本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及的是一種鐵皮石斛種胚微粒的克隆培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
：鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKmuraetMigo）是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，味甘，性微寒，具有生津養(yǎng)胃、滋陰清熱、潤(rùn)肺益腎、明目強(qiáng)腰等功效。根據(jù)國(guó)家藥典記載，其主要藥效成份為石斛多糖和石斛堿。鐵皮石斛藥用原球莖是由鐵皮石斛果莢中的種胚微粒經(jīng)液體克隆形成球莖原胚體，該階段，可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)和特殊的培養(yǎng)條誘導(dǎo)使原球莖富集了大量的初生和次生代謝產(chǎn)物，其中石斛堿、毛蘭素和多糖的含量均為其整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中最高的階段。經(jīng)臨床研究證明此類(lèi)原球莖具有與市售鐵皮石斛鮮條和楓斗同等的藥用和保健價(jià)值。種胚微粒是指鐵皮石斛成熟果莢中粉狀、細(xì)小的淡黃色微粒，每一顆種胚微料都攜帶了植物母本全部遺傳基因，在野外環(huán)境下，其需與某真菌誘導(dǎo)子結(jié)合才能萌發(fā)，故自然萌發(fā)率極低，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，可通過(guò)克隆誘導(dǎo)的方式可直接形成鐵皮石斛原球莖和鐵皮石斛植株。目前，原球莖的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式是利用對(duì)鐵皮石斛外植體芽莖段的誘導(dǎo)產(chǎn)生小細(xì)胞團(tuán)，再對(duì)小細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行擴(kuò)繁和不斷繼代培養(yǎng)而獲得的，嚴(yán)格意義來(lái)說(shuō)，此類(lèi)原球莖應(yīng)稱為類(lèi)原球莖團(tuán)，由于是從外植的細(xì)胞誘導(dǎo)，且不斷地繼代培養(yǎng)而使得其遺傳特性具有隨機(jī)性和較大突變機(jī)率，不能完全保留母本的全部遺傳性狀，從而導(dǎo)致其表達(dá)譜不能與母本完全一致，主要活性成份如多糖、石斛堿等表達(dá)量低或表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生改變，使類(lèi)原球莖團(tuán)在藥用或食用價(jià)值和安全性上都得不到保證。有鑒于此，本發(fā)明人針對(duì)上述缺陷深入研究，遂有本案產(chǎn)生。本發(fā)明中的原球莖均為單一種胚微粒誘導(dǎo)形成，原球莖在增殖的過(guò)程中不形成多個(gè)不規(guī)則細(xì)胞團(tuán)，而是生長(zhǎng)發(fā)育成較大的植株胚狀體，具有植物體特征。每一顆種胚微粒在誘導(dǎo)形成藥用原球莖的過(guò)程中只進(jìn)行自體生長(zhǎng)發(fā)育，而不會(huì)分化成多個(gè)異體細(xì)胞團(tuán)，從而完整地保留了母本的遺傳特性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種鐵皮石斛種胚微粒的克隆培養(yǎng)技術(shù)，主要應(yīng)用于具有藥用、食用價(jià)值的高品質(zhì)鐵皮石斛原球莖的大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明專利選用鐵皮石斛的成熟果莢，經(jīng)無(wú)菌消毒后取出種胚微料接入克隆液體培養(yǎng)基，通氣低溫暗培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)入光照27℃下繼續(xù)通氣懸浮培養(yǎng)三周，至種胚微粒完成萌發(fā)、膨脹、轉(zhuǎn)綠，形成錐形小原球莖，此可作為鐵皮石斛藥用原球莖大規(guī)模生產(chǎn)的種質(zhì)材料。本發(fā)明采用鐵皮石斛原球莖專用通氣懸浮培養(yǎng)裝置進(jìn)行克隆培養(yǎng)，可以為培養(yǎng)過(guò)程不斷地提供新鮮溶氧、有效的攪拌和實(shí)時(shí)補(bǔ)料，促進(jìn)種胚快速生長(zhǎng)，整個(gè)培養(yǎng)周期僅為一個(gè)月，與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)需3-4個(gè)月相比，大大縮短了生產(chǎn)周期，且單批次生產(chǎn)規(guī)模大、產(chǎn)量高、成本低，由于是應(yīng)用克隆技術(shù)，可以有效保障植物體的遺傳穩(wěn)定性和安全性。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是：一種鐵皮石斛種胚微粒的克隆培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)選用人工種植的鐵皮石斛成熟果莢，果莢飽滿，青綠或綠紫色，采收于十月至十一月期間，先用干燥紙巾包裹好，放入存有干燥劑的帶蓋玻璃瓶，低溫4℃下處理3天后，取出用手術(shù)刀片將果莢的多余部份切除，只留1～2cm長(zhǎng)的果柄，稱重并記錄。進(jìn)一步，將處理好的果莢移入已經(jīng)滅過(guò)菌的超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用酒精棉球擦拭果莢表面，于10%次氯酸鈉處理10min，無(wú)菌水沖洗3次，然后浸入70%酒精中40s，無(wú)菌水沖洗3次，置于接種盤(pán)中切開(kāi)果莢底部，均勻地播入裝有克隆液體培養(yǎng)基的通氣培養(yǎng)瓶中，播完種的果莢取出，稱重并記錄，計(jì)算播入種胚微粒的克數(shù)。進(jìn)一步，將播完種的通氣培養(yǎng)瓶先套入避光袋中，放置培養(yǎng)架上，連接通氣泵，通氣量5L/min,溶氧系數(shù)2%，培養(yǎng)溫度20℃，進(jìn)行暗培養(yǎng)1周，再移去避光袋，進(jìn)光照培養(yǎng)，通氣量10L/min，溶氧系數(shù)2%，培養(yǎng)溫度27℃，光照強(qiáng)度2500Lux，培養(yǎng)4周，期間每隔一周進(jìn)行一次補(bǔ)液，共3次。本發(fā)明中的克隆液體培養(yǎng)的配方為：改良MS培養(yǎng)基，其中硝酸銨更換成硫酸銨，加入量減半，氯化鈣加入量減半；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：6芐基腺嘌呤0.02份量；滲透調(diào)節(jié)劑、碳源：蔗糖40份量；氨基酸補(bǔ)充劑、氮源：酸水解酪蛋白0.2份量，天然有機(jī)添加物：馬鈴薯汁150份量，加超純水配制成1000份量。補(bǔ)料配方為：1/4改良MS培養(yǎng)基，單次補(bǔ)液量為培養(yǎng)基總量的1/3，共補(bǔ)液3次。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明采用鐵皮石斛原球莖專用通氣懸浮培養(yǎng)裝置進(jìn)行克隆培養(yǎng)，可以為培養(yǎng)過(guò)程不斷地提供新鮮溶氧、有效的攪拌和實(shí)時(shí)補(bǔ)料，促進(jìn)種胚快速生長(zhǎng)，整個(gè)培養(yǎng)周期僅為35天，與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)需3-4個(gè)月相比，大大縮短了生產(chǎn)周期，且單批次生產(chǎn)規(guī)模大、產(chǎn)量高、成本低，由于是應(yīng)用克隆技術(shù)，可以有效保障植物體的遺傳穩(wěn)定性和安全性。本發(fā)明所生產(chǎn)獲得的小原球莖可作為鐵皮石斛藥用原球莖大規(guī)模生產(chǎn)的最佳種質(zhì)材料，這為實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛藥用原球莖的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)和原料支撐，可以快速推進(jìn)鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展進(jìn)程，用科技來(lái)保障產(chǎn)品安全和效用，以及通過(guò)有效的降低生產(chǎn)成本和零售成本，來(lái)讓更多人能夠消費(fèi)得起曾經(jīng)只供皇室獨(dú)享的民間仙草——鐵皮石斛。具體實(shí)施方式為了進(jìn)一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例和現(xiàn)有固體培養(yǎng)實(shí)施例、液體振蕩培養(yǎng)實(shí)施來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。實(shí)施例一：本案發(fā)明選用人工種植的鐵皮石斛成熟果莢，果莢飽滿，青綠或綠紫色，采收于10月15日，先用干燥紙巾包裹好，放入存有干燥劑的帶蓋玻璃瓶，低溫4℃下處理3天后，用手術(shù)刀片將果莢的多余部份切除，只留1.5cm長(zhǎng)的果柄，稱重并記錄，得1.63g。將處理好的果莢移入已經(jīng)滅過(guò)菌的超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用酒精棉球擦拭果莢表面，于10%次氯酸鈉處理10~20min，無(wú)菌水沖洗3次，然后浸入70%酒精中40smin，無(wú)菌水沖洗3次，置于接種盤(pán)中切開(kāi)果莢底部，均勻地播入裝有克隆液體培養(yǎng)基的通氣培養(yǎng)瓶中，播完種的果莢取出，稱重并記錄，得0.93g，計(jì)算播入種胚微粒的克數(shù)為0.7g。將播完種的通氣培養(yǎng)瓶先套入避光袋中，放置培養(yǎng)架上，連接通氣泵，通氣量5L/min,溶氧系數(shù)2%，培養(yǎng)溫度20℃，進(jìn)行暗培養(yǎng)1周，再移去避光袋，進(jìn)光照培養(yǎng)，通氣量10L/min，溶氧系數(shù)2%，培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度2500Lux，培養(yǎng)4周，期間每隔一周進(jìn)行一次補(bǔ)液，共3次。培養(yǎng)結(jié)束后取出小原球莖，外觀記錄為：黃綠色，形態(tài)飽滿，錐形球狀，球莖較大；瀝干水份后，稱重得81.23g，計(jì)算增殖倍數(shù)為115.7。本實(shí)施例的克隆液體培養(yǎng)的配方為：改良MS培養(yǎng)基，其中硝酸銨更換成硫酸銨，加入量減半，氯化鈣加入量減半；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：6芐基腺嘌呤0.2mL；滲透調(diào)節(jié)劑、碳源：蔗糖40g；氨基酸補(bǔ)充劑、氮源：酸水解酪蛋白0.2g，天然有機(jī)添加物：馬鈴薯汁150g，加超純水定容至1L。補(bǔ)料配方為：1/4改良MS培養(yǎng)基，單次補(bǔ)液量為培養(yǎng)基總量的350mL，共補(bǔ)液三次。實(shí)施例二：固體培養(yǎng)選用人工種植的鐵皮石斛成熟果莢，果莢飽滿，青綠或綠紫色，采收于10月15日，先用干燥紙巾包裹好，放入存有干燥劑的帶蓋玻璃瓶，低溫4℃下處理3天后，用手術(shù)刀片將果莢的多余部份切除，只留1.5cm長(zhǎng)的果柄，稱重并記錄，得1.45g。將處理好的果莢移入已經(jīng)滅過(guò)菌的超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用酒精棉球擦拭果莢表面，于10%次氯酸鈉處理10~20min，無(wú)菌水沖洗3次，然后浸入70%酒精中40smin，無(wú)菌水沖洗3次，置于接種盤(pán)中切開(kāi)果莢底部，均勻地播入裝有固體培養(yǎng)基的組培瓶中，播完種的果莢取出，稱重并記錄，得0.81g，計(jì)算播入種胚微粒的克數(shù)為0.64g。將播完種的組培瓶，放置暗室培養(yǎng)一周，培養(yǎng)溫度20℃，再進(jìn)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度2500Lux，培養(yǎng)8周。培養(yǎng)結(jié)束后取出小原球莖，外觀記錄為：表層球莖為黃綠色，底層球莖為黃白色，球莖較小，為橢圓錐形；稱重得25.12g，計(jì)算增殖倍數(shù)為39.2。本實(shí)施例的固定培養(yǎng)的配方為：改良MS培養(yǎng)基，其中硝酸銨更換成硫酸銨，加入量減半，氯化鈣加入量減半；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：6芐基腺嘌呤0.2mL；滲透調(diào)節(jié)劑、碳源：蔗糖40g；氨基酸補(bǔ)充劑、氮源：酸水解酪蛋白0.2g，天然有機(jī)添加物：馬鈴薯汁150g，瓊脂8克，加超純水定容至1L。實(shí)施例三：液體振蕩培養(yǎng)選用人工種植的鐵皮石斛成熟果莢，果莢飽滿，青綠或綠紫色，采收于10月15日，先用干燥紙巾包裹好，放入存有干燥劑的帶蓋玻璃瓶，低溫4℃下處理3天后，用手術(shù)刀片將果莢的多余部份切除，只留1.5cm長(zhǎng)的果柄，稱重并記錄，得1.65g。將處理好的果莢移入已經(jīng)滅過(guò)菌的超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用酒精棉球擦拭果莢表面，于10%次氯酸鈉處理10~20min，無(wú)菌水沖洗3次，然后浸入70%酒精中40smin，無(wú)菌水沖洗3次，置于接種盤(pán)中切開(kāi)果莢底部，均勻地播入裝有液體培養(yǎng)基的組培瓶中，播完種的果莢取出，稱重并記錄，得0.86g，計(jì)算播入種胚微粒的克數(shù)為0.79g。將播完種的組培瓶，放置振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)一周，轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度20℃，再進(jìn)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/min，光照強(qiáng)度2500Lux，培養(yǎng)4周。培養(yǎng)結(jié)束后取出小原球莖，外觀記錄為：球莖為黃綠色，球莖較小，有透明化現(xiàn)象；稱重得48.31g，計(jì)算增殖倍數(shù)為54.8。本實(shí)施例的固定培養(yǎng)的配方為：改良MS培養(yǎng)基，其中硝酸銨更換成硫酸銨，加入量減半，氯化鈣加入量減半；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：6芐基腺嘌呤0.2mL；滲透調(diào)節(jié)劑、碳源：蔗糖40g；氨基酸補(bǔ)充劑、氮源：酸水解酪蛋白0.2g，天然有機(jī)添加物：馬鈴薯汁150g，加超純水定容至1L。綜上，如表1所示，本發(fā)明與現(xiàn)有的固體組培技術(shù)和液體振蕩培養(yǎng)技術(shù)相比，其增殖系數(shù)提高顯著，原球莖品質(zhì)好。表1三種原球莖培養(yǎng)技術(shù)的參數(shù)對(duì)比技術(shù)方案接種量培養(yǎng)周期外觀描述增殖重量增殖倍數(shù)本案0.70g35天綠色，形態(tài)飽滿，錐形球狀，球莖較大81.23g115.7固體培養(yǎng)0.64g35天表層球莖為黃綠色，底層球莖為黃白色，球莖較小，為橢圓錐形25.12g39.2液體振蕩培養(yǎng)0.79g35天球莖為黃綠色，球莖較小，有透明化現(xiàn)象48.31g54.8當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3