本發(fā)明涉及可噴霧液體生物防治制劑，其包含嵌入有微生物生物防治劑的分散的淀粉基生物塑料，所述微生物生物防治劑被遞送至靶標(biāo)如病原體和葉子，以降低農(nóng)產(chǎn)品的污染和侵染。本發(fā)明提供了以下實(shí)例：噴霧包含球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的昆蟲病原性分離株或由蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)產(chǎn)生的內(nèi)毒素的生物防治制劑，以有效地防治玉米中歐洲玉米螟(European Corn Borer)的侵染；將包含非產(chǎn)毒素的黃曲霉(Aspergillus flavus)菌株的可噴霧生物防治制劑遞送至作物以有效地減少玉米和其他作物植物中黃曲霉毒素污染；以及將包含哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的可噴霧生物防治制劑施用于番茄種子以有效減少立枯病。另外，這種可噴霧生物塑料制劑也用于攜帶球孢白僵菌菌株的孢子以防治棉花中的美國牧草盲蝽(Tarnished Plant Bug)。

背景技術(shù)：

通用術(shù)語微生物生物防治劑是指在農(nóng)業(yè)有害生物(包括細(xì)菌、真菌、雜草和昆蟲)防治中的微生物的使用。雖然文獻(xiàn)報(bào)道了在實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模田間條件下用于防治特定有害生物或植物病原體的有效的微生物分離株的許多例子，但是僅僅有限數(shù)量已經(jīng)進(jìn)入了市場?？紤]到微生物生物防治劑是活有機(jī)體，不同于合成農(nóng)藥，很多因素可影響微生物生物防治劑的效果。在數(shù)種情況下，缺少持續(xù)的田間防效、高生產(chǎn)成本和產(chǎn)品變異性限制了它們的商業(yè)成功(Glare等人.2012.Trends in Biotech.30:250-258)。然而，限制微生物生物防治劑在農(nóng)業(yè)中的實(shí)際使用的最重要因素涉及如何配制這些生物防治微生物(Legget等人.2011.Can.J.Plant Pathol.33:101-107)。除了用于將微生物生物防治劑遞送至靶標(biāo)(即土壤或葉子)，制劑應(yīng)該也保證充足的保質(zhì)期，容易操作和對操作者的安全性，以及在田間施用后生物防治微生物的延長的生物活性(Fravel,D.R.2009.Annu.Rev.Phytopathol.43:337-359；Legget等人，如上文)。因此，不充分或不適當(dāng)?shù)闹苿┦窍拗莆⑸锷锓乐蝿┰谵r(nóng)業(yè)的使用和傳播的最常見的原因(Kaewchai等人.2009.Fungal Diversity 38:25-50)。最近，生物技術(shù)和應(yīng)用生物學(xué)的進(jìn)展，以及對食品產(chǎn)品的安全性的需求和環(huán)境可持續(xù)性已經(jīng)導(dǎo)致了有效的微生物生物防治劑的需求增加并且因此新的技術(shù)方法的發(fā)展(Leggett等人，如上文；Glare等人，如上文)。

如上文提及的，微生物生物防治劑主要以用于在農(nóng)業(yè)上防治有害生物、植物病原體和雜草的細(xì)菌或真菌為代表。除了細(xì)菌蘇云金桿菌外，其他成功的生物防治劑的例子是真菌木霉屬(Trichoderma spp.)和球孢白僵菌(Kaewchai等人，如上文；Glare等人，如上文)。這兩種絲狀真菌配制在多種不同的遞送系統(tǒng)中，所述遞送系統(tǒng)包括預(yù)膠化淀粉-粉、粗粒小麥粉顆粒和黏土、接種的谷物、可濕性粉劑等(Papavizas 1985.Annu.Rev.Phytopathol.23:23-54；Daigle and Cotty 1997.Biocontrol Sci.Technol.7:3-10；Harman等人.2011.Phytoparasitica.39:103-108)。

包括目前用于減少玉米、棉花和花生中的黃曲霉毒素污染的真菌黃曲霉的不產(chǎn)毒分離株的許多其他生物防治真菌，根據(jù)相似的技術(shù)和方法配制(Dorner,J.W.2004.Toxin Rev.23:425-450；Abbas等人.2006.Biocontrol Sci.Technol.16:437-449)。黃曲霉毒素是指主要由棲息真菌黃曲霉的土壤產(chǎn)生的一組致癌的真菌毒素。用于減少玉米中黃曲霉毒素污染的新穎和成功的方法是由使用黃曲霉的不產(chǎn)毒分離株競爭性排斥固有的產(chǎn)黃曲霉素分離株組成的生物防治策略。在美國南部進(jìn)行的研究證明了接種黃曲霉的不產(chǎn)毒分離株的谷粒的土壤施用在減少玉米、棉花和花生中的黃曲霉毒素污染上是成功的(Dorner,J.W，如上文；Abbas等人，如上文)。另外，由孢子包覆的大麥種子組成的生物防治制劑已經(jīng)在美國商業(yè)化。更多最近的研究已經(jīng)顯示由淀粉基生物塑料Mater-Bi^TM(MB)制成的顆?？捎行У卮婀攘?Accinelli等人.2009.Bioresource Technol.100:3997-4004；Accinelli等人.2012.Crop Protection32:30-35；Abbas等人.2012.美國專利號8,173,179)。類似于黃曲霉，各種其他絲狀真菌能夠在富淀粉基質(zhì)上生長(Accinelli和Abbas.2011.Toxin Rev.30:71-78)。因此，使用淀粉基生物塑料基質(zhì)以遞送真菌繁殖體的構(gòu)思已被延伸至生物防治真菌木霉屬(Abbas等人.2012.美國申請公開號20120213740；Accinelli等人.2014.Acta Hort.1015:79-88)。

最初的構(gòu)思由顆粒淀粉基生物塑料組成，該顆粒淀粉基生物塑料被配制為用作載體基質(zhì)以維持土傳(soil-born)生物防治真菌的生長和提供玉米田土壤接種的機(jī)制。生物塑料顆粒由通過化學(xué)交聯(lián)穩(wěn)定的淀粉基聚合物組成。生物塑料顆粒促進(jìn)真菌急劇生長和孢子形成，其導(dǎo)致了快速的土壤定殖。另外，生物塑料顆粒由可再生和可堆肥來源產(chǎn)生。

如上討論的，用于有效防治產(chǎn)毒素真菌和細(xì)菌以及昆蟲害蟲的各種生物防治方法和制劑在本領(lǐng)域是已知的。然而，仍然存在對生物防治劑的制劑的需求，所述生物防治劑對確保長期儲存后的生物防治劑的完整性和有效性，并且對促進(jìn)在田間和在溫室中施用生物防治劑的操作、安全性、時(shí)機(jī)和定位是有效的。對適合的、有效的制劑系統(tǒng)以遞送其他生物防治劑的需求也是明顯的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

我們已經(jīng)發(fā)明了可噴霧液體生物防治制劑，其包含嵌入由商業(yè)的生物塑料Mater-Bi^TM制備的生物塑料分散體的生物防治微生物。

根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目的是提供可噴霧微生物生物防治劑組合物，其包含嵌入分散的淀粉基生物塑料中的生物防治微生物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可噴霧微生物生物防治劑組合物，其包含嵌入生物塑料分散體中的曲霉屬(Aspergillus spp.)或其他相關(guān)物種的非產(chǎn)毒素菌株。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供可噴霧生物防治組合物，其包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散體中的非產(chǎn)毒素黃曲霉菌株NRRL 30797。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供能夠抑制立枯病的可噴霧生物防治組合物，其包含嵌入分散的Mater-Bi^TM生物塑料中的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌株。

本發(fā)明的另外的目的是提供能夠抑制立枯病的可噴霧生物防治組合物，其包含嵌入分散的Mater-Bi^TM生物塑料中的綠木霉(Trichoderma virens)菌株。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能夠防治歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)侵染的可噴霧生物防治組合物，其包含嵌入分散的Mater-Bi^TM生物塑料中的球孢白僵菌分離株或由蘇云金桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能夠防治美國牧草盲蝽(Lygus lineoraris)侵染的可噴霧生物防治組合物，其包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散體的球孢白僵菌分離株。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供防止和減少玉米的黃曲霉毒素污染的生物防治方法，其包括將嵌入有非產(chǎn)毒素黃曲霉菌株的分散的Mater-Bi^TM的可噴霧生物防治組合物噴霧于植物上以防治黃曲霉毒素。

本發(fā)明的另外的目的是提供抑制立枯病的生物防治方法，其包括將包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散體中的哈茨木霉的可噴霧生物防治組合物噴霧于土壤、植物或植物部分上。

本發(fā)明的另外的目的是提供抑制立枯病的生物防治方法，其包括將包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散體中的綠木霉的可噴霧生物防治組合物噴霧于土壤、植物或植物部分上。

本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供防治歐洲玉米螟侵染的生物防治方法，其包括將包含嵌入有球孢白僵菌分離株或由蘇云金桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素的Mater-Bi^TM生物塑料分散體的可噴霧生物防治組合物噴霧于玉米植物上。

本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供防治美國牧草盲蝽侵染的生物防治方法，其包括噴霧包含嵌入有球孢白僵菌分離株的Mater-Bi^TM生物塑料分散體的可噴霧生物防治組合物。

本發(fā)明的另外部分是試劑盒，包括可噴霧生物防治組合物，所述可噴霧生物防治組合物包含嵌入有微生物生物防治劑的分散的Mater-Bi^TM生物塑料。

本發(fā)明的其他目的和優(yōu)勢將通過下文的描述變得更加明顯。

附圖說明

本專利或申請文件含有至少一幅以顏色表現(xiàn)的附圖。帶有彩色附圖的該專利或?qū)＠暾埞_的副本可以在請求并支付需要的費(fèi)用的情況下由美國專利與商標(biāo)局提供。

圖1顯示了施用包含分散的淀粉基生物塑料的可噴霧生物防治制劑后的玉米葉的表面。

圖2A和圖2B描述了在2012年(圖2A)和2013年(圖2B)玉米生長季期間歐洲玉米螟蛾的捕獲量。

圖3A和圖3B顯示了在2012年(圖3A)和2013年(圖3B)玉米生長季期間記錄的氣象數(shù)據(jù)(最低/最高溫度和降雨量)。

圖4A至圖4D描述了2012年和2013年期間對照(CTR)、商業(yè)制劑(CF)和可噴霧生物塑料制劑(BF)對損傷頻率的影響：歐洲玉米螟對玉米植物的莖葉部分的攝食活動(dòng)導(dǎo)致的穿孔損傷(圖4A)和稈損傷(圖4B)以及對基于穿孔的列(圖4C)和稈腔(圖4D)的強(qiáng)度的作用。兩種制劑均含有球孢白僵菌的孢子。

圖5描述了在2012年和2013年期間對照(CTR)、商業(yè)制劑(CF)和可噴霧生物塑料制劑(BF)對抽穗百分比的作用，所述穗顯示由歐洲玉米螟的攝食活動(dòng)所導(dǎo)致的損傷。

圖6描述了在用包含嵌入有不同濃度的蘇云金桿菌庫斯塔克亞種(subsp.kurstaki)內(nèi)毒素的分散的淀粉基生物塑料的2.5％可噴霧生物塑料制劑噴霧的小室中溫育6小時(shí)之后的二齡歐洲玉米螟幼蟲的死亡率。

圖7顯示了與生物塑料顆粒和未處理的對照相比可噴霧分散生物塑料制劑對玉米中黃曲霉毒素污染的影響。

圖8A和圖8B顯示了在出苗的種子表面上噴霧含有哈茨木霉孢子的2.5％可噴霧分散淀粉基生物塑料制劑的影響。種子種植于侵染了兩種不同水平的導(dǎo)致30％立枯病(圖8A)和60％立枯病(圖8B)的立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)侵染的罐裝混合物中。

圖9顯示了配制為可噴霧分散淀粉基生物塑料的球孢白僵菌對美國牧草盲蝽的死亡率和感染率的影響。以不同量(1、0.75、0.5和0.25％w/v)的生物塑料制備并針對0.04％吐溫80和水對照評價(jià)生物塑料制劑(BF)。

圖10顯示了配制為1％可噴霧分散淀粉基生物塑料(BF)的球孢白僵菌在田間條件下對美國牧草盲蝽成蟲的死亡率和感染率的影響。將生物塑料制劑噴霧在種植了棉花的小塊土地上，并針對0.04％吐溫80和未處理對照評價(jià)。使用兩種球孢白僵菌菌株N18和GHA制備BF和吐溫80制劑。

具體實(shí)施方式

我們已經(jīng)證明了用于包含嵌入Mater-Bi^TM生物塑料分散體中的生物防治微生物的生物防治組合物的新型可噴霧生物塑料分散體制劑對在土壤內(nèi)或在葉子或其他植物部分上引入生物防治微生物的穩(wěn)定種群是有效的。

通過在水中均質(zhì)化不同類型的生物塑料基質(zhì)(例如顆粒、小球、粉末)，然后使其富含真菌結(jié)構(gòu)(如孢子、細(xì)胞、菌絲體等)、細(xì)菌細(xì)胞或其他生物活性化合物(例如內(nèi)毒素)獲得可噴霧制劑?？晒┻x擇地，可以通過固態(tài)發(fā)酵方法實(shí)現(xiàn)接種生物塑料粉末，其中生物塑料和例如真菌培養(yǎng)物一起在容器如可高壓滅菌的袋子中溫育3-7天，然后在爐中在45℃下干燥。將產(chǎn)生的干物質(zhì)研磨成分散于水中并且可噴霧的粉。另一程序包括將生物塑料基質(zhì)(例如小球和顆粒)穿過裝備有小尺寸(<1mm)噴嘴的擠出機(jī)。使用常規(guī)工業(yè)擠出機(jī)或臺式擠出機(jī)進(jìn)行擠出。將產(chǎn)生的粉末直接分散于含有微生物結(jié)構(gòu)(例如孢子、菌絲體、細(xì)胞)或生物活性化合物的水中。這種構(gòu)思的新穎性是它使制劑的塑料特性與生物防治有機(jī)體或生物活性物質(zhì)結(jié)合。

為了更好地維持生物防治微生物病原體的生長，也可以將特定的營養(yǎng)品添加至通過在田間施用前配制的方法制備的混合物中。在使用常規(guī)殺蟲劑噴霧機(jī)器進(jìn)行田間施用之前，將接種的生物塑料粉末懸浮于水中。也可將微生物/生物塑料混合物的水懸液噴霧于種子表面以保護(hù)幼苗對抗立枯病或其他病害。

因?yàn)榭蓢婌F制劑的塑料特性，一旦通過噴霧將生物防治制劑施用于植物葉片或其他植物器官(例如種子)，水迅速通過蒸發(fā)被去除并且含有選擇的微生物的生物塑料制劑的連續(xù)的膜或薄層或斑點(diǎn)保持長時(shí)間(高達(dá)2-4個(gè)月)粘附于葉表面，其中它用作生物防治微生物的生長基質(zhì)和起到對有害生物的持久防治的作用。因?yàn)檎掣接?即粘著于)葉片的膜的特性，不必將粘合劑添加至制劑中(圖1)。進(jìn)一步，生物塑料不僅是載體，它也是生物防治微生物的食物來源。生物塑料也減緩降解；因此，所述組合物是持久的并且可持續(xù)。

新的可噴霧生物塑料制劑構(gòu)思和技術(shù)提供了優(yōu)于顆粒生物塑料制劑和其他制劑的優(yōu)勢。優(yōu)勢包括施用的時(shí)機(jī)上更大的彈性，有效生物防治作用的延長以及精確地將生物防治微生物劑置于最接近靶標(biāo)有害生物(如產(chǎn)毒素真菌、昆蟲害蟲等)的位置。其他優(yōu)勢是使用噴霧制劑導(dǎo)致以需要的更低量的生物塑料和生物防治劑產(chǎn)生提高的效率，因?yàn)榻佑|是更好的。進(jìn)一步，可以與常規(guī)產(chǎn)品如合成殺蟲劑一起施用這種可噴霧制劑。

Mater-Bi^TM是由淀粉、聚己酸內(nèi)酯(ε-己內(nèi)酯)和少量的天然增塑劑組成的生物塑料產(chǎn)品(Bastioli,C.2001.Starch/Starke 53:351-355)。Mater-Bi^TM是完全生物可降解的，具有與纖維素相似的降解速率(Bastioli,C.1998.Polym.Degrad.Stabil.59:263-272)。除了高度有利的低環(huán)境影響譜，它的物理特性促進(jìn)了產(chǎn)品操作和田間施用。我們報(bào)道了證實(shí)新的用于包含生物塑料基質(zhì)、Mater-Bi^TM和生物防治微生物的生物防治組合物的可噴霧生物塑料制劑的可靠性的一系列研究。本發(fā)明的組合物涵蓋具有與Mater-Bi^TM生物塑料顆粒的關(guān)于Mater-Bi^TM生物塑料顆粒的生物塑料相同的識別特征的生物塑料分散體產(chǎn)品；然而，如上所述，制劑和施用的生物塑料分散體產(chǎn)品的特征是不同的。

新的用于包含生物塑料基質(zhì)、Mater-Bi^TM和生物防治微生物的生物防治組合物的可噴霧生物塑料制劑的有效性已經(jīng)在控制的溫室條件下被證明并在田間條件下被確認(rèn)。可噴霧生物塑料生物防治制劑顯示可適應(yīng)于真菌或細(xì)菌生物防治劑，也就是木霉菌和曲霉菌的非產(chǎn)毒素菌株以及球孢白僵菌和蘇云金桿菌的昆蟲病原分離株。

本發(fā)明的方法適用于任何針對人類消費(fèi)生長和/或被真菌毒素和/或病原或有害生物損傷的農(nóng)業(yè)商品，如對立枯病和根腐病易感的花生、玉米、棉花、樹堅(jiān)果、蔬菜植物和觀賞植物。

對于本發(fā)明的目的，真菌制劑或真菌農(nóng)業(yè)生物防治組合物是指微生物制劑，其中微生物包括、基本上由以下組成或由以下組成：分別能夠減少農(nóng)業(yè)作物中黃曲霉毒素污染和抑制立枯病的曲霉屬(Aspergillus)的非產(chǎn)毒素或非產(chǎn)黃曲霉毒素菌株和木霉屬(Trichoderma)菌株。真菌制劑可包含一種或多種曲霉屬的非產(chǎn)毒素菌株或非產(chǎn)黃曲霉毒素菌株。曲霉屬的非產(chǎn)毒素菌株包括不產(chǎn)生毒素黃曲霉毒素和環(huán)匹阿尼酸(CPA)的任何菌株。用于本發(fā)明的目的的農(nóng)業(yè)生物防治組合物包含在農(nóng)業(yè)上可接受的載體上的真菌的非產(chǎn)毒素一種菌株或多種菌株，所述載體可以是真菌可以貼附并且對真菌和用組合物處理的作物無害的任何載體。當(dāng)將真菌制劑和真菌農(nóng)業(yè)生物防治組合物在施用于生長農(nóng)業(yè)商品的土壤時(shí)具有生物競爭性的能力。

將曲霉屬的非產(chǎn)毒素菌株和非產(chǎn)黃曲霉毒素菌株以在農(nóng)業(yè)商品上減少毒素水平有效的量噴霧于植物上。本文所使用的“減少毒素水平”是指與在未根據(jù)本發(fā)明的方法處理的農(nóng)業(yè)商品中預(yù)期的相比毒素的量減少。如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的是，任何測量和比較毒素水平的精確方法可以用于這樣的比較。

本文所使用的“以有效的量(in amounts effective)、有效的量(an amount effective)或有效量(an effective amount)”是指施用的真菌制劑的量，其中施用的作用用于減少農(nóng)業(yè)商品的毒素污染。將噴霧的制劑以大約0.75至7.5千克(kg)每公頃(ha)的速率施用于土壤或植物部分。也可以含有添加的營養(yǎng)品的生物塑料制劑提供了促進(jìn)生物防治真菌的生長和孢子形成的受保護(hù)的環(huán)境。可以作為單菌株可噴霧組合物生長和施用菌株；或在微生物與生物塑料在液體培養(yǎng)基中生長時(shí)期以及干燥和粉碎過程以獲得細(xì)微分裂的均質(zhì)的微生物/生物塑料分散體混合物之后，可以約等比例地混合干產(chǎn)物以提供由曲霉屬的不同菌株制成的組合物。

實(shí)施例

現(xiàn)已對本發(fā)明進(jìn)行了一般的描述，通過參考某些具體實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，所述具體實(shí)施例僅包括在本文中以進(jìn)一步說明本發(fā)明并且不旨在限制如權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

生物防治真菌、細(xì)菌和毒素

用以下的生物防治微生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室和田間研究：球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ATCC 74040、球孢白僵菌N18、球孢白僵菌GHA、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)ATCC 20847、黃曲霉(Aspergillus flavus)NRRL 30797和由細(xì)菌蘇云金桿菌庫斯塔克亞種(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)HD1產(chǎn)生的殺蟲內(nèi)毒素。數(shù)種微生物可以與該可噴霧生物塑料制劑配制，包括褐色綠僵菌(Metarhizium brunneum)(Erler等人.2014.Pest Manag.Sci.70:496-501)、蘇云金桿菌擬步行甲亞種(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis)(Elek等人.1999.J.Econ.Entomol.92:1062-1071)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(Hu等人.2014.Biol.Control.70:54-64)、鉤狀木霉(Trichoderma hamatum)(Horst等人.2005.Plant Disease 89:1195-1200)、巨口莖點(diǎn)霉(Phoma macrostoma)(Bailey,K.L.2010.Canadian J.Plant Pathol.32:113-121)和疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)(Hoagland,等人.2007.Biocontrol Sci.Technol.17:721-731)。

實(shí)施例2

可噴霧生物塑料基制劑的制備

通過在瓦林搗碎機(jī)(Waring blender)中均質(zhì)化生物塑料小球、顆?；蚍勰┰谒?20％；w/v)的混合物制備可噴霧生物塑料制劑。搗碎15分鐘后，使生物塑料分散體通過1mm篩，稀釋于水中(0.25-2.5％或其他值)并在4℃下儲存直到使用。對特定的要求，例如添加生物活性化合物或物質(zhì)(即內(nèi)毒素)，可以通過在120℃下高壓滅菌15分鐘對制劑滅菌?？晒┻x擇地，也可以通過固態(tài)發(fā)酵過程實(shí)現(xiàn)接種生物塑料粉末，其中生物塑料和例如真菌培養(yǎng)物一起在容器如可高壓滅菌的袋子中溫育3-7天，然后在爐中在45℃下干燥。將產(chǎn)生的干物質(zhì)研磨成可溶于水中并且可噴霧的粉。通過使生物塑料小球或顆粒通過裝備了小尺寸(<1mm)噴嘴的擠出機(jī)獲得相同的結(jié)果。然后使生物塑料粉末與微生物繁殖體(例如孢子、細(xì)菌細(xì)胞)或生物活性物質(zhì)(例如內(nèi)毒素)混合。營養(yǎng)品或其他化學(xué)物質(zhì)(即抗生素、化學(xué)殺蟲劑等)的添加是任選的。

真菌分離株(例如黃曲霉、木霉屬、球孢白僵菌)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂上生長直至孢子形成，然后將許多的十個(gè)5mm瓊脂塞轉(zhuǎn)移至含有1kg預(yù)濕并高壓滅菌的小麥種子的可高壓滅菌袋中。將種子在連續(xù)的三天中在120℃下高壓滅菌30分鐘。用固定在鋼環(huán)上的棉塞覆蓋住袋子并將袋子在28℃下在垂直位置溫育10天。通過將全部物質(zhì)轉(zhuǎn)移至含有500mL無菌的0.2％吐溫20溶液的1L瓶內(nèi)以回收孢子。在200rpm下?lián)u動(dòng)30分鐘后，通過干酪包布過濾混合物回收孢子。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器調(diào)整孢子密度后，將等分部分添加至稀釋的生物塑料分散體中以獲得希望的效能(即10⁷個(gè)孢子/mL或更高)。制劑可以直接使用或在4℃下儲存。使用相似的方案以制備具有生物活性成分的可噴霧生物塑料分散體制劑。在下文報(bào)道了制備含有殺蟲內(nèi)毒素的可噴霧生物塑料制劑的程序的說明。生物塑料的百分比和最終制劑的效能(孢子、其他繁殖體或生物活性化合物的數(shù)目)可以根據(jù)需要修改。

實(shí)施例3

可噴霧生物塑料制劑在受控制的溫室條件下的施用

首先在受控制的溫室條件下評價(jià)該可噴霧生物塑料制劑用作用于微生物生物防治劑的實(shí)際和有效的制劑的可行性。玉米、棉花和大豆的植物生長于溫室中并且在實(shí)驗(yàn)的整個(gè)持續(xù)時(shí)間內(nèi)每天從土壤中獲得水分。使用手動(dòng)噴霧器將以1％生物塑料粉末(<1mm)和10⁷個(gè)孢子/mL的哈茨木霉ATCC 20847或黃曲霉NRRL 30797制備的液體分散的淀粉基生物塑料制劑均勻地噴霧在葉子上。對于每種處理，每個(gè)物種總共有7株植物均勻地噴霧35mL制劑。使用漂白劑消毒的單孔打孔器在噴霧前1小時(shí)以及在噴霧后2周和4周采集葉子樣品。對于每株植物，采集總計(jì)5個(gè)樣品，并將其轉(zhuǎn)移至無菌2mL管中，并直接用于使用PowerSoil DNA分離試劑盒(MoBio實(shí)驗(yàn)室，索拉納海灘，CA)進(jìn)行DNA分離。用NanoPothometer P 360(Implen股份有限公司，慕尼黑，德國)測定總的回收的DNA，然后根據(jù)Accinelli等人(2012.Crop Protection32:30-35)描述的步驟通過定量PCR定量靶DNA。簡單地說，在含有2μL DNA、12.5μL 2×TaqMan通用PCR預(yù)混液(Applied Biosystems有限公司，福斯特市，CA)和0.2μM引物對的每條引物的總體積為25μL的反應(yīng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了定量哈茨木霉和黃曲霉，引物對分別為Tf/uTr和omtB-F/omtB-R(Hagn等人.2007.J.Microbiol.Methods 69:86-92；Kim等人.2008.Int.J.Food Microbiol.29:49-60)。熱循環(huán)條件如下：在50℃下2分鐘，在95℃下10min，以及在95℃下15s和在60℃下1min的40個(gè)循環(huán)。使用ABI Prism 7700序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems有限公司)分析得到的樣品。在定量后，使擴(kuò)增的片段樣品經(jīng)過熔解曲線分析。通過相對于靶DNA的對數(shù)轉(zhuǎn)化量對循環(huán)閾值(Ct)作圖來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述靶DNA獲得自10倍稀釋的分離自哈茨木霉ATCC 20847或黃曲霉NRRL 30797的孢子分散體的DNA。

如預(yù)期，在噴霧含有哈茨木霉ATCC 20847或黃曲霉NRRL 30797的孢子的液體生物塑料分散體制劑后，來自這兩個(gè)物種的DNA可容易地檢測到。更具體地，在噴霧后2周和4周，從玉米葉子回收的哈茨木霉DNA的量在葉表面分別為0.8和1.3μg/mm²，黃曲霉DNA的量在葉表面分別為1.1和2.5μg/mm²。在棉花和大豆中觀察到更低的值，在這兩個(gè)物種之間沒有差異。在噴霧后2周和4周，這兩個(gè)物種的平均值，哈茨木霉分別為0.4和0.6μg/mm²，黃曲霉分別為0.5和0.8μg/mm²。僅有限數(shù)量(<5％分析的樣品)的三種未處理的植物物種，棉花、玉米和大豆的葉子樣品具有可檢測量的總DNA，而沒有黃曲霉或哈茨木霉DNA的痕跡。這些發(fā)現(xiàn)與如下的構(gòu)思是一致的：這種可噴霧生物塑料分散體制劑在將兩種微生物生物防治劑粘附于葉表面以及為它們的生長和孢子形成提供營養(yǎng)是有效的。

實(shí)施例4

田間實(shí)驗(yàn)：在玉米中歐洲玉米螟的生物防治

在位于鄰近意大利博洛尼亞的谷物生產(chǎn)農(nóng)場中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2012年4月末，在20m×30m的小塊土地種植常規(guī)的玉米雜交種(PR31K18；Pioneer Hi-Breed，Des Moines,IA)，并根據(jù)該地區(qū)的通常實(shí)踐來管理。每小塊土地由10m寬的緩沖區(qū)包圍。在玉米的V7生長期，用包含嵌入分散的淀粉基生物塑料中的生物防治分離株球孢白僵菌ATCC 74040的分生孢子的2.5％生物塑料可噴霧制劑或用商業(yè)制劑Naturalis(Intrachem Bio股份公司，意大利)噴霧小塊土地。Naturalis是含有7％活性成分(球孢白僵菌ATCC 74040的孢子)的液體制劑。兩種制劑均以400L/ha的速率使用背包噴霧器施用。根據(jù)完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。也包括未處理的對照。全部實(shí)驗(yàn)在2013年根據(jù)相同的實(shí)驗(yàn)程序來重復(fù)。

使用商業(yè)尼龍網(wǎng)籠罩誘捕器(Riff98責(zé)任有限公司，博洛尼亞，意大利)監(jiān)測歐洲玉米螟雌蟲的飛行。在誘捕器中放入購自Isagro S.p.A.(米蘭，意大利)的歐洲玉米螟生態(tài)型E的性信息素的誘餌進(jìn)行引誘。三個(gè)誘捕器放置在每塊玉米田的邊緣并從5月末至9月初每周啟用一次。根據(jù)制造商的說明放置誘餌。

在7月中旬(第一代幼蟲)和在收獲時(shí)(第二代幼蟲)按照Mencarelli等人(2013.Pest Manag.Sci.69:1085-1091)描述的步驟評價(jià)由歐洲玉米螟幼蟲對玉米植物的營養(yǎng)組分的攝食活動(dòng)導(dǎo)致的損傷。在由第一代幼蟲產(chǎn)生的損傷的情況下，從每小塊土地中隨機(jī)選取30株植物，并且評價(jià)典型的直排穿孔(rows of shot holes(RSH))的存在(1分)或不存在(0分)。損傷嚴(yán)重程度依據(jù)對每株選取的植物的視覺上評分的RSH的數(shù)量來評價(jià)，并且在0-5的范圍分級(0：無RSH；1：1-5RSH；2：6-10RSH；3：11-20RSH；4：21-35；5：>35RSH)。在收獲時(shí)采用相同的方法以評價(jià)幼蟲對導(dǎo)致稈腔(SC)形成的掏空稈引起的損傷。對于SC，使用以下范圍：0：沒有SC；1：1-3SC；2：3-5SC；3：5-7SC；4：7-9SC；5>9SC。在評價(jià)SC后，移去穗并且記錄歐洲玉米螟損傷的穗的頻率。

在收獲時(shí)，將來自所有植物的穗去殼，在50℃下干燥72小時(shí)，并且記錄產(chǎn)量。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。使用Tukey HSD檢驗(yàn)比較平均值，并且在P>0.05水平檢測到顯著性差異。數(shù)據(jù)表示為平均值±STD。

歐洲玉米螟蛾的捕獲量在圖2A和2B中顯示。如在之前的調(diào)查中所觀察到的，歐洲玉米螟顯示了具有兩個(gè)飛行峰的二化性的物候?qū)W，第一個(gè)飛行峰在6月下旬，第二個(gè)飛行峰在8月下旬。每周捕獲的數(shù)目表明在2012年(圖2A)歐洲玉米螟的侵染高于2013年(圖2B)。這很可能是由于，與2013年相比(圖3B)，2012年記錄的夏季極端炎熱和干燥(圖3A)?；谟衩椎倪@種關(guān)鍵害蟲的生命周期，在卵孵化之后，早齡幼蟲首先以生長中的穗和輪生體組織為食。這種攝食活動(dòng)導(dǎo)致穿過葉子的特征性RSH的形成。在2012年和2013年，顯示RSH損傷的植物的頻率分別為86％和49％(圖4A和圖4B)。與損傷的植物的頻率相似，損傷強(qiáng)度在2012年高于2013年(圖4C和圖4D)。更具體地，損傷強(qiáng)度等級在2012年和2013年分別為3.4和2.1(圖4C和圖4D)。

在第一實(shí)驗(yàn)?zāi)?，施用含有球孢白僵菌ATCC 74040的孢子的商業(yè)制劑導(dǎo)致?lián)p傷植物的頻率降低22％，損傷等級為2.9(圖4C)。在2013年，降低為12％，損傷等級為1.9(圖4C)。在接受了可噴霧生物塑料基制劑的小塊土地中，顯示RSH損傷的植物的百分比進(jìn)一步顯著降低至更低的百分比。更具體地，在用生物塑料噴霧過的植物中由第一代幼蟲引起的損傷的頻率和強(qiáng)度分別在2012年是39％和1.6，在2013年是21％和0.9(圖4A和圖4C)。

從第三幼蟲階段開始，幼蟲鉆入稈內(nèi)產(chǎn)生稈腔(SC)。在這兩年中，顯示SC損傷的植物的百分比相對于RHS損傷的植物更低(圖4B)。這解釋為考慮到已知的早期階段歐洲玉米螟幼蟲的高死亡率。然而，如對由幼蟲對葉子的攝食導(dǎo)致的損傷所觀察到的，SC損傷的頻率和強(qiáng)度在2012年高于2013年?？蓢婌F生物塑料制劑相對于商業(yè)制劑在減少對稈的損傷上顯著更有效。更具體地，SC損傷的頻率和強(qiáng)度分別在2012年減少了44％和48％，在2013年減少了48％和59。商業(yè)制劑也減少了SC損傷，但是量級顯著低于可噴霧生物塑料(圖4B和圖4D)。

在這兩年中，高達(dá)接近一半的穗顯示可見的歐洲玉米螟損傷。使用商業(yè)制劑損傷減少高達(dá)8％，而使用可噴霧生物塑料損傷減少高達(dá)54％(圖5)。最重要地，相對于未處理的對照和商業(yè)制劑，可噴霧生物塑料的施用導(dǎo)致了更高的玉米產(chǎn)量。更準(zhǔn)確地，在2012年，接受了商業(yè)制劑和生物塑料制劑的小塊土地的平均玉米產(chǎn)量分別高于未處理的對照6％和35％。在2013年，這些值分別為8％和43％。因此，嵌入有生物防治劑球孢白僵菌的可噴霧生物塑料分散體比商業(yè)制劑顯著更有效。

實(shí)施例5

歐洲玉米螟生物測定

通過昆蟲生物測定評價(jià)這種可噴霧生物塑料制劑待被靶標(biāo)昆蟲害蟲(即歐洲玉米螟，ECB；Ostrinia nubilalis)攝食的潛能。對于該生物測定研究，如上描述制備2.5％可噴霧分散生物塑料制劑，除了在生物塑料分散體內(nèi)真菌孢子替換為蘇云金桿菌庫斯塔克亞種HD1株的內(nèi)毒素。殺蟲內(nèi)毒素獲得自如Accinelli等人(2004.Agric.Ecosys.Environ.103:497-507)描述的商業(yè)制劑。簡單地說，首先將50g Dipel 2X(Sipcam股份公司，佩羅，意大利)用1M氯化鈉洗滌，然后用去離子水洗滌。每種洗滌重復(fù)兩次。洗滌后的沉淀物用含有0.5M二硫蘇糖醇和1M硫氰酸鉀的MOPS緩沖液(0.1M 3-N-嗎啉丙磺酸，pH 7.8)萃取，然后用去離子水透析8小時(shí)，并用硫酸銨沉淀。將沉淀物在27,000g下離心并在去離子水中重懸浮。在用勞里法(Lowry method)定量內(nèi)毒素之后計(jì)算用于制備可噴霧生物塑料制劑的儲備液的濃度。

根據(jù)Accinelli等人(2004，如上文)的描述進(jìn)行昆蟲的生物測定。簡單地說，將10mL昆蟲食物添加至50小室生物測定托盤的每個(gè)小室中，并且將四齡歐洲玉米螟幼蟲轉(zhuǎn)移至小室內(nèi)(1幼蟲/室)。用穿孔的塑料蓋子封閉小室，并且將室放置在27℃下的氣候室，并且光周期為16:8(光照：黑暗)。在溫育3天后，將幼蟲轉(zhuǎn)移至小室內(nèi)，所述小室用由增加濃度的內(nèi)毒素(0.1、1和10μg/mL)制備的2.5％可噴霧分散的生物塑料制劑噴霧過。6小時(shí)后，將幼蟲重新放置于充滿特定的食物的小室內(nèi)。每種濃度總共使用30條幼蟲。在14天后對昆蟲死亡率評分。

歐洲玉米螟的生物測定結(jié)果顯示于圖6中。轉(zhuǎn)移至僅含有干的用增加濃度的內(nèi)毒素制備的生物塑料的小室內(nèi)6小時(shí)的幼蟲的死亡率增加，清楚地證明了這種制劑被歐洲玉米螟幼蟲攝食的能力?；旧?，本發(fā)明背后的構(gòu)思是在水蒸發(fā)后，接種的生物塑料制劑的薄層保持粘附在葉子表面(圖1)，其中它用作生物防治微生物的生長基質(zhì)而且還具有被靶標(biāo)昆蟲害蟲攝食的潛能。預(yù)期該后者的方面增加抗靶標(biāo)害蟲的活性。

實(shí)施例6

在玉米中黃曲霉的生物防治

2012年在上文提及的農(nóng)場進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且遵循相同的實(shí)驗(yàn)方案和程序。在玉米的V7生長期(其中植物在七葉期(seven leaf stage))，用包含嵌入生物塑料分散體中的生物防治分離株黃曲霉NRRL 30797的孢子(10⁷個(gè)孢子/mL)的1％生物塑料液體制劑噴霧小塊土地，并且使用背包噴霧器以400L/ha的速率施用。與歐洲玉米螟生物防治實(shí)驗(yàn)一樣，根據(jù)完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)一式三份進(jìn)行當(dāng)前實(shí)驗(yàn)。在收獲時(shí)，從每小塊土地上隨機(jī)選擇60個(gè)玉米穗，去殼并在50℃下干燥72小時(shí)，并研磨(<1mm)用于化學(xué)分析。用甲醇/水(70:30)萃取之后，通過HPLC根據(jù)Accinelli等人(2012，如上文)描述的程序進(jìn)行化學(xué)分析。對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。使用Tukey’s HSD檢驗(yàn)比較平均值，并且在P>0.05水平檢測到顯著性差異。數(shù)據(jù)表示為平均值±STD。

在2012年玉米生長季期間記錄的炎熱和干燥條件也有利于玉米的黃曲霉侵染(圖3A)。在未處理的對照小塊土地，平均黃曲霉毒素污染為140ng/kg。可噴霧生物塑料制劑的施用導(dǎo)致黃曲霉毒素水平減少大約97％(圖7)。這些發(fā)現(xiàn)顯示這種可噴霧制劑在減少玉米中的黃曲霉毒素污染中是高效的。

實(shí)施例7

種子立枯病的生物防治

用于在植物葉子上噴霧微生物生物防治劑的相同構(gòu)思被擴(kuò)展以保護(hù)種子免受立枯病侵害。更具體地，可噴霧生物塑料基制劑用于防治由真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)導(dǎo)致的番茄幼苗的立枯病。用包含嵌如分散的淀粉基生物塑料中的生物防治真菌哈茨木霉ATCC 20847(最終效能10⁸個(gè)孢子/mL)的孢子的2.5％生物塑料制劑噴霧番茄種子(圣女果(Lycopersicum escultentus)‘ACE55VF’；Blumen責(zé)任有限公司，米蘭，意大利)。將種子轉(zhuǎn)移入臺式回轉(zhuǎn)篩(benchtop rotative siever)中并使用手動(dòng)噴霧器噴霧。將處理的種子干燥1小時(shí)，然后直接種植于充滿如下制備的被侵染的栽種混合物(potting mix)的幼苗托盤中。充足質(zhì)量的栽種混合物Terraplant 2(Torf-un Humuswenk Uchte股份有限公司，烏特，德國)用作為病原體侵染的粉末狀谷物供給的立枯絲核菌NRRL 22805侵染。簡單地說，將來自真菌病原體在PDA上的活性生長培養(yǎng)物的4個(gè)3mm瓊脂塞置于含有在連續(xù)的日子中高壓滅菌3次的大麥谷物(25g谷物和18mL水)的250mL瓶中。將瓶在黑暗中在25℃下溫育。在溫育2周后，使谷物成為粉狀，穿過2mm篩并合摻入栽種混合物中。在徹底混合后，通過在25℃下溫育以穩(wěn)定栽種混合物。將絲核菌屬感染的生長基質(zhì)與未感染的栽種混合物混合以達(dá)到希望的疾病發(fā)生率。在托盤小室(直徑5cm，深度5cm)種植噴霧或未噴霧的番茄種子，并在生長室中在25℃下溫育，補(bǔ)充12h的光照。單個(gè)處理種植總計(jì)300顆種子。包含充滿未感染的栽種混合物的托盤作為對照。實(shí)驗(yàn)以完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)一式三份布置，并且監(jiān)測植物密度(plant stand)18天。

可噴霧生物塑料制劑的施用對減少番茄幼苗的立枯病是有效的。更具體地，當(dāng)將噴霧的種子種植于病原侵染水平相當(dāng)于30％立枯病的栽種混合物中時(shí)，相對于未噴霧的種子，萌發(fā)前立枯病減少高達(dá)85％(圖8A)。當(dāng)種植于甚至更嚴(yán)重水平的侵染的栽種混合物中時(shí)，種子仍然受到保護(hù)。如圖8B所示，當(dāng)將番茄種子種植于人為侵染立枯絲核菌而達(dá)到60％立枯病的栽種混合物中時(shí)，未萌發(fā)種子的發(fā)生率為大約10％。這些發(fā)現(xiàn)顯示，通過在種子周圍形成黏性包膜，這種可噴霧制劑保護(hù)番茄幼苗免于遭受由立枯絲核菌引起的立枯病。

實(shí)施例8

在棉花中的美國牧草盲蝽的生物防治

根據(jù)第[0034]和[0035]段中描述的程序制備具有增加的百分比的生物塑料的可噴霧生物塑料制劑并且評價(jià)兩種生物防治分離株球孢白僵菌NI8和球孢白僵菌GHA的孢子的遞送，最終目的是在棉花中防治美國牧草盲蝽(TPB；Lygus lineoraris)侵染。

進(jìn)行初步的昆蟲生物測定實(shí)驗(yàn)以評價(jià)含有增加量的生物塑料粉末(0.25、0.50、0.75和1％w/v)和球孢白僵菌NI8的孢子(10⁹個(gè)孢子/mL)的分散的生物塑料制劑防治美國牧草盲蝽的可行性。分散的生物塑料制劑與0.04％吐溫80和水的溶液對比。生物測定根據(jù)Portilla等人(2011.J.Insect Sci.11:1-10)描述的程序進(jìn)行。簡單地說，含有0.5g孢子的6mL孢子分散體的等分部分稀釋于0.04％吐溫80水溶液或可噴霧分散生物塑料中以達(dá)到6×10⁹個(gè)孢子/mL的濃度。對每種處理(吐溫80或分散的生物塑料制劑)，評價(jià)90只昆蟲。使用增壓的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備噴霧制劑。在噴霧后，將TPB成蟲轉(zhuǎn)移至昆蟲觀察籠(BioQuip 1466A)中以使它們干燥。被噴霧的昆蟲單獨(dú)地敲入充滿人工固體食物的單個(gè)杯中。每日檢測成蟲的死亡率。死亡的昆蟲保持在相同的杯中并每日檢查真菌的孢子形成。更具體地，將成蟲和若蟲保持在27℃、相對濕度65％，并12:12小時(shí)(L:D)光周期的環(huán)境室中10天。

在噴霧3天后，沒有在接受生物塑料分散體處理的TPB和接受吐溫80處理的TPB之間觀察到TPB的死亡率的差異。如預(yù)期的，在用水噴霧后觀察到低死亡率(<0.5％)。施用球孢白僵菌5天后，1％分散生物塑料制劑和0.04％吐溫80的TPB死亡率分別為80.0和75.5。施用以0.75、0.5和0.25％生物塑料制備的生物塑料制劑導(dǎo)致的死亡率分別為46.6、54.4、40.0。在對TPB成蟲噴霧生物塑料或吐溫80后10天，觀察到更高的死亡率。更具體地，死亡率為97.7％，在1％生物塑料和0.04％吐溫80之間沒有差異。以0.75、0.5和0.25％生物塑料，死亡率分別為83.3、84.4和66.6％(圖9)。分散的生物塑料制劑也促進(jìn)真菌孢子形成。在噴霧10天后，孢子形成為大約95％，在1％生物塑料和吐溫80之間沒有差異。以0.75、0.5和0.25％生物塑料，孢子形成分別為76.6、77.7和63.3。

還在由50塊小塊土地組成的大塊田地(270m²；18m長，15m寬)研究中評價(jià)可噴霧生物塑料基生物防治制劑。在該研究中，在2013年7月將含有分離株球孢白僵菌N18或球孢白僵菌GHA的1％生物塑料制劑噴霧于棉花植物上。使用安裝在約翰迪爾拖拉機(jī)上的增壓的多噴霧器(multi-sprayer)(Cone-Tip Quick TXVS12)以90psi的壓力和8km/hr的速度進(jìn)行處理，體積為每公頃30L。處理后5天，噴霧了1％生物塑料/NI8和0.04％吐溫80/NI8的小塊土地中TPB死亡率分別為36和44％。GHA菌株在防治棉花中TPB侵染上不太有效。更具體地，施用1％生物塑料/GHA和0.04％吐溫80/GHA導(dǎo)致TPB的死亡率分別為22和27％。在未處理的對照小塊土地中觀察到的死亡率為14％((圖10)。

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為了說明和描述本發(fā)明的目的，提供了前述的說明和本發(fā)明的某些代表性的實(shí)施方式和細(xì)節(jié)。這并不意圖詳盡或?qū)⒈景l(fā)明局限于公開的確切形式。對于本領(lǐng)域從業(yè)者而言明顯的是可以在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下做出修改和變化。