用于檢測(cè)braf基因v600e突變的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種用于檢測(cè)BRAF基因V600E突變的試劑盒,包括盒體、盒蓋和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊,所述襯墊上設(shè)有小孔,裝有BRAF-F引物的試劑管、裝有BRAF-R引物的試劑管、裝有Probe-F探針的試劑管、裝有Probe-R探針的試劑管、裝有PCR?MIX試劑的試劑管被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理,檢測(cè)步驟簡(jiǎn)便,檢測(cè)速度快,便于在臨床推廣應(yīng)用。
【專利說明】用于檢測(cè)BRAF基因V600E突變的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及基因突變檢測(cè)試劑盒,尤其涉及一種用于檢測(cè)BRAF基因V600E突變的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]BRAF基因全名為鼠類肉瘤濾過性毒菌(v-raf)致癌同源體BI,定位于人染色體7q34,其具有功能的編碼區(qū)由2510對(duì)堿基組成,編碼MAPK通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶,該酶將信號(hào)從Ras轉(zhuǎn)導(dǎo)至MEK1/2,從而參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件。
[0003]BRAF基因的突變大致在2個(gè)區(qū)域:一個(gè)是exonll上的甘氨酸環(huán),如G463、G465、G468等位點(diǎn)的突變;另一個(gè)區(qū)域是在CR2區(qū)域中的抑制AKR磷酸化區(qū)域,突變后BRAF激酶處于持續(xù)活化狀態(tài),使細(xì)胞持續(xù)增殖,從而演化為癌細(xì)胞。研究表明,在多種人類惡性腫瘤中,如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌以及肝癌等,均存在不同比例的BRAF基因突變,66%惡性黑色素瘤和15%結(jié)腸癌中BRAF基因存在體細(xì)胞錯(cuò)義突變。在人類腫瘤細(xì)胞中證實(shí),BRAF基因有30多個(gè)突變位點(diǎn),然而,大約80%?90%的BRAF基因突變發(fā)生在exonl5上的激活區(qū),其中約92%位于第1799核苷酸上,T突變?yōu)锳,導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600E)。
[0004]BRAF基因突變的患者接受EGFR-TKI靶向類藥物治療的有效率低,而且,V600E突變可導(dǎo)致部分KRAS基因野生型患者對(duì)EGFR-TKI (厄洛替尼或吉非替尼)及EGFR單抗藥物(西妥昔單抗或帕尼單抗)治療不敏感,因此,檢測(cè)腫瘤患者BRAF基因V600E突變對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。
[0005]現(xiàn)有的檢測(cè)BRAF基因V600E突變手段主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和基因測(cè)序。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶識(shí)別DNA分子的特異序列,并于特定序列處切開DNA分子,產(chǎn)生不同大小、不同數(shù)量的限制性片段,然后通過瓊脂糖凝膠電泳行突變分析,其優(yōu)點(diǎn)為結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好,但是檢測(cè)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、分析速度慢,且只能針對(duì)已知突變選取相應(yīng)限制性內(nèi)切酶,對(duì)未知突變作用有限?;驕y(cè)序技術(shù)采用巢式PCR擴(kuò)增BRAF基因外顯子11和15,用雙脫氧終止法,通過測(cè)序PCR反應(yīng)后形成在3’末端帶有熒光標(biāo)記的相差I(lǐng)個(gè)堿基的不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物,根據(jù)每段DNA產(chǎn)物的電泳速度來檢測(cè)整段DNA的序列,該檢測(cè)方法的檢測(cè)流程和結(jié)果分析均復(fù)雜、耗時(shí)。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0006]為了解決上述技術(shù)問題,本實(shí)用新型的目的在于提供一種用于檢測(cè)BRAF基因V600E突變的試劑盒,可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)BRAF基因V600E突變。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的,本實(shí)用新型采取的技術(shù)方案是:一種用于檢測(cè)BRAF基因V600E突變的試劑盒,包括盒體(I)、盒蓋(2)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(3),所述襯墊(3)上設(shè)有小孔,裝有BRAF-F引物的試劑管(4)、裝有BRAF-R引物的試劑管(5)、裝有Probe-F探針的試劑管(6)、裝有Probe-R探針的試劑管(7)、裝有PCR MIX試劑的試劑管(8)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
[0008]其中,所述試劑盒還包括:裝有去離子水的試劑管(9)。
[0009]其中,所述襯墊(3)上設(shè)有6個(gè)小孔,所述小孔在所述襯墊(3)上分成兩排平行排列。
[0010]其中,所述探針Probe-F的5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM,3’端連接非熒光淬滅基團(tuán)和MGB修飾基團(tuán);所述探針Probe-R的5’端連接熒光報(bào)告基團(tuán)HEX,3’端連接非熒光淬滅基團(tuán)和MGB修飾基團(tuán)。
[0011]其中,所述引物濃度為5 μ mol/L,所述探針濃度為3 μ mol/L。
[0012]所述引物和探針的序列如下:
[0013]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)BRAF基因V600E突變的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒包括盒體(I)、盒蓋(2)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(3),所述襯墊(3)上設(shè)有小孔,裝有BRAF-F引物的試劑管(4)、裝有BRAF-R引物的試劑管(5)、裝有Probe-F探針的試劑管(6)、裝有Probe-R探針的試劑管(7),裝有PCR MIX試劑的試劑管(8)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包括:裝有去離子水的試劑管(9)。
3.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒,其特征在于:其中,所述襯墊(3)上設(shè)有6個(gè)小孔,所述小孔在所述襯墊(3)上分成兩排平行排列。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK203530311SQ201320689080
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】徐姣姣, 劉曉峰, 侯然, 王紅霞, 杜崇嶺, 梁超, 王緒華, 方國(guó)偉, 黃士昂, 陳忠 申請(qǐng)人:北京海思特臨床檢驗(yàn)所有限公司