所述的PH值制得所需濃度的組氨酸緩沖液。再把20mghGH溶于10ml的該組氨酸緩沖液中制得hGH制劑。
在25℃下存放下表2所述的hGH制劑并在14和30天后用IE-HPLC分析該制劑中脫酰胺的含量。結(jié)果顯示于下表2中。
表2.
按制劑的性能和在25℃下溶液放置的時(shí)間來用IE-HPLC測定脫酰胺hGH的含量制劑(*) 25℃形成的脫酰胺化合物14天30天5mMHisPH6.56.59.15mMHisPH7.311.017.4
10mMHisPH6.56.89.710mMHisPH7.311.316.6100mMHisPH6.59.815.2100mMHisPH7.319.328.88mM磷酸氫二鈉PH6.57.810.88mM磷酸氫二鈉PH7.315.220.38mM磷酸氫二鈉PH6.59.413.20.3%間甲酚10mMAsp,PH6.521.7nd10mMGlu,PH6.514.8nd10mMHis-Gly,PH6.25.68.110mMHis-AlaPH6.56.28.510mMHis-LeuPH6.58.812.310mMHis-LysPH6.58.612.010mMHis-PhePH6.57.511.310mMHis-SerPH6.322.0nd10mM組氨酸甲基酯PH6.54.65.210mM組氨醇PH6.527.4nd10mM咪唑PH6.59.212.210mM咪唑-4-乙酸PH6.510.314.210mM組胺PH6.59.812.2＊除配方9外均含有0.9%苯甲醇起始物中脫酰胺-hGH的含量為2.1%
上表2表明PH值6.5和7.3下與加入磷酸緩沖液相比，加入組氨酸時(shí)hGH的脫酰胺作用下降了大約20%。而且，PH值從商業(yè)hGH制劑的常規(guī)PH值7.3降低到PH值6.5本身會(huì)使脫酰胺速度下降50%。
在實(shí)驗(yàn)條件下，組氨醇似乎沒有使制劑穩(wěn)定，并且加入較大用量的組氨酸不但沒有增加反而降低了所需的作用。
使用組氨酸類似物如咪唑、組胺和咪唑-4-乙酸以及組氨酸甲酯可獲得類似的結(jié)果，即在25℃下放置30天后僅有3.1%脫酰胺-hGH形成，使該制劑的有效期可達(dá)3-4個(gè)月。
在PH6.5時(shí)與磷酸相比，加入Asp或Glu增加了脫酰胺速度。
加入His-X類型的二肽顯示出對His-Gly和His-Ala起極積作用，而His-Ser卻降低穩(wěn)定脫酰胺的作用。
以上結(jié)果表明降低PH值和以較低濃度(優(yōu)選約5mM-10mM)加入組氨酸能降低脫酰胺的速率。降低PH值并用組氨酸替代磷酸緩沖液可使脫酰胺速率降低50%以上。
使用間甲酚或苯甲醇作為防腐劑似乎對脫酰胺速率沒有影響。
與磷酸比較，在PH6.5時(shí)組氨酸可降低裂解的產(chǎn)生(肽鍵的水解)。
實(shí)施例3降低亞砜形成的作用檢測對PH值和緩沖液類型的依賴性。
PH值的依賴性;
方法
把含有碳酸氫鹽、甘氨酸和甘露醇+0.9%苯甲醇的商用hGH制劑(Norditropin， 12IU/ml)用0.1N的鹽酸將PH調(diào)節(jié)到8.3、8.0、7.5、7.0、6.5和6.0，并在37℃放置樣品。在0、7和14天后用RP-HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果顯示于下表3中。
表3亞砜的形成樣品溫度(℃)放置天數(shù)亞砜(%)PH8.37-01.0PH8.373779.0PH8.043778.7PH7.523778.3PH7.013777.7PH6.523776.5PH6.023774.8PH8.37371414.9PH8.04371414.5PH7.52371414.0PH7.01371412.9PH6.52371411.1PH6.0237147.7將意識(shí)到，當(dāng)把PH值從8.4降到6.0時(shí)hGH中亞砜的形成也被降低。
緩沖液的類型、PH把含有12mg/ml蒸餾水的B-hGH制劑以1+10的比例用各種緩沖液稀釋為15mM的濃度并可加入或不加入其它附加劑。在25℃下放置樣品，并在10和34天后用RP-HPLC進(jìn)行分析。RP-HPLC的分析結(jié)果和可有可無的附加劑顯示于下表4中。
表4亞砜的形成緩沖液PH附加劑亞砜化10天34天%磷酸鹽7.3-1.95.5組氨酸7.3-0.92.4組氨酸6.9-0.92.0組氨酸6.5-0.81.9組氨酸7.318mMMet0.82.0組氨酸7.318mMCys2.42.9組氨酸7.30.42mMtoc.1.13.0組氨酸7.39%乙醇1.34.2組氨酸7.318mMasc.41nd組氨酸7.30.8%NaCl1.33.5Toc維生素E，asc抗壞血酸。
與磷酸緩沖液相比，在組氨酸緩沖液(PH7.3)中可觀察到亞砜化B-hGH形成顯著下降。在組氨酸緩沖液中可觀察到隨PH值下降亞砜形成也下降。
加入抗氧化劑或其它附加劑未獲得進(jìn)一步的作用。
實(shí)施例4在磷酸鹽或組氨酸緩沖液存在下hGH的結(jié)晶將按Dalboege等(Biotechnology(1987)，5，161-164)的方法制備的hGH的等分試樣以6mg/ml的濃度在PH6.2的10mM磷酸鹽或10mM組氨酸緩沖液中進(jìn)行晶體生長。把乙醇加到每個(gè)試樣中使最終濃度為7.5%(V/V)，之后再加乙酸鋅溶液使在磷酸緩沖液中鋅的最終濃度為1.34molZn/molhGH和在組氨酸緩沖液中鋅的最終濃度為5.5molZn/molhGH。
在懸浮液中使晶體生長16小時(shí)并用相差顯微鏡監(jiān)控結(jié)晶作用。在組氨酸緩沖液中所形成的晶體具有好的所定義的大小一致的六方形外觀并含有很少或沒有非結(jié)晶雜質(zhì)(圖1)。相反，確實(shí)相同的條件下在磷酸緩沖液中所形成的hGH晶體具有明顯的多的不均勻外形并含有明顯量的非結(jié)晶物(圖2)。
讓晶體再生長5天。通過離心收集組氨酸和磷酸緩沖液所形成的晶體并把晶體溶于7M尿素中，隨后分析hGH。
緩沖液晶體(%)游離hGH(%)組氨酸6535磷酸鹽5545
因而，就晶體的產(chǎn)量和質(zhì)量而言，組氨酸緩沖液為hGH結(jié)晶提供了更好的條件。
實(shí)施例5將含有組胺酸和蔗糖或甘露醇的凍干hGH制劑的穩(wěn)定性與含有磷酸鹽、甘氨酸和甘露醇的常規(guī)hGH制劑進(jìn)行比較。
把hGH溶液脫鹽到所述的組氨酸緩沖液中制得下列制劑1-8。用各種組氨酸緩沖液把hGH的濃度調(diào)節(jié)到6IU/ml之后，溶入所述用量的甘露醇和蔗糖。
制劑9與常規(guī)hGH制劑相一致并被用作參照。
把所有1-9的hGH溶液填充到1ml的小玻璃瓶中并凍干。
在用0.9%的苯甲醇溶液重新配制后進(jìn)行hGH的分析。
1.hGH6IU/ml用HCl調(diào)到PH6.5甘露醇33mg/ml2.hGH6IU/ml用HCl調(diào)到PH6.5蔗糖62mg/ml3.hGH6IU/ml用HCl調(diào)到PH7.0甘露醇33mg/ml4.hGH6IU/ml用HCl調(diào)節(jié)到PH7.0
蔗糖62mg/ml5.hGH6IU/ml用HCl調(diào)到PH6.5甘露醇33mg/ml6.hGH6IU/ml用HCl調(diào)到PH6.5蔗糖62mg/ml7.hGH6IU/ml用HCl調(diào)到PH7.0甘露醇33mg/ml8.hGH6IU/ml用HCl調(diào)節(jié)到PH7.0蔗糖62mg/ml9.hGH6IU/mlNa2HPO4·2H2O 0.59mg/mlNaH2PO4·2H2O 0.53mg/ml甘露醇20.5mg/ml用磷酸調(diào)到PH7.0.
凍干的產(chǎn)品很容易溶解并形成透明的水溶液。
表5中列出了用%表示凍干前(BL)和凍干后立即、在4℃7個(gè)月后、在4℃7個(gè)月后加上37℃4個(gè)月和在4℃7個(gè)月后加上25℃4個(gè)月的多聚物的量。
表6中列出了用%表示的二聚物的量。
表7中列出了用%表示的脫酰胺hGH的量，并且表8中列出了用%表示的亞砜的量。
按實(shí)施例1-4的方法測定脫酰胺hGH和亞砜的量。
用gp-HPLC來測定二聚物和多聚物的量。
多聚物的量在含蔗糖的樣品中明顯較低。
二聚物的量在含蔗糖的樣品中明顯較低。
4℃7個(gè)月+25℃4個(gè)月后脫酰胺-hGH的量在含有組氨酸的組合物中非常低。
亞砜的量在含蔗糖的樣品中明顯較低。
實(shí)施例6含有組氨酸、甘露醇和二糖的凍干制劑的穩(wěn)定性。
用實(shí)施例5所描述的相同方法來制備下列制劑。
10.hGH6IU/ml用HCl調(diào)到PH6.5蔗糖21mg/ml甘露醇22mg/ml11.hGH6IU/ml用HCl調(diào)到PH7.0蔗糖21mg/ml甘露醇22mg/ml12.hGH6IU/ml用HCl調(diào)到PH7.0海藻糖20mg/ml甘露醇22mg/ml在凍干前(BL)、t＝0、40℃三個(gè)月后和25℃6個(gè)月后測定脫酰胺hGH、多聚物和二聚物的量(%)。
結(jié)果顯示在下表9-11中。
很明顯，含有甘露醇和蔗糖或海藻糖的樣品比只含有甘露醇作為凍干膨脹的樣品具有更好的穩(wěn)定性。
實(shí)施例7含有hGH晶體的藥物制劑的配制如實(shí)施例4中所述的方法生長晶體并在4℃貯存。然后通過離心分離晶體并隨后除去母液。再把晶體冷凍過夜得到無剩余有機(jī)溶劑的干燥晶體。按照下列處方配制干燥晶體的藥物懸浮液hGH晶體1.3mg/ml組氨酸1.6mg/mlZn(Ac)2·H2O 0.1mg/ml苯甲醇0.9%(V/V)用HCl把PH值調(diào)到6.5。
實(shí)施例8除省略Zn(Ac)2·H2O外重復(fù)實(shí)施例7，得到下列配方的懸浮液hGH晶體1.3mg/ml組氨酸1.6mg/ml苯甲醇0.9%(V/V)將PH調(diào)到6.2。
實(shí)施例9用實(shí)施例7相同方法處理晶體并配制下列懸浮液hGH晶體1.3mg/ml組氨酸1.33mg/mlNaCl5.7mg/ml苯甲醇0.9%(V/V)把PH調(diào)到6.2。
實(shí)施例10用實(shí)施例7相同方法處理晶體并制備下列溶液hGH晶體1.3mg/ml組氨酸1.14mg/mlNaCl9.0mg/ml把PH調(diào)到6.1。
實(shí)施例11用實(shí)施例1中所述的相似方法，用不同濃度的組氨酸(0、1、2、5、10、20、30、50或100mM)在PH6.5的0.9%苯甲醇中配制濃度為6IU/ml的生物合成的人生長激素。在37℃下將樣品存放7天并用如上所述的相同方法進(jìn)行脫酰胺、氧化形式和二聚物和多聚物的含量分析。結(jié)果顯示于下表12中，其中脫酰胺-hGH、二聚物和多聚物、以及氧化形式的含量是通過IE-HPLC、GP-HPLC和RP-HPLC測定的，裂解形式的hGH的含量是用IE-HPLC測得的。
當(dāng)組氨酸的濃度為1mM或1mM以上時(shí)二聚物的量較低，對形成脫酰胺化合物來說組氨酸的濃度高達(dá)30mM時(shí)得到滿意的結(jié)果，而對形成氧化形式來說組氨酸濃度低于20mM是優(yōu)選的。總的來說組氨酸濃度最好為5mM。
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權(quán)利要求
1.一種藥物制劑，它含有一種生長激素或一種生長激素衍生物和組氨酸或一種組氨酸衍生物，其用量為每mg生長激素0.1到12mg組氨酸或其衍生物。
2.按照權(quán)利要求1的藥物制劑，它是用1mM到100mM濃度的組氨酸緩沖液緩沖的緩沖性生長激素水溶液形式。
3.按照權(quán)利要求1的藥物制劑，它是用組氨酸緩沖液緩沖的緩沖性生長激素晶體的水懸浮液形式。
4.按照權(quán)利要求1-3的任一藥物制劑，其中將PH值調(diào)到2-9之間。
5.按照權(quán)利要求4的藥物制劑，其中把PH值調(diào)到5-8之間。
6.按照上述權(quán)利要求中的任一藥物制劑，還可以含有糖醇或二糖或其混合物。
7.按照上述權(quán)利要求中的任一藥物制劑，它含有甘露醇或二糖或其混合物。
8.按照權(quán)利要求7的藥物制劑，其中的二糖是蔗糖或海藻糖。
9.按照權(quán)利要求1-8中的任一藥物制劑，其中的生長激素為hGH。
10.生長激素的晶體，它含有組氨酸或一種組氨酸的衍生物。
11.按照權(quán)利要求10的晶體;其中生長激素是hGH。
12.生長激素或其衍生物和組氨酸或其衍生物晶體的制備方法，它包括的步驟有a)在一種溶劑中制備生長激素或生長激素衍生物的溶液并加入組氨酸或組氨酸衍生物，用鹽酸把PH任意調(diào)節(jié)到5到8之間。b)加入有機(jī)或無機(jī)陽離子。c)該溶液在約0℃到約30℃溫度下進(jìn)行結(jié)晶，并d)用已知方法分離形成的晶體。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其中步驟a)的溶劑選自短鏈脂族，脂環(huán)族或芳香族的醇類和酮類。
14.按照權(quán)利要求11或12的方法，其中的生長激素是hGH。
全文摘要
一種含有生長激素和作為附加劑或緩沖物的組氨酸或組氨酸衍生物的藥物制劑，具有較高的抗脫酰胺、氧化和裂解肽鍵的穩(wěn)定性。該產(chǎn)品的穩(wěn)定性可允許它以凍干狀態(tài)或已溶解或再溶解的制劑形式在室溫貯存和運(yùn)送。在組氨酸或組氨酸衍生物存在下結(jié)晶生長激素比已知方法能產(chǎn)生較高產(chǎn)量的具有較高純度的晶體。
文檔編號A61K38/27GK1096222SQ9312106
公開日1994年12月14日 申請日期1993年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月10日
發(fā)明者H·H·雪仁森, L·思克里沃, A·R·豪爾高德 申請人:諾沃挪第克公司