專利名稱：一種新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)試劑盒領(lǐng)域，具體涉及一種新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
先天性甲狀腺功能低下癥(CH，簡稱先天性甲低或甲減)，是由于各種先天因素使甲狀腺激素合成障礙、分泌減少，導(dǎo)致患兒生長障礙，智能落后的臨床綜合征。它是兒科最常見的內(nèi)分泌疾病之一，曾經(jīng)包括多項(xiàng)疾病分類名稱克汀病、地方性克汀病、甲狀腺腫性克汀病和散發(fā)性克汀病。目前CH定義為任何出生時(shí)即發(fā)生的甲狀腺功能低下。
世界各地的新生兒疾病篩查結(jié)果表明，先天性甲低的發(fā)病率在不同國家，不同民族之間差異較小，一般為1:3 000^1:4 000。CH患兒在出生后往往缺乏疾病的特異表現(xiàn)， 一般要到6月齡才逐漸出現(xiàn)固有的臨床癥狀，并日趨加重，然而，一旦出現(xiàn)了疾病的臨床癥狀，表明疾病已進(jìn)入了晚期。即使治療，治療低下也難以恢復(fù)；相反，若能在出生不久發(fā)現(xiàn)疾病，確診治療，那么極大多數(shù)患兒的身心將得到正常的發(fā)育，其智力亦可達(dá)到正常人的水平。
新生兒疾病篩查，就是用一種盡可能簡單的方法，對(duì)全部的新生嬰兒進(jìn)行普查， 以期及早發(fā)現(xiàn)患兒，確診后給予有效的治療，從而保證了患兒的健康成長，疾病的療效和預(yù)后如何，完全取決于確診和治療的早晚。據(jù)報(bào)道，CH患兒如能在出生3個(gè)月內(nèi)得到確診和治療，80%以上的患兒智力發(fā)育正常或接近正常。
CH的篩查，Dussault于1993年首先在北美用濾紙血斑放射免疫法檢測(cè)4_7天的新生兒末梢血中的甲狀腺素(T4)，1975年Lrie和Naruse等用濾紙血斑測(cè)定促甲狀腺素 (TSH)進(jìn)行CH的篩查，此后，CH的篩查在美國各州、歐洲、澳大利亞等國家迅速開展。在亞太地區(qū)，日本于1966年開始了有關(guān)新生兒疾病的研究，并從1977年起，率先進(jìn)行了 CH的非放射性篩查法——TSH的酶聯(lián)免疫測(cè)定法，至1983年，全日本已篩查出CH病例400例。
我國的新生兒疾病篩查工作起步較晚。自1989年起，北京、上海、廣州、天津等省市逐步開展了 CH常規(guī)篩查。1994年國家頒布的《母嬰保護(hù)法》中已明確提出“逐步開展新生兒疾病篩查”的條文，使新生兒疾病篩查走上了法制化軌道。目前，我國已有27個(gè)省市、 81個(gè)實(shí)驗(yàn)室開展了新生兒CH等疾病的篩查，診斷和治療水平也有了較大提高。但從總體來說，我國的新生兒疾病篩查工作還比較落后，全國每年出生2100萬活產(chǎn)兒，僅有M萬接受這一篩查，覆蓋率只有2. 5%，仍有很多患兒因未能及時(shí)診斷和治療而留有嚴(yán)重的智力殘疾， 嚴(yán)重影響了出生人口素質(zhì)的提高。
W fg] ^Ji7 IlJ ^ ^ (Time Resolved Immunofluorometric assay, TRIFMA)是八十年代初問世的一項(xiàng)新型的超微量免疫分析技術(shù)。熒光的時(shí)間分辨技術(shù)是利用熒光發(fā)射體的熒光壽命差別，將其熒光分開的熒光光譜技術(shù)。以鑭系元素為示蹤劑代替放射性同位素，用具有雙功能基團(tuán)的鑭系元素來標(biāo)記抗原或抗體，當(dāng)解離下來的鑭系元素與特制的擴(kuò)增液形成新的螯合物時(shí)，其熒光明顯增強(qiáng)而持久。用延遲測(cè)量的辦法可消除樣品自身的本底熒光，從而大大提高檢測(cè)靈敏度。
目前歐美、日本等不少國家對(duì)新生兒甲減進(jìn)行地區(qū)性的普遍篩查，方法不斷改進(jìn)，結(jié)果的判斷也更為準(zhǔn)確.現(xiàn)在使用的篩查方法有以下3種' .甲狀腺素低時(shí)再查促甲狀腺激素；f 甲狀腺素和促甲狀腺激素同時(shí)檢測(cè)；f單查促甲狀腺激素。新生兒TSH常用的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶免疫熒光測(cè)定 (EFIA)、時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定(Tr-FIA)及化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定。
目前國內(nèi)均以測(cè)定TSH作為CH的篩查方法，但此法不能檢出甲狀腺球蛋白缺乏和下丘腦垂體性甲低，也會(huì)漏檢TSH延遲升高的亞臨床CH。理想的篩查方法是同時(shí)檢測(cè)TSH 和FT4，但成本大大提高。
時(shí)間分辨雙標(biāo)記技術(shù)是利用不同鑭系離子間的熒光波長和熒光衰變時(shí)間不同，用兩種鑭系元素分別標(biāo)記不同的抗體，來檢測(cè)不同的抗原，該方法能省時(shí)、省工、省試劑和樣品，具有經(jīng)濟(jì)和高效等突出優(yōu)點(diǎn)。特別用于多項(xiàng)目的聯(lián)合篩查實(shí)驗(yàn)和一些珍貴樣品的檢測(cè)， 是標(biāo)記免疫學(xué)分析的發(fā)展方向。鑭系元素中Eu3+和Sm3+是常用于雙重標(biāo)記分析的一對(duì)鑭系離子，激發(fā)波長均為340nm，均能利用β-NTA螯合劑進(jìn)行解離和增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。Eu3+和Sm3+ 的最大發(fā)射波長分別為615nm和643nm，由于窄峰發(fā)射，能夠充分分辨。另外的熒光壽命相差顯著，分別為820 μ s和88 μ s，檢測(cè)時(shí)彼此的干擾比較小。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的檢測(cè)試劑盒中存在的不足，提供一種不僅能提高檢出率，而且還能省時(shí)、省工、省試劑和樣品的試劑盒，具有經(jīng)濟(jì)和高效的優(yōu)點(diǎn)，很適合在全國大量樣品篩查中應(yīng)用。
本發(fā)明另一目的在于提供上述試劑盒的制備方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述試劑盒的檢測(cè)方法。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所提供的試劑盒用于新生兒甲狀腺功能低下癥篩查中；提供了一種能識(shí)別促甲狀腺激素分子上不同抗原決定簇的兩個(gè)不同的單克隆抗體，以雙抗體夾心法定量分析濾紙干血片中的促甲狀腺素。還能識(shí)別游離甲狀腺素分子上抗原決定簇的一個(gè)單克隆抗體，及甲狀腺素-BSA連接物，以競爭法定量分析濾紙干血片中的游離甲狀腺素。同時(shí)提供了以制造標(biāo)準(zhǔn)血液斑點(diǎn)和質(zhì)控血液斑點(diǎn)的方法，以及用銪標(biāo)記促甲狀腺素單克隆抗體和釤標(biāo)記的游離甲狀腺素單克隆抗體，通過解離增強(qiáng)的時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)，以夾心法/競爭法，制作標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線的方法。
本發(fā)明上述檢測(cè)試劑盒可以提供與現(xiàn)今使用的檢測(cè)方法有區(qū)別的、從新生兒足跟濾紙干血片中，通過雙標(biāo)記的時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)，同時(shí)定量分析促甲狀腺素和游離甲狀腺素的方法，從而在篩查過程中不必采集大量血液，就可以區(qū)別出CH和高TSH血癥。
一種新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)，其特征在于所述試劑盒包括如下組分(1)實(shí)驗(yàn)緩沖液；(2)濃縮洗液；(3)增強(qiáng)液;(4)同時(shí)包被促甲狀腺素單克隆抗體和游離甲狀腺素BSA連接物的微孔反應(yīng)板；(5)同時(shí)含有促甲狀腺素和游離甲狀腺素的濾紙干血片標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；(6)Eu3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標(biāo)記的促甲狀腺素單克隆抗體和Sm3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標(biāo)記的游離甲狀腺素單克隆抗體。
上述同時(shí)檢測(cè)新生兒促甲狀腺素和游離甲狀腺素的試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)的制備方法包括如下步驟(1)制備實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮液、增強(qiáng)液；所述實(shí)驗(yàn)緩沖液用廣20g/L的牛血清白蛋白和緩沖液制成；所述濃縮液用1. (Γ10. Oml/L的Tween-20和緩沖液制成；所述增強(qiáng)液用廣5mg/L β -萘甲酰三氟丙酮、15 30mg/L的三正辛基氧化磷和緩沖液制成；(2)制備以促甲狀腺素單克隆抗體和游離甲狀腺素BSA連接物同時(shí)包被的微孔反應(yīng)板；所述反應(yīng)板用含有廣IOppm防腐劑的緩沖液將TSH單克隆抗體、FT4-BSA連接物稀釋成 riOyg/ml的包被液，包被空白微孔反應(yīng)板，并用含有1.(T10. Og/L的保護(hù)劑的封閉液封閉后干燥制成；(3)制備以促甲狀腺素純品、游離甲狀腺素純品配制的濾紙干血片標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品；(4)制備以Eu3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標(biāo)記促甲狀腺素單克隆抗體、Sm3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標(biāo)記游離甲狀腺素單克隆抗體；(5)分裝上述實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液、增強(qiáng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記物；(6)貼標(biāo)簽;(7)組裝為成品；其中，步驟(3)中濾紙干血片標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制備方法如下標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品制成濾紙干血片的基質(zhì)為人血紅細(xì)胞和去激素人陰性血清；基質(zhì)包括但不限于人血紅細(xì)胞和去激素人陰性血清；其中基質(zhì)的血細(xì)胞比容為45、0% ；其中血細(xì)胞比容為5(Γ55% ；紙片標(biāo)準(zhǔn)品為;TlO個(gè)不同濃度的點(diǎn)；其中以6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)為主，但不限于6個(gè)；質(zhì)控品為廣5 個(gè)不同濃度的點(diǎn)；其中以2個(gè)不同濃度的為主，但不限于2個(gè)；外包裝為鋁箔袋；促甲狀腺素、游離甲狀腺素標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制作，是以TSH國家標(biāo)準(zhǔn)品和FT4國家標(biāo)準(zhǔn)品為參照，用 5(Γ55%的血細(xì)胞比容的人血紅細(xì)胞和去激素陰性血清的混合基質(zhì)將促甲狀腺素或游離甲狀腺素純品分別制備成Α、B、C、D、Ε、F六個(gè)適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和Cl、C2 (低、高)兩個(gè)濃度的質(zhì)控品，以適當(dāng)體積分別滴加在濾紙的Α、B、C、D、Ε、F位置和Cl、C2位置上，經(jīng)室溫自然干燥后得到的干血濾紙片標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，用鋁箔袋真空密封。
本發(fā)明所述新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒的工作原理是時(shí)間分辨熒光免疫法，具體的操作方法包括如下步驟(1)試劑準(zhǔn)備將試劑所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫；將40ml上述濃縮洗液和 960ml純化水混合成工作洗滌液；使用前，將銪及釤標(biāo)記物各自用實(shí)驗(yàn)緩沖液按體積比1 100稀釋成標(biāo)記物工作液；(2)將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品或樣本用直徑3.Omm打孔器打入包被反應(yīng)板的微孔中，向每孔中分別加入10(Γ200μ 1上述的銪及釤的標(biāo)記物工作液；反應(yīng)板在室溫下，緩慢振蕩孵育廣4h ；用上述的工作洗滌液洗板6次，拍干；向每孔中加入10(Γ200μ 1增強(qiáng)液，緩慢振蕩5min，于時(shí)間分辨熒光免疫分析儀內(nèi)進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)；按測(cè)定參數(shù)進(jìn)行擬合分析，得到定量結(jié)果ο
本發(fā)明試劑盒適用于新生兒CH的篩查，定量檢測(cè)新生兒濾紙干血片中的TSH和 FT4含量。
TSH檢測(cè)靈敏度可達(dá)到2. 0 μ U/mL ；特異性方面，檢測(cè)250 U/L國家標(biāo)準(zhǔn)品hLH， 250 U/L國家標(biāo)準(zhǔn)品hFSH，10000 U/L國家標(biāo)準(zhǔn)品hCG，TSH表觀值均不高于0. 25 μ U/mL ； 線性相關(guān)系數(shù)試劑盒的測(cè)量范圍1-260 μ U/mL內(nèi)，劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于 0. 9900 ；HOOK效應(yīng)檢測(cè)的HOOK效應(yīng)高達(dá)1000 μ U/mL。
FT4檢測(cè)靈敏度不高于5pmol/L ；特異性方面，與三碘甲狀腺原氨酸(T3)的交叉反應(yīng)率不高于20%，與反甲狀腺原氨酸(rT3)的交叉反應(yīng)率不高于20% ；線性相關(guān)系數(shù)試劑盒的測(cè)量范圍內(nèi)，劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0. 9900。
測(cè)量準(zhǔn)確度分別以TSH國家標(biāo)準(zhǔn)品和FT4國家標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，試劑盒校準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)效價(jià)與標(biāo)示效價(jià)比平均值應(yīng)在0. 900 1. 100范圍內(nèi)；測(cè)量精密性分析內(nèi)不超過 15. 0% ；分析間不超過20. 0% ；質(zhì)控品測(cè)定值用兩個(gè)不同濃度質(zhì)控品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)值在允許范圍內(nèi)；穩(wěn)定性37°C 3天烘烤后，檢測(cè)結(jié)果符合以上技術(shù)性能指標(biāo)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明試劑盒采用雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光分析法，一次測(cè)量可以同時(shí)得到TSH、FT4值， 可提高臨床檢驗(yàn)速度和檢驗(yàn)數(shù)量，大幅度降低人為誤差，減輕臨床工作強(qiáng)度；且待檢標(biāo)本用量少，在同一反應(yīng)體系中，還降低了系統(tǒng)干擾對(duì)雙指標(biāo)檢測(cè)的影響，并提高鑒別診斷的特異度，為雙標(biāo)記TRFIA檢測(cè)奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)填補(bǔ)了國內(nèi)該類試劑的空白，降低了成本。


圖1為本發(fā)明試劑盒中TSH紙片標(biāo)準(zhǔn)品曲線圖； 圖2為本發(fā)明試劑盒中TF4紙片標(biāo)準(zhǔn)品曲線圖；圖3為本發(fā)明試劑盒與市場上PE公司的新生兒促甲狀腺素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)新生兒濾紙干血片樣品值的比較，關(guān)系系數(shù)為r=0. 995 ；圖4為本發(fā)明試劑盒與市場上廣州市豐華生物工程公司的甲狀腺素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)對(duì)應(yīng)濾紙干血片的血清樣品值的比較，關(guān)系系數(shù)為r=0. 995。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
實(shí)施例中的促甲狀腺素、游離甲狀腺素純品，促甲狀腺素、游離甲狀腺素單克隆抗體，游離甲狀腺素連接物購于Sigma公司；96孔微孔空白板(8X 12孔)為Therom產(chǎn)品；S^hadex G — 50為Wiarmacia公司產(chǎn)品；國家標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所； β-萘甲酰三氟丙酮、三正辛基氧化磷、TritonX-IOO購于Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純；時(shí)間分辨熒光免疫分析儀(PE公司1420型)，恒溫振蕩儀、全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)均購于廣州市豐華生物有限公司。
實(shí)施例1制備本發(fā)明的新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)組分包括實(shí)驗(yàn)緩沖液用1 g/L 20g/L的牛血清白蛋白和緩沖液制成； 濃縮洗液用1. 0ml/L 10. Oml/L的Tween-20和緩沖液制成； 增強(qiáng)液用1 5mg/Li3 -萘甲酰三氟丙酮、15 30mg/L的三正辛基氧化磷和緩沖液制成。
反應(yīng)板反應(yīng)板用含有1 IOppm防腐劑的緩沖液將TSH單克隆抗體、FT4-連接物稀釋成1 10 μ g/ml的包被液，包被空白微孔反應(yīng)板，并用含有1. Og/L 10. Og/L的保護(hù)劑的封閉液封閉后干燥制成。
紙片標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品按50% 55%的血細(xì)胞比容由人血紅細(xì)胞和去激素陰性血清混合基質(zhì)將TSH、FT4純品制備成6個(gè)適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和低、高兩個(gè)適當(dāng)濃度的質(zhì)控品，以 50μ1體積分別滴加在濾紙上，經(jīng)室溫自然干燥后得到。
標(biāo)記物TSH、FT4標(biāo)記物用TSH單克隆抗體、FT4單克隆抗體分別與鑭系元素離子螯合物按1 :1 1 :6 (m/m)標(biāo)記制得母液，母液再用標(biāo)記物稀釋液按1 :10 1 :25倍稀釋而成。
本發(fā)明的同時(shí)檢測(cè)TSH、FT4試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫分析法)的主要工藝制備如下1)通用試劑的制備實(shí)驗(yàn)緩沖液為在含0.01g/L的乙二胺四乙酸二鈉的50mmol/L、 ρΗ7· 8的Tris-Hcl溶液中加入1. 0g/L 20. 0g/L的牛血清白蛋白；濃縮洗液為含1. Oml/ L 10. 0ml/L Tween-20 的 0. 15mol/L、pH7. 8 的 Tris-Hcl 緩沖液；增強(qiáng)液為在含有 lml/L TritonX-100的0. lmol/L鄰苯二甲酸氫鉀-冰醋酸溶液中加入lmg/L 5mg/L0 -萘甲酰三氟丙酮、15mg/L 30mg/L的三正辛基氧化磷。其中實(shí)驗(yàn)緩沖液的牛血清白蛋白為10. Og/ L ；濃縮洗液中的Tween-20為4. 0ml/L。增強(qiáng)液中的β -萘甲酰三氟丙酮4. 0mg/L、三正辛基氧化磷 20mg/L、TritonX-100 為 lml/L ；2)包被板的制備將TSH單克隆抗體、FT4-BSA連接物分別用緩沖稀釋成濃度為1 10 μ g/ml的包被液；在96孔的微孔空白板中加入包被液100 200 μ 1/孔，35 V條件下孵育過夜；孵育好的包被板用工作洗滌液洗板1次，拍干；將洗滌過的包被板按250 280 μ 1/孔加入封閉液，25士2°C條件下孵育過夜；甩干，過夜晾干；用鋁箔袋真空密封；置 2 8°C條件下保存。
其中TSH單克隆抗體、FT4-BSA連接物采用棋盤滴定法確定包被濃度，用緩沖液稀釋成濃度為 ο μ g/ml的包被液包被效果為最佳。包被抗體稀釋液為含5ppm Proclin300e 的0. 05mol/L、ρΗ9· 6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液；封閉液為含5. 0g/L海藻糖、0. 5%BSA, 0. 05mol/L、pH9. 6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液；包被板的熱穩(wěn)定性良好。
4)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制備以TSH國家標(biāo)準(zhǔn)品和FT4國家標(biāo)準(zhǔn)品為參照，按50% 55%的血細(xì)胞比容由人血紅細(xì)胞和去激素陰性血清混合基質(zhì)將TSH、FT4純品混合制備成6 個(gè)適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和低、高兩個(gè)適當(dāng)濃度的質(zhì)控品，以50μ1體積分別滴加在濾紙的Α、Β、 C、D、E、F位置和C1、C2位置上，經(jīng)室溫自然干燥后得到的干濾紙片標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，用鋁箔袋真空密封。
5)標(biāo)記物的制備將Img TSH單克隆標(biāo)記抗體加入Img的Eu3+-N2-[P_異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉中混勻，28°C反應(yīng)44h ；反應(yīng)液經(jīng)kphadex G — 50柱(1 X 40cm) 用50mmol/L、pH7. 8的Tris-Hcl緩沖液洗脫，分離Eu3+-單克隆抗體結(jié)合物與游離Eu3+，采用全自動(dòng)部分收集器anl/管進(jìn)行液體收集；于時(shí)間分辨熒光免疫分析儀上進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)， 收集第一峰中熒光計(jì)數(shù)大于10000000的洗脫液，加等體積甘油，混勻后-20°C保存；采用棋盤滴定法確定銪標(biāo)記工作液濃度，用實(shí)驗(yàn)緩沖液再按1 :100稀釋檢測(cè)效果最佳；將Img FT4單克隆抗體加入Img的Sm3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉中混勻反應(yīng) 44h ；反應(yīng)液經(jīng) kphadex G - 50 柱(lX40cm)用 50mmol/L、pH7. 8 的 Tris-Hcl緩沖液洗脫，分離Sm3+-單克隆抗體結(jié)合物與游離Sm3+，采用全自動(dòng)部分收集器 2ml/管進(jìn)行液體收集；于時(shí)間分辨熒光免疫分析儀上進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)，收集第一峰中熒光計(jì)數(shù)大于1000000的洗脫液，加等體積甘油，混勻后_20°C保存；采用棋盤滴定法確定標(biāo)記工作液濃度，用實(shí)驗(yàn)緩沖液再按1 :100稀釋檢測(cè)效果最佳；6)實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液、增強(qiáng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和銪標(biāo)記物分裝；7)貼標(biāo)簽；8)成品組裝。
上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出3份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫分析法)。組裝完成后還需抽檢合格后才能出廠(圖廣2)。
實(shí)施例2實(shí)施例1制得的試劑盒的使用方法以上實(shí)施例1制備的新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫分析法)的具體操作如下將試劑所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫；將40ml上述濃縮洗液和960ml純化水混合成工作洗滌液；使用前，將銪標(biāo)記物，釤標(biāo)記物用實(shí)驗(yàn)緩沖液按體積比1 :100稀釋成標(biāo)記物工作液。
將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品或樣本用直徑3. Omm打孔器打入固相包被反應(yīng)板中，向每孔中加入100 200 μ 1上述的標(biāo)記物工作液，緩慢振蕩孵育1 4h ；用上述的工作洗滌液洗板 6次，拍干；向每孔中加入100 200 μ 1增強(qiáng)液；緩慢振蕩5分鐘，于時(shí)間分辨熒光免疫分析儀內(nèi)進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)；按測(cè)定參數(shù)進(jìn)行結(jié)果擬合分析，得到定量結(jié)果。
實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒的分析性能評(píng)價(jià)指標(biāo)以上實(shí)施例1制備的新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫分析法)的性能評(píng)價(jià)指標(biāo)如下劑量反應(yīng)曲線和線性范圍采用LOG-LOGB軸變換模式與SPLINE擬合算法，標(biāo)準(zhǔn)品含量對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相應(yīng)反應(yīng)孔熒光值對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑盒的測(cè)量范圍內(nèi)，劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0. 9900。
靈敏度以零標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)20次，計(jì)算其濃度均值Cr)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(·5)，以χ + Zs為檢測(cè)低限，則TSH檢測(cè)靈敏度可達(dá)到2. 0 μ U/mL ；FT4檢測(cè)靈敏度不高于5pmol/L。特異性檢測(cè)250 U/L國家標(biāo)準(zhǔn)品hLH，250 U/L國家標(biāo)準(zhǔn)品hFSH，10000 U/L國家標(biāo)準(zhǔn)品hCG，TSH表觀值均不高于0. 25 μ U/mL ；FT4與三碘甲狀腺原氨酸(T3)的交叉反應(yīng)率不高于2%，與反甲狀腺原氨酸(rT3)的交叉反應(yīng)率不高于1 ；準(zhǔn)確性以國家標(biāo)準(zhǔn)品和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)效價(jià)與標(biāo)示效價(jià)比平均值應(yīng)在0. 900 1. 100范圍內(nèi)。
精密性試劑盒的測(cè)量精密性，批內(nèi)不超過15. 0% ；批間不超過20. 0%。
室內(nèi)質(zhì)控三個(gè)不同濃度質(zhì)控，TSH、FT4測(cè)值均在允許范圍內(nèi)。
HOOK 效應(yīng)TSH 的 HOOK 效應(yīng)高達(dá) 1000 μ U/mL。
熱穩(wěn)定性(加速破壞試驗(yàn))試劑盒在37°C 3天烘烤后，檢測(cè)結(jié)果符合以上性能指標(biāo)。
以上性能指標(biāo)表明“新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫分析法)，，的線性范圍寬、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、精密性好和熱穩(wěn)定性好，完全符合要求。
實(shí)施例4使用實(shí)施例1制得的新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)與市場上PE公司的新生兒促甲狀腺素檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)和廣州市豐華生物工程有限公司的甲狀腺素檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。
將采集到的濾紙干血片樣本用本專利制得的新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)和PE公司的新生兒促甲狀腺素檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)進(jìn)行檢測(cè)，將采集到濾紙干血片相對(duì)應(yīng)的血清用廣州市豐華生物工程有限公司的甲狀腺素檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)所得結(jié)果作相關(guān)性分析，結(jié)果見圖3，圖4。
結(jié)果表明本專利制得的新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)與現(xiàn)有的試劑盒檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好，完全可以應(yīng)用于新生兒篩查。
權(quán)利要求
1.一種新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括如下組分(1)實(shí)驗(yàn)緩沖液；(2)濃縮洗液；(3)增強(qiáng)液;(4)同時(shí)包被促甲狀腺素單克隆抗體和游離甲狀腺素BSA連接物的微孔反應(yīng)板；(5)同時(shí)含有促甲狀腺素和游離甲狀腺素的濾紙干血片標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；(6)Eu3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標(biāo)記的促甲狀腺素單克隆抗體和Sm3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標(biāo)記的游離甲狀腺素單克隆抗體。
2.權(quán)利要求1所述新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒的制備方法， 其特征在于包括如下步驟(1)制備實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮液、增強(qiáng)液；所述實(shí)驗(yàn)緩沖液用廣20g/L的牛血清白蛋白和緩沖液制成；所述濃縮液用1. (Γ10. 0ml/L的Tween-20和緩沖液制成；所述增強(qiáng)液用廣5mg/L β -萘甲酰三氟丙酮、15 30mg/L的三正辛基氧化磷和緩沖液制成；(2)制備以促甲狀腺素單克隆抗體和游離甲狀腺素BSA連接物同時(shí)包被的微孔反應(yīng)板；所述反應(yīng)板用含有廣IOppm防腐劑的緩沖液將TSH單克隆抗體、FT4-連接物稀釋成 riOyg/ml的包被液，包被空白微孔反應(yīng)板，并用含有1. (TlO. Og/L的保護(hù)劑的封閉液封閉后干燥制成；(3)制備以促甲狀腺素純品、游離甲狀腺素純品配制的濾紙干血片標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品；(4)制備以Eu3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標(biāo)記促甲狀腺素單克隆抗體、Sm3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉標(biāo)記游離甲狀腺素單克隆抗體；(5)分裝上述實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液、增強(qiáng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記物；(6)貼標(biāo)簽;(7)組裝為成品；其中，步驟(3)中濾紙干血片標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制備方法如下標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品制成濾紙干血片的基質(zhì)為人血紅細(xì)胞和去激素人陰性血清；基質(zhì)包括但不限于人血紅細(xì)胞和去激素人陰性血清；其中基質(zhì)的血細(xì)胞比容為45、0% ；其中血細(xì)胞比容為5(Γ55% ；紙片標(biāo)準(zhǔn)品為;TlO個(gè)不同濃度的點(diǎn)；其中以6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)為主，但不限于6個(gè)；質(zhì)控品為廣5 個(gè)不同濃度的點(diǎn)；其中以2個(gè)不同濃度的為主，但不限于2個(gè)；外包裝為鋁箔袋；促甲狀腺素、游離甲狀腺素標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品的制作，是以TSH國家標(biāo)準(zhǔn)品和FT4國家標(biāo)準(zhǔn)品為參照，用 5(Γ55%的血細(xì)胞比容的人血紅細(xì)胞和去激素陰性血清的混合基質(zhì)將促甲狀腺素或游離甲狀腺素純品分別制備成Α、B、C、D、Ε、F六個(gè)適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和Cl、C2 (低、高)兩個(gè)濃度的質(zhì)控品，以適當(dāng)體積分別滴加在濾紙的Α、B、C、D、Ε、F位置和Cl、C2位置上，經(jīng)室溫自然干燥后得到的干血濾紙片標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，用鋁箔袋真空密封。
3.權(quán)利要求1所述新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒的操作方法， 其特征在于包括如下步驟(1)試劑準(zhǔn)備將試劑所需數(shù)量的微孔反應(yīng)板條平衡至室溫；將40ml上述濃縮洗液和 960ml純化水混合成工作洗滌液；使用前，將銪及釤標(biāo)記物各自用實(shí)驗(yàn)緩沖液按體積比1 100稀釋成標(biāo)記物工作液；(2)將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品或樣本用直徑3. Omm打孔器打入包被反應(yīng)板的微孔中，向每孔中分別加入10(Γ200μ 1上述的銪及釤的標(biāo)記物工作液；反應(yīng)板在室溫下，緩慢振蕩孵育廣4h ；用上述的工作洗滌液洗板6次，拍干；向每孔中加入10(Γ200 μ 1增強(qiáng)液，緩慢振蕩 5min,于時(shí)間分辨熒光免疫分析儀內(nèi)進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)；按測(cè)定參數(shù)進(jìn)行擬合分析，得到定量結(jié)^ ο
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新生兒促甲狀腺素/游離甲狀腺素雙標(biāo)記檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的檢測(cè)方法。本發(fā)明所述方法不僅能提高檢出率，還能省時(shí)、省工、省試劑和樣品，具有經(jīng)濟(jì)高效的優(yōu)點(diǎn)，適合在全國大量樣品篩查中應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102520196SQ20111039419
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者何海榮, 馮健明, 吳道貧, 孫勇, 汪勤, 沈健, 譚玉華, 鮑冬芹 申請(qǐng)人:廣州市豐華生物工程有限公司