對相關申請的交叉引用

本申請要求提交于2014年11月12日的美國臨時申請?zhí)?2/078,857的優(yōu)先權，該美國臨時申請通過引用以其整體并入本文。

發(fā)明領域

該技術領域涉及遺傳修飾的動物。

發(fā)明背景

1型神經纖維瘤病(nf1)是最流行的遺傳病癥之一，在每3,000名活產嬰兒中發(fā)生一例，僅在美國就有超過100,000名受影響的人。nf1由神經纖維瘤蛋白1(neurofibromin1,nf1)基因中的體細胞突變引起，其中50％的病例是遺傳的，并且50％的情況是新的突變。nf1是一種令人虛弱的疾病，因為患者通常顯示出骨骼異常、脊柱側凸、學習失能、高血壓和癲癇[1]。nf1患者也有可能在其身體的整個周圍神經中發(fā)展稱為神經纖維瘤的良性腫瘤。盡管神經纖維瘤是良性的，但它們可以引起顯著的疼痛和移動性(mobility)問題。此外，繼發(fā)性遺傳變化引起在10％的患者中神經纖維瘤的惡性轉化，導致惡性外周神經鞘瘤(mpnsts)的發(fā)展[2]。mpnst是高度攻擊性和致命的肉瘤，并且目前，mpnst的唯一治療方案是完全手術切除或高劑量非特異性化療[2]。由與神經緊密關聯(lián)，手術切除經常不可行，并且化療經常失敗。雖然在為這些腫瘤開發(fā)靶向治療方面已經付出了相當大的努力，但沒有一個在臨床上顯示出顯著的功效，并且mpnst仍然是nf1患者死亡的主要原因。除了多種其他腫瘤類型之外，nf1患者還具有發(fā)展為視神經膠質瘤、星形細胞瘤和幼年型骨髓單核細胞白血病的較高風險[3]。

附圖簡述

圖1：人和豬nf1基因和蛋白的比對。nf1在人和豬之間是高度保守的。豬外顯子42對應于人外顯子40，并且該區(qū)域的氨基酸序列也是高度保守的。氨基酸精氨酸1947(r1947)經常在人患者中突變，并且該氨基酸在豬中是保守的。

圖2：talen設計以在nf1豬基因中創(chuàng)建r1947x突變。豬nf1外顯子42位于頂部。放大了外顯子42以顯示3個talen對的talen結合位點，以及精氨酸1947(r1947)氨基酸。

圖3a-d：利用talen和同源性依賴性修復(hdr)來誘導豬nf1基因中的r1947x突變。a.nf1基因外顯子42的野生型(wt)序列顯示在頂部。設計用于該基因座的talen(ssnf142.3talen)，并且對talen結合位點加下劃線(紅色)。設計了90堿基對的hdr寡聚物以誘導r1947x突變(大寫字母是從野生型序列改變的堿基對)和用于rflp分析的新型限制酶位點(紅色，加下劃線)。下面顯示了所得的r1947x等位基因。b.在30攝氏度溫育3天后，細胞群的rflp分析顯示了所有三個talen都能夠以不同的速率誘導hdr，其中ssnf142.1是最有活性的(54.2％等位遺傳修飾)，ssnf142.2是中等活性的(45.1％等位遺傳修飾)以及ssnf142.3是所述3個talen中最低活性的(27.2％等位遺傳修飾)。c.對24個克隆的rflp分析顯示了在365堿基對處的未切割(wt)條帶和對應于位于191和174堿基對處的消化的hdr等位基因的條帶。*指定了雜合克隆。d.對于兩個克隆的測序分析顯示了野生型等位基因和hdr等位基因兩者。

圖4a-c：talen活性與分離對于腫瘤抑制基因為雜合的克隆的能力相關。a.圖形顯示了根據(jù)rflp為野生型、雜合，或純合克隆的百分比，所述克隆分離自ssnf142.2處理的細胞，并與預測的比率比較。為了預測純合克隆的百分比：(第3天rflp活性)∧2。為了預測雜合克隆的百分比：(第3天rflp活性x2)(1-第3天rflp活性)。對于具有比ssnf142.3更高的活性的ssnf142.2，觀察到多得多的基因修飾，偏向于純合ko克隆。b.對于ssnf142.3(具有較少活性的talen對)，如預期的，回收到較少的純合ko克隆，并且野生型、雜合和純合克隆的比率更接近于所預測的比率。c.圖形顯示了ssnf142.2和ssnf142.3talen的不同活性。選擇通過rflp的10個雜合克隆用于測序分析。具有比ssnf142.3高得多的talen活性的ssnf142.2導致90％的在野生型等位基因中具有插入/缺失(indel)的測序克隆，而來自ssnf142.3talen處理的細胞的僅30％克隆顯示出插入/缺失。

圖5：用于在豬中順式修飾nf1和tp53的talen的設計。nf1和tp53位于豬的染色體12(人的染色體17)上極其接近。設計talen以創(chuàng)建nf1中的r1947x突變以及tp53中的y155x突變。相對于期望突變的talen結合位點如上所示。

圖6a-b：利用talen和同源性依賴性修復(hdr)來誘導豬nf1基因中的r1947x突變以及豬tp53基因中的y155x突變。a.當共轉染入原代豬成纖維細胞時，通過rflp分析，ssnf142.3talen導致25.5％的等位遺傳修飾，以及通過細胞分析，sstp53e6talens導致11.8％的切割。b.針對24個克隆的rflp分析顯示了未切割的(野生型)條帶和對應于針對nf1和tp53兩者的消化的hdr等位基因的條帶。*指定了雜合克隆。*指定了對nf1和tp53兩者是雜合的克隆。rflp分析顯示出：通過rflp，8.9％的克隆對nf1是雜合的，并且通過rflp，3.7％的克隆對nf1和tp53兩者是雜合的，但是所有被測序的克隆都包含nf1或tp53或兩者的野生型等位基因上的插入/缺失。

圖7：用于高限定熔解分析(highdefinitionmeltanalysis)的熔解曲線鑒定tp53的雜合克隆。

圖8a-c：nf1雜合豬表明增加的ras活性。a，表顯示了長白農場豬(landracefarmpig)和ossabaw迷你豬scnt實驗的結果。b，野生型成纖維細胞(左)和nf1r1947x/+纖維細胞(右)的western印跡。染色顯示了突變體細胞中增加的ras活性。在0、5和15分鐘收集細胞裂解物。c.相對于總ras(頂部)或gapdh(底部)標準化的ras-gtp。在兩個分析中，相較于nf1野生型細胞，nf1r1947x/+(nf1het)細胞顯示出增加的ras活性。

圖9a-d：nf1雜合豬具有nf1相關的表型。所有出生的nf1r1947x/+ossabaw迷你豬顯示出不同程度的色素沉著不足。所有的仔豬在它們的臉上顯示棕褐色/棕色色素沉著不足(9a,頂部)并且一頭仔豬在其背部顯示白色色素沉著不足(9a,底部)。9b.通過大體觀察(grossobservation)(9b,左)和x射線成像(9b,右)，nf1r1947x/+ossabaw迷你豬中的兩頭在尸檢時出現(xiàn)脊柱彎曲和潛在的脊柱側凸癥狀。約有20％的nf1患者記載了脊柱側凸。9c.表鑒定了在許多nf1r1947x/+ossabaw迷你豬中的一頭中觀察到存在多個牛奶咖啡斑(caféaulaitspot)。9d,1-4是在9c中鑒定的斑的照片。

發(fā)明詳述

雖然已經開發(fā)出數(shù)種小鼠模型來研究nf1，但是小鼠模型在其模擬(model)人類疾病的能力方面具有局限性，并且對于新型成像技術和手術干預的開發(fā)而言是低劣的模型。本文提供了建立nf1豬模型的材料和方法，所述模型可用于更好地理解nf1病因、疾病發(fā)展與進展、新型成像和手術技術的應用、以及臨床前藥物測試。此外，所述模型受益于tp53基因的敲除，并呈現(xiàn)了其實施方案。

在該研究過程中，本發(fā)明人最初不能產生nf1和/或tp53敲除上雜合的細胞。在該研究過程中，開發(fā)了以下行為(action)的理論；然而，本發(fā)明不限于該理論化機制?？梢岳斫?，問題在于nf1和tp53是腫瘤抑制基因。在細胞中主要研究了產生遺傳修飾的方法并涉及修飾細胞并在測試前允許它們復制。所述細胞是家畜細胞，其用于通過克隆來制備動物。在此背景下，重要的是創(chuàng)建在原代細胞以及細胞的最少復制和/或傳代的情況下有效的方法，這是進行有效遺傳修飾的另一個挑戰(zhàn)。由于敲除了腫瘤抑制基因，因此腫瘤抑制基因敲除上純合的細胞相對于雜合或野生型細胞是有利的。

基于這種認識，嘗試了產生修飾的幾種不同方法。還有其他的限制，因為目的之一在于制備在f1和tp53兩者的順式敲除上雜合的家畜細胞。這些方法之一是用靶向內切核酸酶切割靶腫瘤抑制基因，以及為所述基因提供兩個同源性依賴性修復(hdr)模板。hdr模板中的一個具有旨在創(chuàng)建敲除的改變。但是第二個hdr模板具有野生型基因。根據(jù)以下實例，該方法是有效的。

另一種方法也使用兩個模板，其中所述模板中的一個非常接近于與野生型基因具有序列同一性。但是，產生了微小的改變提供容易檢測幾乎野生型(almost-wildtype)hdr模板的存在。產生了沉默突變以提供新型限制酶位點。并且修飾了敲除等位基因以具有其自身特有的限制位點。然后可以測試細胞以確定兩種變化是否存在。

腫瘤抑制基因

工作例描述了兩種不同腫瘤抑制基因的修飾。因此，腫瘤抑制基因通?？梢孕揎?，例如：

tp53腫瘤蛋白p53

pten磷酸化酶和tensin同源物

rbi(prb或rb1)成視網膜細胞瘤1

smad4smad家族成員4

bubib(bub1)出芽不受恩唑咪唑抑制(buddinguninhibitedbybenzimidazoles)

brca1乳腺癌1，早發(fā)

brca2乳腺癌2，早發(fā)

st14致瘤性抑制蛋白(suppressor)14

pvhlvonhippel-lindau腫瘤抑制蛋白

cd95fas受體

st5致瘤性抑制蛋白5

ypel3yippee樣3

st7致瘤性抑制蛋白7

nf2神經纖維瘤蛋白2(merlin)

tsc1結節(jié)性硬化癥1

tsc2結節(jié)性硬化癥2

cdkn2a細胞周期蛋白依賴性激酶抑制子2a

ptchpatched

如其他地方所述，修飾可以是破壞(disruption)，敲除和抑制、具有插入/缺失(indel)、移碼、天然或野生型等位基因等。

經遺傳修飾的動物

可以制備在染色體修飾上單等位或雙等位的動物。例如，本發(fā)明人已經使用了同源性依賴性重組(hdr)方法來對動物的染色體做出改變，或向其插入外源性基因。在本文的其它地方討論了如talens和重組酶融合蛋白的工具，以及常規(guī)方法。本發(fā)明人的實驗室先前已經證明了當從修飾細胞的多基因群體克隆時超常的克隆效率，并倡導這種方法來避免通過分離集落的體細胞核轉移(scnt)的克隆效率的變化(carlson等，2011)。有些人使用遺傳修飾和scnt的連續(xù)周期減少了這一負擔(kuroiwa等，2004)，然而，這既是在技術上具有挑戰(zhàn)性的又是成本過高的。在scnt之前常規(guī)地生成雙等位ko細胞的能力在大型動物遺傳工程化中是顯著的進步。在永生化細胞系中，使用其它方法例如zfn和稀釋克隆已經完成了雙等位敲除(liu等，2010)。最近另一個小組證明了使用商業(yè)zfn試劑的豬ggta1的雙等位敲除(hauschild等，2011)，其中可以通過針對ggta1-依賴的表面表位缺乏的facs來富集雙等位裸細胞(bi-allelicnullcell)。雖然這些研究證明了某些有用的概念，它們沒有顯示動物或家畜可以被修飾，因為簡單的克隆稀釋對于原代成纖維細胞隔離群(isolate)通常不可行(成纖維細胞以低密度不良生長)，且對于大多數(shù)基因，裸細胞(nullcell)的生物學富集不可用。

實驗結果表明，靶向性核酸酶系統(tǒng)在意圖的關聯(lián)位點處有效切割dsdna。靶向性核酸酶系統(tǒng)包括基序，其通過蛋白與dna結合或者通過核酸與dna結合而結合至關聯(lián)dna。本文報道的效率是顯著的。本發(fā)明人在其他地方公開了進一步提高這些效率的其他技術。

本發(fā)明的實施方案包括制備經遺傳修飾的動物的方法，所述方法包括將胚胎或細胞暴露于編碼靶向性核酸酶(例如，大范圍核酸酶(meganuclease)，鋅指，talens，引導rna，重組酶融合分子)的載體或mrna，其中所述靶向性核酸酶特異性結合所述胚胎或細胞中的靶染色體位點，創(chuàng)建對細胞染色體的改變，在代孕母體(surrogatemother)中克隆所述細胞或將所述胚胎移植到代孕母體中，由此所述代孕母體孕育在無報告基因的情況下并僅在靶定的染色體位點處遺傳修飾的動物。靶定的位點可以是本文所列出的，例如，本文所述的多種基因。本文詳細描述了模板驅使的基因漸滲(introgression)方法。本發(fā)明的實施方案包括模板驅使的基因漸滲，例如，通過hdr模板，來修飾非人動物，或任意物種的細胞的腫瘤抑制基因。

這一方法以及本文的一般方法涉及細胞和動物?？梢詮南陆M選擇這些：非人脊椎動物，非人靈長類動物，牛，馬，豬，綿羊，雞，鳥，兔，山羊，狗，貓，實驗室動物，和魚類。術語家畜表示馴養(yǎng)的動物，其作為食物或生物材料商品飼養(yǎng)。術語偶蹄動物表示偶蹄目(artiodactyla)的有蹄哺乳動物，其包括牛，鹿，駱駝，河馬，綿羊和山羊，其每只腳具有偶數(shù)腳趾，通常為兩個或有時為四個。

同源性指導的修復(hdr)

同源性指導的修復(hdr)是細胞中修復ssdna和雙鏈dna(dsdna)損傷的一種機制。當存在有與損傷位點具有顯著同源性的序列的hdr模板時，細胞可以使用這一修復機制。特異性結合，該術語在生物領域中通常使用時指代分子以與非靶組織相比相對較高的親和力結合靶物，并且通常涉及多個非共價相互作用，如靜電相互作用、范德華相互作用、氫鍵鍵合等等。特異性雜交是具有互補序列的核酸之間的特異性結合的形式。蛋白也可以特異性結合dna，例如，在talen或crispr/cas9系統(tǒng)中或通過gal4基序。等位基因的漸滲指代通過模板引導方法相對于內源性等位基因將外源性等位基因復制的過程。在一些情況下，內源性等位基因實際上可以被切出并由外源性核酸等位基因代替，但現(xiàn)在的理論是這一過程是復制機制。由于等位基因是基因對，它們之間具有顯著的同源性。等位基因可以是編碼蛋白的基因，或其可以具有其它功能，如編碼生物活性rna鏈，或提供位點以接受調節(jié)蛋白或rna。

hdr模板是包含漸滲的等位基因的核酸。模板可以是dsdna或單鏈dna(ssdna)。ssdna模板優(yōu)選的是從約20到約5000個殘基，雖然也可以使用其它長度。技術人員將立即理解，明確陳述的范圍內的所有范圍和數(shù)值都是涵蓋的；例如，從500到1500個殘基，從20到100個殘基，等等。模板可以進一步包含側翼序列，其提供與要取代的內源性等位基因或dna鄰近的dna的同源性。模板還可以包括結合到靶向性核酸酶系統(tǒng)的序列，并因此是系統(tǒng)的dna結合成員的關聯(lián)結合位點。術語關聯(lián)指代通常相互作用的兩種生物分子，例如受體及其配體。在hdr過程的語境中，生物分子中的一個可以設計為帶有結合意圖(即關聯(lián))dna位點或蛋白位點的序列。

靶向核酸酶系統(tǒng)

基因組編輯工具(如轉錄激活物樣效應器核酸酶(talen))和鋅指核酸酶(zfn)已經影響了許多物種中的生物技術、基因治療，以及功能基因組研究領域。最近，rna引導的內切核酸酶(rgen)通過互補rna分子引導到其靶位點。cas9/crispr系統(tǒng)是regen。tracrrna是另一種此類工具。這些是靶向性核酸酶系統(tǒng)的例子：這些系統(tǒng)具有將所述核酸酶定位到靶位點的dna結合成員。接著，核酸酶切割位點。talen和zfn具有融合到dna結合成員的核酸酶。cas9/crispr是在靶dna上找到彼此的關聯(lián)物。dna結合成員具有染色體dna中的關聯(lián)序列。dna結合成員通常根據(jù)意圖的關聯(lián)序列設計，以獲得在意圖位點處或附近獲得核水解作用。某些實施方案可不受限地應用于所有此類系統(tǒng)；包括最小化核酸酶再切割的實施方案，在意圖殘基處精確產生snp的實施方案，以及在dna結合位點處漸滲的等位基因的放置。本文中的例子已經用talen來實施。其他實施方案涉及使用其他靶向核酸內切核酸酶的相同的過程和動物。

talen

術語talen用于本文是廣泛的，并且包括不需要另一個talen輔助而能切割雙鏈dna的單體talen。術語talen還用于指代工程化改造成共同起作用以在相同位點處切割dna的talen對的一個或兩個成員。共同起工作的talen可以稱為左-talen和右-talen，其參考dna或talen對的手性。

tal的密碼(cipher)已有報道(pct申請wo2011/072246)，其中每個dna結合重復負責識別靶dna序列中的一個堿基對。可以裝配殘基以靶向dna序列。簡言之，確定用于talen結合的靶位點，并創(chuàng)建包含核酸酶和一系列識別靶位點的rvd的融合蛋白。在結合后，核酸酶切割dna，使得細胞修復機器能夠運行以在切割末端處產生遺傳修飾。術語talen意指包含轉錄激活物樣(tal)效應器結合域和核酸酶域的蛋白，并包括本身功能性的單體talen以及其它要求與另一個單體talen二聚化的talan。當兩個單體talen相同時二聚化可以產生同二聚體talen，或者當單體talen不同時可以產生異二聚體talen。已顯示了talen在永生化的人類細胞中通過兩種主要的真核dna修復途徑(非同源末端連接(nhej)和同源性指導的修復)來誘導基因修飾。talen通常成對使用，但單體talens是已知的。用于talen(以及其它遺傳工具)處理的細胞包括培養(yǎng)細胞、永生化細胞、原代細胞、原代體細胞、受精卵、生殖細胞、原生殖細胞、胚泡，或干細胞。在一些實施方案中，tal效應器可以用于將其它蛋白結構域(例如，非核酸酶蛋白結構域)靶向特定的核苷酸序列。例如，可以將tal效應器與蛋白結構域相連，所述蛋白結構域來自(不限于)dna20相互作用酶(例如，甲基化酶、拓撲異構酶、整合酶、轉座酶，或連接酶)，轉錄活化子或抑制子，或與其它蛋白例如組蛋白相互作用或修飾其它蛋白例如組蛋白的蛋白。這種tal效應器融合的應用包括例如創(chuàng)建或修飾表觀遺傳調節(jié)元件，產生dna中的位點特異性插入、缺失，或修復，控制基因表達，以及修飾染色質結構。

術語核酸酶包括外切核酸酶和內切核酸酶。術語內切核酸酶指代能夠催化dna或rna分子(優(yōu)選dna分子)內的核酸之間的鍵的水解(切割)的任意野生型或變體酶。內切核酸酶的非限制性例子包括ii類限制性內切核酸酶，如foki、hhai、hindiii、noti、bbvcl、ecori、bglii，和alwi。當具有通常長度約12-45個堿基對(bp)，更優(yōu)選14-45bp的多核苷酸識別位點時，內切核酸酶還包含切點稀有切割內切核酸酶(rare-cuttingendonucleases)。稀有切割內切核酸酶在限定基因座處誘導dna雙鏈斷裂(dsb)。稀有切割內切核酸酶可以是例如靶向內切核酸酶，即由工程化鋅指域與限制性酶(如foki)或化學內切核酸酶的催化域融合得到的嵌合鋅指核酸酶(zfn)。在化學內切核酸酶中，化學或肽切割劑與核酸聚合物或另一個識別特定靶序列的dna綴合，從而將切割活性靶向到特定的序列?；瘜W內切核酸酶也包括合成的核酸酶，如鄰二氮雜菲、dna切割分子，以及已知結合特定dna序列的三鏈體形成寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotides，tfo)的綴合物。根據(jù)本發(fā)明，這些化學內切核酸酶包含于術語“內切核酸酶”中。酸酶的例子包括i-seei、i-chuli-crei、i-csmi、pi-seelpi-ttilpi-mtui、i-ceui、i-seeil1-seeiii、ho、pi-civi、pi-ctrlpi-aaei、pi-bsui、pi-dhai、pi-dralpi-mavlpi-mehi、pi-mfulpi-mfli、pi-mgalpi-mgoi、pi-minlpi-mkalpi-mlei、pi-mmai、pi-30mshlpi-msmi、pi-mthi、pi-mtui、pi-mxei、pi-npui、pi-pfulpi-rmai、pl-spbi、pi-ssplpi-faelpi-mjai、pi-pholpi-taglpi-thyi、pi-tkoi、pi-tspi、i-msol。

由talen或其它工具產生的遺傳修飾可以例如選自下組：插入，缺失，外源性核酸片段的插入，以及取代。術語插入廣泛地使用，以表示字面上的插入到染色體中或使用外源性序列作為模板用于修復。一般來說，鑒定靶dna位點并創(chuàng)建將特異性結合所述位點的talen對。向細胞或胚胎遞送所述talen，例如，作為蛋白、mrna，或通過編碼所述talen的載體。所述talen剪切dna以產生雙鏈斷裂，其接著被修復，通常導致插入刪除的創(chuàng)建，或摻入伴隨的外源性核酸中含有的序列或多態(tài)性，所述外源性核酸被插入染色體中或作為模板用于在修飾的序列情況下的斷裂修復。這一模板驅使的修復對于改變染色體是一個有用的過程，且提供對細胞染色體的高效改變。

術語外源性核酸意指加到細胞或胚胎的核酸，不論所述核酸與細胞中的天然核酸序列相同或不同。術語核酸片段是廣泛的，包括染色體、表達盒、基因、dna、rna、mrna，或其片段。所述細胞或胚胎可以例如選自下組：非人脊椎動物、非人靈長類動物、牛、馬、豬、綿羊、雞、鳥類、兔、山羊、狗、貓、實驗動物，和魚。

一些實施方案涉及制備經遺傳修飾的家畜和/或偶蹄動物的組合物或方法，其包含將talen對導入家畜和/或偶蹄動物的細胞或胚胎中，從而在位talen對特異性結合的位點處對細胞或胚胎dna做出遺傳修飾，以及從所述細胞產生家畜動物和/或偶蹄動物。直接注射可以用于細胞或胚胎，例如注射到合子、胚泡，或胚胎中?；蛘?，可以使用用于蛋白、rna、mrna、dna，或載體導入的多種已知技術之任一種，將talen和/或其它因子導入細胞中。可以從胚胎或細胞根據(jù)已知方法(例如將胚胎移植到妊娠期的宿主中)，或各種克隆方法產生經遺傳修飾的動物。短語“在talen特異性結合的位點處對細胞dna的遺傳修飾”等表示當talen特異性結合其靶位點時，在talen上的核酸酶切割的位點處做出遺傳修飾。核酸酶并不在talen對結合的地方精確切割，而是在兩個結合位點之間的確定位點處切割。

一些實施方案涉及對用于克隆動物的組合物或對細胞的處理。細胞可以是家畜和/或偶蹄動物細胞、培養(yǎng)的細胞、原代細胞、原代體細胞、合子、生殖細胞、原生殖細胞、胚泡，或干細胞。例如，一個實施方案是創(chuàng)建遺傳修飾的組合物或方法，其包含將培養(yǎng)物中的復數(shù)個原代細胞暴露于talen蛋白或編碼一種或多種talen的核酸。talen可以作為蛋白質或核酸片段(例如由mrna或載體中的dna序列編碼)導入。

鋅指核酸酶

鋅指核酸酶(zfns)是人工限制酶，其通過將鋅指dna結合域和dna剪切結構域融合產生。鋅指結構域可以經工程化來靶向期望的dna序列而這使得鋅指核酸酶能夠靶向復雜的基因組中的獨特序列。通過利用內源性dna修復機制，這些試劑可以用于改變高等生物的基因組。zfn可以用于使基因失活的方法中。

鋅指dna結合域具有約30個氨基酸并折疊為穩(wěn)定的結構。每個指主要結合dna底物中的三聯(lián)體。關鍵位置的氨基酸殘基有助于大多數(shù)與dna位點的序列特異性相互作用。這些氨基酸可以在維持剩下的氨基酸的情況下改變以保留必要的結構。通過串聯(lián)連接幾個結構域完成與較長dna序列的結合。其它的功能性，如非特異性foki剪切結構域(n)，轉錄活化子結構域(a)，轉錄抑制子結構域(r)以及甲基化酶(m)可以融合到zfp以分別形成zfn，鋅指轉錄活化子(zfa)，鋅指轉錄抑制子(zfr)，以及鋅指甲基化酶(zfm)。使用鋅指和鋅指核酸酶用于制造遺傳修飾的動物的材料和方法公開于，例如us8,106,255，us2012/0192298，us2011/0023159,和us2011/0281306。

載體和核酸

可以將多種核酸導入細胞中，用于敲除的目的，用于基因的失活，獲得基因的表達，或用于其它目的。如本文所用，術語核酸包括dna、rna，以及核酸類似物，以及雙鏈或單鏈(即正義或反義單鏈)的核酸。核酸類似物可以在堿基部分、糖部分，或磷酸主鏈處修飾以改進例如核酸的穩(wěn)定性，雜交，或溶解性。可以修飾脫氧核糖磷酸主鏈來產生嗎啉代核酸，其中每一個堿基部分與六元嗎啉環(huán)或肽核酸相連，其中脫氧磷酸主鏈被假肽主鏈代替，而保留四種堿基。

靶核酸序列可以可操作地連接到調控區(qū)，如啟動子。調控區(qū)可以是豬調控區(qū)，或者可以來自其它物種。如本文所用，可操作地連接指代將調控區(qū)相對于核酸序列以允許或促進靶核酸轉錄的方式定位。

一般可以將啟動子類型可操作地連接到靶核酸序列。啟動子的例子包括但不限于組織特異性啟動子，組成性啟動子，可誘導啟動子，以及對特定刺激物響應或者不響應的啟動子。在一些實施方案中，可以使用促進核酸分子表達而沒有顯著的組織或時空特異性的啟動子(例如，組成型啟動子)。例如，可以使用β-肌動蛋白啟動子如雞β-肌動蛋白基因啟動子、泛素啟動子、minicag啟動子，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)啟動子，或3-磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動子及病毒啟動子例如單純皰疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)啟動子、sv40啟動子，或巨細胞病毒(cmv)啟動子。在一些實施方案中，雞β肌動蛋白基因啟動子和cmv增強子的融合物作為啟動子使用。見例如xu等，(2001)hum.genether.12:563；和kiwaki等，(1996)hum.genether.7:821。

可以用于核酸構建體的另外的調節(jié)區(qū)包括但不限于多聚腺苷酸化序列、翻譯控制序列(例如內部核糖體進入區(qū)段，ires)、增強子、誘導型元件，或內含子。這些調節(jié)區(qū)可能不是必要的，盡管它們可以通過影響轉錄、mrna的穩(wěn)定性，翻譯效率等等來增加表達。在想要時核酸構建體中可以包含此類調節(jié)區(qū)以獲得核酸在細胞中的最優(yōu)表達。然而，有時可以在沒有此類另外的元件的情況下獲得足夠的表達。

可以使用編碼信號肽或選擇標志物的核酸構建體。可以使用信號肽，使得編碼的多肽定向到特定的細胞位置(例如細胞表面)?？蛇x擇標志物的非限制性例子包括嘌呤霉素、更昔洛韋、腺苷脫氨酶(ada)、氨基糖苷磷酸轉移酶(neo、g418、aph)，二氫葉酸還原酶(dhfr)，潮霉素-b-磷酸轉移酶，胸苷激酶(tk)，以及黃嘌呤(xanthin,xanthine)-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(xgprt)。此類標志物對于在培養(yǎng)物中選擇穩(wěn)定的轉化體是有用的。其它的選擇標志物包括熒光多肽，如綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。

在一些實施方案中，編碼可選擇標志物的序列在側翼可以有重組酶(如例如cre或flp)的識別序列。例如，可選擇標志物在側翼可以有l(wèi)oxp識別位點(由cre重組酶識別的34-bp識別位點)或者frt識別位點，使得可選擇標志物可以從構建體切除。見orban等,proc.natl.acad.sci.(1992)89:6861(關于cre/lox技術的綜述)及brand和dymecki,dev.cell(2004)6:7。含有由可選擇標志物基因中斷的cre-或flp-可激活轉基因的轉座子也可以用于獲得帶有轉基因的條件性表達的轉基因動物。例如，驅動標志物/轉基因表達的啟動子可以是普遍的或者組織特異性的，其可以導致標志物在f0動物(例如豬)中的普遍或組織特異性表達。轉基因的組織特異性激活可以通過例如將普遍表達標志物中斷的轉基因的豬與以組織特異性的方式表達cre或flp的豬雜交，或通過以組織特異性的方式表達標志物中斷的轉基因的豬與普遍表達cre或flp重組酶的豬雜交來完成。轉基因的受控表達或標志物的受控切除允許轉基因的表達。

在一些實施方案中，外源核酸編碼多肽。編碼多肽的核酸序列可以包括編碼“標簽”的標簽序列，所述標簽設計為促進編碼多肽的后續(xù)操作(例如，促進定位或檢測)?？梢詫撕炐蛄胁迦刖幋a多肽的核酸序列中，使得編碼的標簽定位于多肽的羧基或氨基末端。編碼的標簽的非限制性例子包括谷胱甘肽s-轉移酶(gst)和flag^tm標簽(kodak,newhaven,ct)。

核酸構建體可以使用sssicpg甲基化酶(newenglandbiolabs,ipswich,ma)甲基化。一般來說，核酸構建體可以與緩沖液中的s-腺苷甲硫氨酸和sssicpg-甲基化酶在37℃一起孵育?？梢酝ㄟ^將構建體與1個單位hinp1i內切核酸酶在37℃孵育1小時和通過瓊脂糖凝膠電泳測定確認超甲基化。

可以使用多種技術，將核酸構建體導入任意類型的胚胎、胎兒，或成年偶蹄動物/家畜細胞，包括例如生殖細胞，如卵母細胞或卵細胞，祖細胞、成體或胚胎干細胞，原生殖細胞，腎細胞，如pk-15細胞、胰島細胞、beta細胞、肝細胞，或成纖維細胞，如皮膚成纖維細胞中。技術的非限制性例子包括使用轉座子系統(tǒng)、能感染細胞的重組病毒，或脂質體或能夠將核酸遞送到細胞的其它非病毒方法，如電穿孔，顯微注射，或磷酸鈣沉淀。

在轉座子系統(tǒng)中，核酸構建體的轉錄單元(即可操作地連接到外源核酸序列的調控區(qū))側翼有轉座子的反向重復。已開發(fā)了幾種轉座子系統(tǒng)(包括，例如sleepingbeauty(見美國專利號6,613,752和美國公布號2005/0003542)；frogprince(miskey等，(2003)nucleicacidsres.31:6873)；tol2(kawakami(2007)genomebiology8(suppl.l):s7；minos(pavlopoulos等，genomebiology8(suppl.l):s2,2007)；hsmar1(miskey等)molcellbiol.27:4589,2007)；以及passport來將核酸導入細胞(包括小鼠、人和豬細胞)中。sleepingbeauty轉座子尤其有用。轉座酶可以作為蛋白遞送，與外源核酸在相同的核酸構建體上編碼，可以在分開的核酸構建體上導入，或作為mrna(例如，體外轉錄并加帽的mrna)提供。

核酸可以整合到載體中。載體是廣義的術語，其包括設計為從攜帶者(carrier)移動到靶dna中的任意特定dna區(qū)段。載體可以稱為表達載體，或載體系統(tǒng)，其為引起dna插入基因組或其它靶定dna序列(如附加體、質粒，或甚至病毒/噬菌體dna區(qū)段)中需要的一組組分。在動物中用于基因遞送的載體系統(tǒng)(如病毒載體(例如逆轉錄病毒、腺相關病毒以及整合噬菌體病毒)，以及非病毒載體(例如轉座子))具有兩個基本組分：1)由dna(或rna，其逆轉錄成cdna)組成的載體，以及2)轉座酶、重組酶，或其它整合酶，其識別載體和dna靶序列兩者，并將載體插入靶dna序列中。載體最常含有一個或多個表達盒，其包含一個或多個表達控制序列，其中表達控制序列是分別控制并調節(jié)另一個dna序列或mrna轉錄和/或翻譯的dna序列。

許多不同類型的載體是已知的。例如，質粒和病毒載體(如逆轉錄病毒載體)是已知的。哺乳動物表達質粒通常具有復制起點，適合的啟動子和可選的增強子，以及還有任意必要的核糖體結合位點，多聚腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，轉錄終止序列，以及5’側翼非轉錄序列。載體的例子包括：質粒(其也可以是其他種類載體的攜帶者)，腺病毒、腺相關病毒(aav)、慢病毒(例如修飾的hiv-1、siv或fiv)，逆轉錄病毒(例如asv、alv或momlv)，以及轉座子(例如sleepingbeauty、p-元件、tol-2、frogprince、piggybac)。

如本文所用，術語核酸指代rna和dna兩者，包括例如cdna、基因組dna、合成(例如化學合成)dna，以及天然存在的和經化學修飾的核酸，例如合成的堿基或替代主鏈。核酸分子可以是雙鏈或單鏈的(例如有義或反義單鏈)。術語轉基因在本文中廣泛使用，指代其遺傳材料已經使用遺傳工程技術改變的經遺傳修飾的生物體或遺傳工程化生物體。因此，敲除偶蹄動物是轉基因的，無論外源性基因或核酸是否在動物或其后代中表達與否。

經遺傳修飾的動物

可以使用talens和其它遺傳工程化技術修飾動物，包括重組酶融合蛋白，或已知的多種載體。通過這些工具制成的遺傳修飾可以包括對基因的破壞。術語對基因的破壞指代阻止功能性基因產物的形成。僅當基因產物實現(xiàn)它的正常(野生型)功能時，其為功能性的。對基因的破壞阻止由所述基因編碼的功能性因子的表達，并包括對向基因編碼的序列和/或對于所述基因在動物中的表達必要的啟動子和/或操縱子中一個或多個堿基的插入、缺失，或取代?？梢酝ㄟ^，例如從動物的基因組中去除至少一部分所述基因，改變所述基因以防止由該基因編碼的功能性因子的表達，干擾rna，或通過外源性基因的顯性陰性因子的表達來破壞所述破壞的基因。遺傳修飾動物的材料和方法進一步詳細描述于2012年2月24日提交的美國系列號13/404,662，2012年5月9日提交的13/467,588和2009年11月10日提交的12/622,886，其各自通過提述并入本文用于所有目的；在沖突的情況下，以本說明書為準。術語反式作用指代不同的分子作用于靶基因的過程(即分子間)。反式作用元件通常是含有基因的dna序列。這一基因編碼用于調節(jié)所述靶基因的蛋白(或microrna或其它可擴散分子)。所述反式作用基因可以與靶基因在同一條染色體上，但活性通過其編碼的中間蛋白或rna。反式作用基因的實施方案為例如編碼靶向性核酸內切核酸酶的基因。使用顯性陰性(dominantnegative)對基因的失活通常涉及反式作用元件。術語順式調節(jié)或順式作用意指在不編碼蛋白或rna的情況下的作用；在基因失活的語境中，該術語通常表示基因的編碼部分的失活，或對于功能性基因的表達必要的啟動子和/或操縱子的失活。

本領域已知的各種技術可以用于使基因失活以制造敲除動物和/或將核酸構建體導入動物中，來產生建立者動物(founderanimals)和制造動物品系，其中所述敲除或核酸構建體整合到基因組中。這些技術包括但不限于原核(pronuclear)顯微注射(美國專利號4,873,191)，逆轉錄病毒介導的對生殖細胞系的基因轉移(vanderputten等，proc.natl.acad.sci.usa,82:6148-1652,1985)，對胚胎干細胞的基因靶向(thompson等，cell,56:313-321，1989)，胚胎的電穿孔(lo,mol.cell.biol.,3:1803-1814,1983)，精子介導的基因轉移(lavitrano等,proc.natl.acad.sci.usa99,14230-14235,2002；lavitrano等,reprod.fert.develop.18,19-23,2006)，以及體細胞(例如卵丘細胞或乳腺細胞)，或成體、胎兒或胚胎干細胞的體外轉化，接著進行核移植(wilmut等,nature,385:810-813,1997；和wakayama等，nature,394:369-374,1998)。原核顯微注射、精子介導的基因轉移，以及體細胞核轉移是特別有用的技術?；蚪M修飾的動物是其中它的所有細胞都具有所述遺傳修飾的動物，包括生殖系細胞。當使用產生在其遺傳修飾上嵌合的動物的方法時，可以使所述動物同系交配(inbred)并可以選擇基因組修飾的后代。例如，如果在胚泡階段修飾其細胞，可以使用克隆來制造嵌合體動物，或當修飾單細胞時可以發(fā)生基因組修飾。

通常來說，在原核顯微注射中，將核酸構建體導入受精卵中；1個或2細胞受精卵用作含有來自精子頭部的遺傳材料的原核，并且卵在原生質內可見。原核分期的受精卵可以在體外或體內獲得(即從供體動物的輸卵管中手術回收)?？梢匀缦庐a生體外受精卵。例如，可以在屠宰場采集豬的卵巢，并在運輸期間保持在22-28℃?？梢詻_洗并分離卵巢用于卵泡穿刺，可以使用18號針在真空下將范圍從4-8mm的卵泡抽吸到50ml錐形離心管中。可以使用商業(yè)tl-fiepes(minitube,verona,wi)通過預濾器潤洗卵泡液和抽吸的卵母細胞。可以選擇被緊密的卵丘質包圍的卵母細胞并放置到tcm-199卵母細胞成熟培養(yǎng)基(minitube,verona,wi)中，其使用0.1mg/ml半胱氨酸,10ng/ml表皮生長因子,10％豬濾泡液,50μμ2-巰基乙醇,0.5mg/mlcamp,各10iu/ml孕馬血清促性腺激素(pmsg)和人絨毛膜促性腺激素(hcg)補充，在潮濕的空氣中在38.7℃和5％co2持續(xù)約22個小時。接著，可以將所述卵母細胞轉移到不含有camp,pmsg或hcg的新鮮的tcm-199成熟培養(yǎng)基中，并孵育另外22個小時。可以通過在0.1％的透明質酸酶中渦旋振蕩1分鐘將成熟的卵母細胞從它們的卵丘細胞剝離。

對于豬，成熟的卵母細胞可以在500μlminitubeporcproivfmediumsystem(minitube,verona,wi)中在minitube5孔受精皿中受精。在體外受精(ivf)的準備中，可以將新鮮收集的或冷凍的公豬精液清洗，并在porcproivf培養(yǎng)基中重懸至4x105個精子。精子濃度可以使用計算機輔助精液測試(spermvision,minitube,verona,wi)分析。最后，體外授精可以在10μl體積中以終濃度為約40個能動精子/卵母細胞進行，這取決于公豬。將所有受精的卵母細胞在5.0％co2氣氛中在38.7℃孵育6小時。授精后六小時，推定的合子可以在ncsu-23中清洗兩次并移到0.5ml的相同培養(yǎng)基中。該系統(tǒng)通常可以在大多數(shù)公豬間以10-30％的多精授精率(polyspermicinseminationrate)產生20-30％的胚泡。

可以將線性化的核酸構建體注射到原核之一中。接著，可以將注射的卵轉移到受體雌性(例如到受體雌性的輸卵管中)并允許在所述受體雌性中發(fā)育以產生轉基因動物。具體的，體外受精的胚胎可以在15,000xg離心5分鐘來沉淀脂質，允許所述原核的可視化?？梢允褂胑ppendorffemtojet注射器注射所述胚胎并可以培養(yǎng)直到胚泡形成?？梢杂涗浥咛シ至训乃俾屎团吲菪纬梢约百|量。

可以通過手術將胚胎轉移到異步(asynchronous)受體的子宮中。典型地，可以使用5.5英寸導管將100-200(例如，150-200)個胚胎沉積到輸卵管的壺腹部-峽部連接。手術后，可以進行妊娠的實時超聲檢查。

在體細胞核轉移中，可以將包括如上文所述的核酸構建體的轉基因偶蹄動物細胞(例如，轉基因豬細胞或牛細胞)例如胚胎卵裂球、胎兒成纖維細胞，成體耳成纖維細胞，或顆粒細胞導入無核的卵母細胞中來建立組合細胞?？梢匀缦聦⒙涯讣毎ズ耍丛跇O體附近的部分帶切開(partialzonadissection)，然后在切開區(qū)處壓出細胞質。通常，使用具有鋒利的有斜面的尖端的注射移液管來將轉基因細胞注射到阻滯于減數(shù)分裂2的去核卵母細胞中。在一些慣例中，阻滯于減數(shù)分裂2的卵母細胞稱作“卵”。在生成豬或牛胚胎(例如通過融合并活化卵母細胞進行)后，在活化后約20至24小時，將胚胎轉移至接受體雌性的輸卵管。參見例如cibelli等，science280,1256-1258,1998,以及美國專利第6,548,741號。對于豬，可以在轉移胚胎后約20-21天對接受體雌性檢查妊娠。

可以使用標準的育種技術來創(chuàng)建對于來自初始雜合建立者動物的外源核酸方面純合的動物。然而，可以不需要純合性?？梢詫⒈疚闹忻枋龅霓D基因豬與感興趣的其它豬育種。

在一些實施方式中，可以在分開的轉座子上提供感興趣的核酸和可選擇標志物并且以不相等的量對胚胎或細胞提供，其中含有可選擇標志物的轉座子的量遠遠超過(5-10倍過量)含有感興趣核酸的轉座子?？梢曰诳蛇x擇標志物的存在和表達分離表達感興趣核酸的轉基因細胞或動物。由于轉座子會以精確的且不相聯(lián)的方式(獨立轉座事件)整合入基因組中，感興趣的核酸和可選擇標志物不是遺傳連鎖的，并且可以容易地經由標準育種通過遺傳分離分開。如此，可以生成轉基因動物，其不受在后續(xù)世代中保留可選擇標志物(即一個從公共安全性觀點看有些顧慮的問題)約束。

一旦生成了轉基因動物，可以使用標準技術評估外源核酸的表達?？梢酝ㄟ^southern印跡分析實現(xiàn)初始篩選以測定構建體整合發(fā)生與否。關于southern分析的描述，參見sambrook等，1989,molecularcloning,alaboratorymanualsecondedition,coldspringharborpress,plainview；ny的9.37-9.52部分。也可以在初始篩選中使用聚合酶鏈式反應(pcr)技術。pcr指擴增靶核酸的規(guī)程或技術。一般地，采用來自感興趣區(qū)域末端或超出的序列信息來設計與要擴增的模板的相反鏈在序列上相同或相似的寡核苷酸引物?？梢允褂胮cr從dna及rna擴增特定序列，包括來自總基因組dna或總細胞rna的序列。引物的長度通常是14至40個核苷酸，但是長度范圍可以是10個核苷酸至幾百個核苷酸。pcr記載于例如pcrprimer：alaboratorymanual,ed.dieffenbachanddveksler,coldspringharborlaboratorypress,1995。也可以通過連接酶鏈式反應、鏈置換擴增、自身維持的序列復制、或基于核酸序列的擴增來擴增核酸。參見例如lewisgeneticengineeringnews,12:1,1992；guatelli等，proc.natl.acad.sci.usa,87:1874,1990；和weissscience,254:1292,1991。在胚泡期，可逐個處理胚胎用于通過pcr、southern雜交和splinkerettepcr的分析(參見例如dupuy等，procnatlacadsciusa99:4495,2002)。

可以使用技術評估轉基因豬的組織中編碼多肽的核酸序列表達，所述技術包括例如對自動物獲得的組織樣品的northern印跡分析、原位雜交分析、western分析、免疫測定法諸如酶聯(lián)免疫吸附測定法、和逆轉錄酶pcr(rt-pcr)。

干擾rnas

各種干擾rna(rnai)是已知的。雙鏈rna(dsrna)誘導同源基因轉錄體的序列特異性降解。rna誘導的沉默復合體(risc)將dsrna代謝為小的21-23核苷酸的小干擾rnas(sirnas)。risc包含雙鏈rna酶(dsrn酶，如dicer)和ssrna酶(如，argonaut2或ago2)。risc利用反義鏈作為引導以找到切割靶物。sirna和microrna(mirnas)兩者都是已知的。在遺傳修飾的動物中使基因失活的方法包括誘導針對靶基因和/或靶核酸的rna干擾，從而降低靶基因和/或靶核酸的表達。

例如，外源核酸序列可誘導針對編碼多肽的核酸序列的rna干擾。例如，與靶dna同源的雙鏈小干擾rna(sirna)或小發(fā)夾rna(shrna)可以用于降低該dna的表達?？梢陨捎糜趕irna的構建體，例如fire等，nature,391:806,1998；romano和masinomolmicrobiol,6:3343,1992；cogoni等，emboj,15:3153,1996；cogoni和masinonature,399:166,1999；misquitta和patersonproc.natl.acad,sci.usa,96:1451,1999；以及kennerdell和carthewcell,95:1017,1998所描述的?？梢酝ㄟ^mclntyre和fanningbmcbiotechnology,6:1,2006所描述的那樣產生shrna構建體。一般來說，shrna轉錄為含有互補區(qū)的單鏈rna分子，其可以退火并形成短的發(fā)夾。

找到單個的、個別的有功能的針對特定基因的sirna或mirna的概率是高的。例如，sirna的具體序列的預測率為約50％，但是多個干擾rna可以以它們之一將有效的良好信心制備。

實施方案包括體外細胞，體內細胞，和經遺傳修飾的動物例如家畜動物，其表達針對基因例如發(fā)育階段選擇性的基因的rnai。例如，所述rnai可以選自下組：sirna、shrna、dsrna、risc和mirna。

實施方案包括修飾為表達抑制一個或多個腫瘤抑制基因的rnai的動物。

可誘導系統(tǒng)

可誘導系統(tǒng)可用于控制基因的表達。已知各種允許在時空上控制基因表達的可誘導系統(tǒng)。數(shù)個已被證明在轉基因動物體內是有功能的。術語可誘導系統(tǒng)包括傳統(tǒng)的啟動子和可誘導基因表達元件。

實施方案包括修飾為可誘導控制一個或多個腫瘤抑制基因的動物。所述控制可以是正向或負向的，以打開或關閉。

誘導型系統(tǒng)的例子是四環(huán)素(tet)-開啟啟動子系統(tǒng)，其可以用于調節(jié)核酸的轉錄。在此系統(tǒng)中，突變的tet阻抑物(tetr)與單純皰疹病毒vp16反式激活物蛋白的激活域融合以創(chuàng)建四環(huán)素控制的轉錄激活物(tta)，其受到tet或多西環(huán)素(doxycycline，dox)調節(jié)。在缺乏抗生素的情況中，轉錄是最小程度的，而在存在tet或dox的情況中，轉錄得到誘導。備選的誘導型系統(tǒng)包括蛻皮激素或雷怕霉素(rapamycin)系統(tǒng)。蛻皮激素是一種昆蟲蛻皮激素，其生成受到蛻皮激素受體和超氣門蛋白(ultraspiracle)基因(usp)產物的異二聚體控制。通過用蛻皮激素或蛻皮激素類似物諸如muristeronea處理誘導表達。對動物施用以觸發(fā)誘導型系統(tǒng)的藥劑稱為誘導劑。

四環(huán)素誘導型系統(tǒng)和cre/loxp重組酶系統(tǒng)(組成型的或誘導的)是更為常用的誘導系統(tǒng)。四環(huán)素誘導型系統(tǒng)包括四環(huán)素控制的反式激活子(tta)/反向tta(rtta)。在體內使用這些系統(tǒng)的方法包括產生兩個遺傳修飾的動物品系。一個動物品系在選擇的啟動子的控制下表達激活子(tta、rtta或cre重組酶)。另一組轉基因動物表達接納體(acceptor)，其中感興趣的基因(或要修飾的基因)的表達在tta/rtta反式激活子的靶基因的控制下(或側翼為loxp序列)。將兩個品系的小鼠相交配提供了基因表達的控制。

四環(huán)素依賴的調控系統(tǒng)(tet系統(tǒng))依賴兩個組分，即四環(huán)素控制的反式激活子(tta或rtta)和以四環(huán)素依賴方式控制下游cdna表達的tta/rtta依賴的啟動子。在缺乏四環(huán)素或其衍生物(如多西環(huán)素)的情況下，tta結合到teto序列上，允許tta依賴的啟動子的轉錄激活。然而，當存在多西環(huán)素時，tta不能與其靶物相互作用且不發(fā)生轉錄。使用tta的系統(tǒng)被稱為tet-off，因為四環(huán)素或多西環(huán)素允許轉錄下調。四環(huán)素或其衍生物的施用允許暫時控制體內轉基因表達。rtta是tta的變體，其在缺乏多西環(huán)素時是無功能的，但需要配體存在用于反式激活。因此這種系統(tǒng)被稱為tet-on。已在體內將tet系統(tǒng)用于如編碼報告基因、原癌基因，或參與信號傳導級聯(lián)的蛋白的數(shù)個轉基因的可誘導表達。

cre/lox系統(tǒng)使用cre重組酶，其通過在兩個遠端(distant)的cre識別序列，即loxp位點間發(fā)生交換而催化位點特異性重組。導入到兩個loxp序列間的dna序列(稱為敲入(floxed)dna)被cre介導的重組所切除。使用空間控制(帶有組織或細胞特異性啟動子)或時間控制(帶有可誘導系統(tǒng))在轉基因動物中控制cre的表達導致對兩loxp位點間dna切除的控制。一種應用是條件性基因失活(條件性敲除)。另一種方法用于蛋白過表達，其中將敲入的終止子密碼子插入到啟動子序列和感興趣的dna之間。遺傳修飾的動物不表達轉基因，直到表達cre，導致切除敲入的終止子密碼子。這一系統(tǒng)已經應用于b淋巴細胞中組織特異性腫瘤發(fā)生和受控的抗原受體的表達。還開發(fā)了可誘導的cre重組酶。僅通過施用外源配體活化可誘導的cre重組酶?？烧T導的cre重組酶是融合蛋白，其含有原來的cre重組酶和特異的配體結合結構域。cre重組酶的功能活性依賴于能夠結合到融合蛋白中該特異性結構域的外部配體。

實施方案包括體外細胞、體內細胞和經遺傳修飾的動物例如家畜動物，其包含受控于誘導系統(tǒng)的基因。動物的遺傳修飾可以是基因組的或嵌合的。所述可誘導系統(tǒng)例如可以是例如選自下組：tet-on、tet-off、cre-lox和hif1alpha。實施方案是本文所列出的基因。

顯性陰性(dominantnegatives)

因此，不僅可以通過去除或rnai抑制還可以通過創(chuàng)建/表達蛋白的顯性陰性變體來破壞基因，所述顯性陰性變體對該基因產物的正常功能具有抑制效果。顯性陰性(dn)基因的表達可以導致改變的表型，其通過以下施加：a)滴定效應(titrationeffect)；dn被動地與內源基因產物競爭協(xié)同因子或所述內源基因的正常靶標而不發(fā)揮相同的活性，b)毒丸(poisonpill)(或活動扳手(monkeywrench))效應，其中所述顯性陰性基因產物主動地干擾正常基因功能所需的過程，c)反饋效應，其中dn主動地刺激對所述基因功能的負調控因子?？梢灾苽滹@性陰性體以阻礙腫瘤抑制基因。

建立者動物、動物系、性狀和繁殖

可通過克隆和其它本文中描述的方法生產建立者動物。建立者動物可以是遺傳修飾上純合的，如在合子或原代細胞經歷純合修飾的情況中。類似地，也可產生雜合的建立者。建立者可以是基因組修飾的，這意味著所有細胞在它們的基因組中都經歷修飾。建立者可以是修飾上嵌合的，如可發(fā)生在當將載體導入胚胎的多個細胞之一中時，通常在胚泡期?？蓹z測嵌合動物的后代以鑒定基因組修飾的后代。當已經創(chuàng)建了可以通過有性繁殖或通過輔助生殖技術繁殖的動物池時建立動物系，其中雜合或純合后代一致性表達修飾。

重組酶

本發(fā)明的實施方案包括將靶向性核酸酶系統(tǒng)與重組酶(例如reca蛋白，rad51)或其它與dna重組相關的dna結合蛋白一同施用。重組酶與核酸片段形成細絲，并實際上搜索細胞dna來尋找與序列基本同源的dna序列。例如，重組酶可以與充當hdr模板的核酸序列組合。接著，重組酶與hdr模板組合以形成細絲并置入細胞中。重組酶和/或與重組酶組合的hdr模板可以作為蛋白、mrna，或與編碼重組酶的載體置于細胞或胚胎中。美國公開文本2011/0059160(美國系列號12/869,232)的公開內容通過提述特此并入本文中用于所有目的；在沖突的情況下，以本說明書為準。術語重組酶指代遺傳重組酶，其在細胞中酶促催化兩條相對較長的dna鏈之間相對短的dna部分的連接。重組酶包括cre重組酶，hin重組酶、reca、rad51、cre，以及flp。cre重組酶是來自pi噬菌體的i型拓撲異構酶，其催化loxp位點之間的dna的位點特異性重組。hin重組酶是由198個氨基酸組成的21kd蛋白，其存在于細菌沙門氏菌屬(salmonella)中。hin屬于dna轉化酶的絲氨酸重組酶家族，其中它依賴于活性位點絲氨酸來啟動dna切割和重組。rad51是人類基因。由該基因編碼的蛋白是rad51蛋白家族的成員，其輔助dna雙鏈斷裂的修復。rad51家族成員與細菌reca和酵母rad51同源。cre重組酶是實驗中用來刪除側翼有l(wèi)oxp位點的特定序列的酶。flp指代衍生于面包酵母釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)的2μ質粒的flippase重組酶(flp或flp)。

本文中，“reca”或“reca蛋白”指代reca樣重組蛋白家族，其具有基本上全部或大部分相同的功能，特別是：(i)將寡核苷酸或多核苷酸正確定位到其同源靶物上以用于通過dna聚合酶的后續(xù)延伸的能力；(ii)在拓撲學上制備雙鏈體核酸以合成dna的能力；和(iii)reca/寡核苷酸或reca/多核苷酸復合物高效尋找并結合互補序列的能力。表征得最好的reca蛋白來自于大腸桿菌；除了蛋白的最初等位形式外，已鑒定了許多突變體reca樣蛋白，例如reca803。此外，許多生物體具有reca樣鏈轉移蛋白，包括例如酵母、果蠅(drosophila)、哺乳動物(包括人)，以及植物。這些蛋白包括例如ree1、rec2、rad51、rad51b、rad51c、rad51d、rad51e、xrcc2以及dmc1。重組蛋白的一個實施方案是大腸桿菌的reca蛋白?；蛘?，reca蛋白可以是大腸桿菌的突變體reca-803蛋白，來自另一種細菌來源的rec蛋白，或來自另一種生物體的同源重組蛋白。

組合物和試劑盒

本發(fā)明還提供組合物和試劑盒，其含有例如編碼位點特異性核酸內切核酸酶、crispr、cas9、znfs、talens、rec-gal4融合物的核酸分子，它們的多肽，含有這些核酸分子或多肽的組合物，或工程化的細胞系。還可以提供對于指示的等位基因漸滲有效的hdr。此類物品可以用作例如研究工具或在治療上使用。

實施例

實施例1：鑒定豬和人nf1基因之間的保守區(qū)域以選擇靶位點

nf1患者在整個腫瘤抑制基因神經纖維瘤蛋白(nf1)中顯示多種突變。無義突變(r1947x)已被鑒定為nf1患者中最常見的改變，占所有nf1突變的1至2個百分點[1]。r1947發(fā)現(xiàn)于豬的外顯子42中，該外顯子42與人中的外顯子40高度保守，因此我們選擇將人中通常發(fā)現(xiàn)的r1947x突變工程改造到豬基因組中，以創(chuàng)建nf1的大型動物模型。圖1是人和豬的nf1基因和蛋白質的比對。

實施例2：設計talen以工程改造豬nf1基因中的雜合r1947x突變

我們選擇在豬中通過以下來模擬人nf1r1947x突變：tal效應器核酸酶(talen)介導的同源性依賴性修復(hdr)，其使用靶向豬基因組中nf1基因的外顯子42(對應于人基因組中的外顯子40)的talen對，以及hdr構建體來引入終止密碼子、移碼，和新型限制酶位點，允許通過限制性片段長度多態(tài)性(rflp)分析來快速分析克隆(圖2和3a)。除了改變talen結合位點并防止talen重新切割的新型rflp位點之外，將三個nf1talen與設計為誘導r1947x突變的hdr寡聚物一并轉染入ossabaw豬原代成纖維細胞中(圖2和3a)。30℃下溫育3天后，通過rflp分析來對細胞群分析每個talen誘導hdr的能力(圖3b)。該分析顯示，所有三個talen在不同比率時是有活性的(圖3b)。在用talen和hdr構建體處理后，將克隆經歷(rflp)分析以鑒定修飾的等位基因以及以獲得雜合nf1敲除克隆(圖3c)。對每個通過rflp得到的雜合克隆測序以確認野生型和hdr等位基因兩者的存在，并且可被用于染色質轉移克隆技術以產生nf^r1947/+豬(圖3d)。

實施例3：talen活性與分離腫瘤抑制基因上雜合的克隆的能力相關

存在兩個拷貝的腫瘤抑制基因的喪失的選擇優(yōu)勢，因此需要新技術用于分離nf1雜合克隆。由于talenssnf142.2相較于ssnf142.1(54.2％)和ssnf142.3(27.2％)(我們預測其可能分別具有過高或過低的活性)的中間活性(45.1％)，我們選擇talenssnf142.2用于創(chuàng)建nf1r1947x雜合克隆的努力。當用ssnf142.2處理細胞時，通過rflp，41/89(46.1％)的克隆顯示出對nf1r1947x是雜合的(圖4a)。有趣的是，41.6％的回收的克隆顯示為純合的ko，比預測的比率(20.3％,參見等式的圖例)高得多的比率，這表明存在丟失兩個nf1等位基因的選擇壓力(圖4a)。丟失兩個拷貝nf1的此選擇壓力來自這一事實，即nf1是腫瘤抑制基因，因此具有純合丟失的細胞可能比nf1的野生型或雜合的細胞具有生長和/或存活優(yōu)勢。topo克隆和測序分析后，僅1/10(10％)的分離自ssnf142.3talen處理的細胞的克隆對hdr等位基因和野生型等位基因二者是雜合的(圖4c)。9/10克隆(90％)對hdr等位基因是雜合的，并顯示出在野生型等位基因中的小的插入或缺失(插入/缺失(indels))(圖4c)。我們假設在野生型等位基因中看到的插入/缺失可能是由于過量的talen活性和兩個拷貝基因都為非功能性的選擇性優(yōu)勢兩者，因此我們實施了ssnf142.3，一個根據(jù)rflp評估僅具有27.2％活性的talen(圖3b)。與ssnf142.2相比，通過rflp，ssnf142.3導致更少的顯示出雜合的克隆數(shù)目(35/91克隆,38.5％)，但是野生型、雜合子和純合子的比率與預期的非常相似(圖4b)。當將這些克隆進行topo克隆并且對每個等位基因測序后，發(fā)現(xiàn)僅3/10的克隆(30％)對于hdr等位基因是雜合的，并且在野生型等位基因中顯示出小的插入/缺失，而7/10(70％)的克隆對于hdr等位基因和野生型等位基因二者是雜合的(圖4c)。這些實驗顯示出對于腫瘤抑制基因的純合敲除存在選擇優(yōu)勢，以及具有高活性的talen將可能通過hdr或者插入/缺失在兩個等位基因中顯示出修飾?？梢酝ㄟ^使用具有較低活性的talen(如nf1展示的那樣)來克服該挑戰(zhàn)(圖4c)。

實施例4：野生型夾(clamp)法

另一種解決創(chuàng)建腫瘤抑制基因上雜合敲除的細胞的技術挑戰(zhàn)的方法是同時使用兩個hdr寡聚物來分別修飾基因的每個等位基因，該方法稱為“野生型夾”。一個hdr寡聚物將誘導ko等位基因，并且另一個將在阻止再切割和后續(xù)的插入/缺失的同時維持野生型等位基因(表1)。基于來自實施例1的結果，很明顯，高活性的talen具有切割基因的兩個等位基因的傾向。由于當hdr發(fā)生時talen結合位點中的變化，設計為針對nf1的hdr寡聚物防止了hdr修飾的等位基因的再切割(圖2a)。應當指出，還應當通過誘導間隔物長度(spacerlengths)中的變化來阻止再切割，盡管對于nf1，沒有采取該方法。在實施例1中，ssnf142.2是一個高活性的talen，其導致以低于預期的比率的雜合克隆的回收(圖4)。此外，野生型等位基因的再切割導致大比率的含有插入/缺失的克隆(90％)(圖4)。雖然使用具有減弱活性的talen(如ssnf142.3)可以幫助克服該問題并導致在野生型等位基因上沒有插入/缺失的更高產率的雜合克隆(70％)，但是具有減弱活性的talen產生較少的通過rflp為雜合的克隆來開始，使得腫瘤抑制基因雜合的克隆的回收在技術上有挑戰(zhàn)(圖4c)。此外，沒有選擇具有rflp等位基因的雜合子與未修飾的野生型等位基因的方法，因此所有克隆必須進行topo克隆并測序，這是耗時且費力(resource-heavy)的方法。

表1：設計用于野生型夾法的hdr寡聚物

為了克服該挑戰(zhàn)，我們設計了一種新的方法，其中可以通過如下來阻止野生型等位基因的再切割：實施第二個hdr寡聚物，其將沉默核苷酸變化放置到第二個等位基因中，阻止了再切割和后續(xù)的插入/缺失，并為更有效篩選克隆以鑒定雜合子創(chuàng)建新的限制酶位點。表1提供了演示該方法的實例。

野生型夾法利用了talen是高特異性和模塊化(modular)的事實，所述talen含有一個結合靶序列的單個核苷酸的rvd。通過經由改變hdr中每個密碼子的搖擺堿基來制備沉默突變，我們可以阻止talen在hdr發(fā)生后與該基因座的再結合，阻止hdr野生型等位基因中的插入/缺失。此外，通過工程化改變特定沉默堿基對，所得的hdr野生型等位基因現(xiàn)在將含有新的限制酶位點(在這種情況下是bceai)，這將允許我們使用rflp有效地篩選我們的集落。應當注意，使用豬密碼子選擇數(shù)據(jù)庫制備了沉默堿基對變化，以使用每個氨基酸在相似的水平上使用的密碼子。在應用該方法中，我們將簡單地篩選出具有用hindiii切割的等位基因(代表r1947xhdr等位基因)以及用bcea1切割的等位基因(代表hdr野生型等位基因)的集落。該野生型夾法允許更為有效地分離出腫瘤抑制基因(如nf1)上雜合的集落。

實施例5：將野生型夾法應用到多個基因

在癌癥中，常常必需誘導多個突變。在nf1的情況下，兩個腫瘤抑制基因通常牽涉疾病進展，nf1和tp53在相同染色體上極其接近(連鎖)。因此，發(fā)明人設計出順式敲除nf1和tp53(兩個腫瘤抑制基因)的實驗以使動物易患見于nf1患者中的惡性腫瘤，這包括惡性周圍神經鞘瘤(mpnsts)。常見的現(xiàn)象是：這些基因以順式雜合突變，并經歷雜合性丟失，導致nf1和tp53兩者無效的細胞[4-6]。該遺傳變化驅動多種類型的惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生，并且在動物模型中工程改造該變化對理解該疾病是至關重要的[4-6]。由于在靶位點之間創(chuàng)建大缺失的傾向，順式多基因編輯是非常具有挑戰(zhàn)的。我們之前已經展示了以10.3％的比率發(fā)生在ssdmd基因座上的大缺失的發(fā)生[7]。這個實施例進一步被兩個靶定基因都是腫瘤抑制基因的這一事實所困惑，因此需要避免腫瘤抑制基因的純合丟失的新方法，和避免通過在染色體上兩個相互鄰近位置中的dna切割帶來的大缺失的策略。

使用如上所述的類似方法進行開發(fā)并測試針對豬tp53基因(sstp53e6)的talen和hdr寡聚物，該基因在染色體12上與nf1基因連鎖(圖5)[7]。在tp53的常見突變的外顯子6中引入無義突變的talen和hdr寡聚物以17％的效率工作[7]。當使用多重方法以創(chuàng)建具有nf1和tp53突變兩者的成纖維細胞系時，ssnf142.3以25.5％的比率誘導hdr并且sstp53e6以11.8％的比率切割(圖6a)。使用多重方法，其中將ssnf142.3和sstp53e6二者與它們各自的hdr寡聚物轉染入ossabaw細胞中，我們以3.7％(7/190個克隆)的比率回復了nf1^-/+；tp53^-/+克隆(圖6b)。因為sstp53e6經常不能誘導hdr，而仍以高得足以誘導插入/缺失的比率切割；我們進行高限定熔解分析以確定在缺少hdr的情況下任何tp53等位基因是否雜合地含有插入/缺失。對于這兩個基因上潛在雜合的總共17個克隆，我們鑒定出10個根據(jù)rflp在nf1上雜合且根據(jù)高限定熔解分析在tp53上雜合的克隆(參見材料和方法)。我們測序了所有17個對于這兩種基因雜合的克隆，并發(fā)現(xiàn)6/17nf1雜合子在野生型等位基因中含有插入/缺失，2/17tp53雜合子在野生型等位基因中含有插入/缺失，并且通過高限定熔解分析鑒定的7/10tp53雜合子在事實上為野生型?？偣?，通過rflp，17/190(8.9％)的克隆對nf1是雜合的；通過rflp，7/190(3.7％)的克隆對nf1和tp53兩者是雜合的；17/17的克隆含有在nf1或tp53或兩者的野生型等位基因上的插入/缺失。這導致了沒有克隆對于nf1和tp53兩者是雜合的。

為了克服分離nf1和tp53兩者上雜合的克隆的挑戰(zhàn)，我們提出以下方法：

通過在轉染反應中使用較少的talenmrna或設計具有減弱的活性的talen來減少talen的活性。

1.通過減少在30℃時的時間來避免再切割。

2.為野生型等位基因設計阻止再切割和后續(xù)插入/缺失，并允許通過rflp有效篩選野生型等位基因的hdr寡聚物(描述于實施例4)。

一旦鑒定出對于nf1和tp53兩者雜合的克隆，將通過輻射雜種定位(radiationhybridmapping)完成順式發(fā)生nf1和tp53突變的克隆鑒定，如前所述的[8]。

材料和方法

talen設計

使用在線工具“taleffectornucleotidetargeter2.0”鑒定候選talen靶dna序列和rvd序列，如前所述[9]。在神經纖維瘤蛋白(nf1)基因的野豬外顯子42(其對應于nf1基因的智人外顯子40)(其中精氨酸1947(r1947)定位于此)中選擇talen靶dna序列。輸入dna序列是r1947的上游和下游的45堿基對。選擇r1947x無義突變來突變，因為其是在1型神經纖維瘤病(nf1)患者中觀察到的最頻繁的改變[10]。在野豬外顯子6中設計了設計為靶向tp53基因的talen以誘導y155x突變[11]。表2提供了設計的talen的列表：

表2：

供體修復模板設計

設計了同源性依賴性修復(hdr)寡聚物以在nf1基因中工程化改造r1947x突變。該hdr寡聚物含有與野豬nf1外顯子42同源的82堿基對序列；導致r→x氨基酸變化的c→t突變，以及新的hindiii限制酶位點(aagctt)，其允許在克隆上實施靈活的限制性長度多態(tài)性(rflp)測定以確定是否同源重組已實際發(fā)生。設計了hdr寡聚物以工程化改造tp53基因中的y155x突變。該hdr寡聚物含有與野豬tp53外顯子6同源的83堿基對序列，talen結合位點側翼的兩個堿基對的改變，導致y→x氨基酸變化的c→t突變，以及新的hindiii限制酶位點(aagctt)，其允許在克隆上實施rflp測定以確定是否同源重組已實際發(fā)生。通過integrateddnatechnologies來合成這些90mer寡核苷酸模板，100nmol合成，通過標準脫鹽純化，并且重懸于400umtris-edta中。所設計的hdr寡聚物示于以下表3中，其中加粗字體代表自野生型(wt)序列的變化，并且大寫字母表示構成限制性位點的導入的殘基。

表3：為修復模板設計的hdr寡聚物

talen生產

如前所述[9]生產talen。通過遵循goldengateassembly方案，使用rciscript-goldytalen(addgeneid38143)作為最終目的載體來構建質粒[12]。使用qiaprepspinminiprep試劑盒(qiagen)制備裝配的rciscript載體，通過saci線性化，并用作使用mmessaget3試劑盒(ambion)進行體外talenmrna轉錄的模板。

組織培養(yǎng)和轉染

于37℃或30℃(如指示)于5％co2在補充有10％胎牛血清、100i.u./ml青霉素和鏈霉素、2mml-谷氨酰胺、10mmhepes、5ug/ml脫鐵-轉鐵蛋白(apo-transferrin)、25ng/ulrhegf，和20ng/ulrhig的dmem中維持豬成纖維細胞。使用neon轉染系統(tǒng)(lifetechnologies)遞送talen和hdr寡聚物。將在70-100％匯合的低傳代ossabaw、長白豬成纖維細胞以1:2分開，并且次日在70-80％匯合時收獲。將約600,000個細胞與mrnatalen和hdr寡聚物重懸于“r”緩沖液(lifetechnologies)中，并且在100μl尖端通過下述參數(shù)電穿孔：輸入電壓；1800v；脈沖寬度；20ms；和脈沖數(shù)目；每次轉染中包含0.5-2ug的talenmrna和0.1-0.4nmol針對感興趣的特定基因的hdr寡聚物。將轉染的細胞在30℃下培養(yǎng)2或3天，并且然后分析基因編輯效率并且鋪板得到集落。

克隆衍生(clonederivation)

轉染后2或3天，將50至250個細胞接種到10cm皿上，并且培養(yǎng)到個體集落達到直徑約5mm。添加8ml的tryple和dmem培養(yǎng)基(lifetechnologies)1:4(vol/vol)混合物并且吸出集落，轉移至48孔皿和重復(replica)96孔皿的孔中，并且在相同的條件下培養(yǎng)。收集達到匯合的集落用于冷凍保存以及用于基因型分型的樣品制備。

冷凍保存

通過旋轉沉降細胞并重懸于冷凍保存培養(yǎng)基中來制備用于冷凍保存的樣品，所述培養(yǎng)基由以下組成：90％胎牛血清(atlas)和10％二甲基亞砜(sigma)。最初將樣品冷凍降至-80℃4小時，然后轉移至液氮中用于長期儲存。

樣品制備

從6孔皿的孔收集第3天經轉染的細胞群體，并且在20μl下述1xpcr相容性裂解緩沖液中重懸約10％：10mmtris-clph8.0，2mmedta，0.45％trytonx-100(vol/vol)，0.45％tween-20(vol/vol)，新鮮補充有200μg/ml蛋白酶k。使用下述程序在熱循環(huán)儀中處理裂解物：55℃60分鐘，95℃15分鐘。使用20-30μl裂解緩沖液如上文處理來自稀釋克隆的集落樣品。

surveyor突變檢測和rflp分析

使用鉑taqdna聚合酶hifi(lifetechnologies)用1μl細胞裂解物根據(jù)制造商的推薦進行在意圖位點側翼的pcr。針對每個位點的引物列于表4中。用surveyor突變檢測試劑盒(transgenomic)根據(jù)制造商的推薦使用10ulpcr產物分析群體中的突變頻率，如上文描述。使用表5中指定的限制酶對10μl上述pcr反應進行rflp分析。在10％tbe聚丙烯酰胺凝膠上解析surveyor和rflp反應，并且通過溴化乙啶染色顯現(xiàn)。使用imagej進行條帶的密度測定測量；并且計算surveyor反應的突變率，如前記載[13]。經由用rflp片段的總和強度除以親本條帶+rflp片段的總和強度計算百分比hdr。類似地處理集落的rflp分析，只是用1xaccustartiigeltracksupermix(quantabiosciences)擴增pcr產物并在2.5％瓊脂糖凝膠上解析。

表4：用于突變檢測的引物

表5：用于hdr檢測的限制酶

高限定熔解分析

使用以下進行高限定熔解分析：1:10稀釋的2ul細胞裂解液(如上所述)，2um高限定熔解引物(表6)，1xprecisionmeltsupermix(biorad)。在bioradcfxconnect機器中使用退火溫度55℃和40循環(huán)的2步驟方案運行反應。使用biorad’scfxmanager高限定熔解分析來分析熔解曲線。通過圖7中顯示的特征曲線來鑒定雜合克隆。

表6：用于高限定熔解分析的引物

擴增子測序和分析

從轉染的群體中分離dna并通過1xaccustartiigeltracksupermix(quantabiosciences)克隆和擴增。在使用minelutepcr純化試劑盒(qiagen)對pcr產物進行清潔(cleanup)之前，將pcr產物的一部分在2.5％瓊脂糖凝膠上解析以確認大小。將樣本提交到明尼蘇達大學基因組學中心，使用標準sanger測序法進行測序。對于其中等位基因是雜合的樣本，將新鮮的pcr產物用topo-ta克隆入pcr4(lifetechnologies)，并且個體topo克隆被用作第二pcr反應的模板，以在使用minelutepcr純化試劑盒(qiagen)對pcr產物進行清潔(cleanup)之前擴增感興趣的區(qū)域。

實施例6：生產顯示ras超活性的nf1雜合豬

對雄性長白豬細胞進行3輪體細胞核轉移，所述細胞對nf1基因中r1947x突變是雜合的。從3輪克隆和胚胎轉移中，建立了一次妊娠，其中出生4頭仔豬--兩頭胎死腹中、一頭在2天齡時死亡、一頭在93天齡時死亡，圖8a。令人驚訝地，在長白豬遺傳背景中沒有觀察到nf1相關表型。隨后，對雄性ossabaw迷你豬細胞進行3輪體細胞核轉移，所述細胞對nf1基因中r1947x突變是雜合的。從3輪克隆和胚胎轉移中，建立了兩次妊娠，并且出生共8頭仔豬(3頭來自一窩，并且5頭來自另一窩)，圖9a。三頭仔豬在1、5和24天死亡。多個動物顯示出牛奶咖啡斑和潛在的脊柱側凸體征，圖9a-d。五頭nf1r1947x/+ossabaw迷你豬仍活著。

使用活性ras下拉試劑盒(thermofisher)定量活性ras(ras-gtp)，其中用栓在谷胱甘肽瓊脂糖樹脂上的gst-raf1ras結合結構域下拉gtp結合的ras。血清刺激前，將細胞經血清饑餓12小時，并且血清刺激后0、5，和15分鐘以及基礎血清刺激(未血清饑餓)時收集細胞裂解物。血清饑餓后5min，nf1野生型(wt)和nf1雜合(r1947x/+)細胞顯示出ras-gtp水平的峰值，圖8b。當相對于總ras(圖8c,頂部)或gapdh(圖8c,底部)標準化ras-gtp時，nf1r1947x/+(nf1het)細胞顯示出相較于nf1野生型細胞增加的ras活性。血清刺激后15分鐘，與nf1野生型細胞相比，對于nf1r1947x/+(nf1het)細胞，ras-gtp保持更高水平。這些結果顯示，在人中鑒定的并轉移至豬的r1947x突變確實參與神經纖維瘤病的病因(etiotolgy)。此外，這表明ras在病理學中起主要作用。此外，這表明nf1突變對ras高活性起作用。

nf1雜合豬具有nf1相關表型：圖9a-c提供了顯示神經纖維瘤病表型的出生的nf1r1947x/+ossabaw迷你豬表型的例子。圖9a，nf1r1947x/+ossabaw迷你豬的面部的棕褐色/褐色色素沉著不足(頂部)以及背部的白色色素沉著不足(底部)。圖9b，尸體解剖后，通過大體觀察(左)和x射線成像(右)，兩頭nf1r1947x/+ossabaw迷你豬顯示出脊柱彎曲的征兆以及潛在的脊柱側凸的體征。已經在許多nf1r1947x/+ossabaw迷你豬中觀察到牛奶咖啡斑。表(左)描述了在單個動物中見到的11個牛奶咖啡斑，具有如指示的病變照片。nf1患者中牛奶咖啡斑是非常常見的，并且用作診斷人中nf1的標準。圖9d，1-4是對應于9c中1-4的斑點的照片。

實施例7：鑒定snp以確定nf1和tp53中誘導的突變是順式還是反式

發(fā)明人在由talen介導的同源性依賴性修復誘導的nf1r1947x或tp53s119x突變的5,100個堿基對中鑒定了潛在snp(表7和8)。一個或多個所鑒定的snp將用于鑒定哪個染色體上發(fā)生nf1r1947x突變，以及哪個染色體上發(fā)生tp53s119x突變。使用收集自攜帶nf1和tp53基因的染色體12上基因座的輻射雜合圖的數(shù)據(jù)，發(fā)明人將能夠鑒定出在相同染色體上發(fā)生nf1r1947x和tp53s119x突變的克隆。

表7

表8

從1到50連續(xù)列舉的以下段落提供了本公開的各個方面。在一個實施方案中，在第一段(1)中，本公開提供：

1.豬或細胞或胚胎，其包含遺傳修飾的nf1基因和/或修飾的tp53基因。

2.段落1的豬或細胞或胚胎，其中所述修飾的nf1基因包含在人中精氨酸1947的等同的位置處的修飾。

3.段落1和2的豬或細胞或胚胎，其中修飾所述修飾的nf1基因和/或修飾的tp53基因以含有提前終止密碼子。

4.段落1-3中任一項的豬或細胞或胚胎，其具有nf1基因的雜合修飾。

5.段落1-4中任一項的豬或細胞或胚胎，其具有tp53基因的雜合修飾。

6.段落1-5中任一項的豬或細胞或胚胎，其具有nf1基因和tp53基因兩者的修飾。

7.段落1-6中任一項的豬或細胞或胚胎，其中所述修飾是順式的。

8.段落1-7中任一項的豬或細胞或胚胎，其中nf1基因的一個等位基因是野生型等位基因。

9.段落1-8中任一項的豬或細胞或胚胎，其中tp53基因的一個等位基因是野生型等位基因。

10.段落1-9中任一項的豬或細胞或胚胎，其中除了野生型nf1等位基因具有至少1個沉默突變之外，nf1基因的1個等位基因是野生型等位基因?；蛘撸簝H具有1、2、3、4，或5個沉默突變。

11.段落1-10中任一項的豬或細胞或胚胎，其中除了野生型tp53等位基因具有至少1個沉默突變之外，tp53基因的1個等位基因是野生型等位基因?；蛘撸簝H具有1、2、3、4，或5個沉默突變。

12.段落1-11中任一項的豬或細胞或胚胎，其中所述沉默突變?yōu)橄拗泼柑峁┕粑稽c。例如：提供1、2、3、4，或5位點的1、2、3、4、5個沉默突變，其中所述位點是單個酶特異性的或為多個限制酶提供位點。

13.段落1-12中任一項的豬或細胞或胚胎，其具有修飾(沉默或其他)，所述修飾由于修飾而為限制酶提供攻擊位點。例如：提供1、2、3、4，或5位點的1、2、3、4、5個突變，其中所述位點是單個酶特異性的或為多個限制酶提供位點。

14.段落1-13中任一項的豬或細胞或胚胎，其是微型豬(miniaturepig)和/或ossabaw豬和/或長白豬(landracepig)和/或建立者(founder)和/或f1。

15.段落1-14中的細胞，其是原代(primary)和/或豬和/或低傳代(低于13代)細胞。

16.段落1-15中的細胞，其是受精卵、卵母細胞、配子、精子，或胚胎/卵裂球的成員。

17.制備段落1-16中任一項的方法，其包含使用靶向內切核酸酶和/或同源性依賴性修復模板。所述細胞可以被用于制備動物，例如通過克隆。

18.制備動物、細胞，或胚胎的方法，其包含向細胞或胚胎中導入：

定向(directed)至靶染色體dna位點的靶向內切核酸酶；

與靶染色體dna位點同源的第一hdr模板，所述第一hdr模板包含對于靶染色體dna位點外源的第一序列，和

與靶染色體dna位點同源的第二hdr模板，所述第二hdr模板包含對于靶染色體dna位點外源的第二序列。

19.段落18中的方法，其中所述第二序列與靶dna染色體位點相同。

20.段落18和19的方法，其中所述第二序列與靶dna染色體位點具有99％同一性。或者，數(shù)值為95至99.99％；技術人員將立即意識到，在這個范圍內的所有范圍和數(shù)值都被考慮和支持，例如97、99.8，至少95％。

21.段落18至20的方法，其中所述第二序列與靶dna染色體位點相同，除了：(i)一個或多個沉默突變；(ii)堿基數(shù)目在1-5的范圍內。例如，沉默突變的數(shù)目可以是1-5。

22.段落18-21中任一項的方法，其中除了在允許由預先確定的限制酶切割的序列中的變化之外，所述第二序列與靶dna染色體位點相同。進一步的方法提供了任何數(shù)目的此類改變，例如1-5。

23.段落18-22中任一項的方法，其中所述外源序列包含：(i)在自然界中發(fā)現(xiàn)的等位基因；(ii)在同一物種中發(fā)現(xiàn)的等位基因；(iii)在同一物種的另一品種中發(fā)現(xiàn)等位基因(不在相同品種中的等位基因)；(iv)來自不同物種的等位基因(不來自相同物種的等位基因)；(v)創(chuàng)建基因敲除的序列；(vi)可表達的選擇標志物(例如抗生素，熒光蛋白)；(viii)可誘導的啟動子；(ix)著落墊(landingpad)；或(x)i-ix的任何組合，其可以是適當?shù)摹?/p>

24.段落18-23中任一項的方法，其中所述動物、細胞，或動物對于由第一hdr模板產生的遺傳修飾是雜合的。

25.段落18-24中任一項的方法，其應用于制備修飾的nf1和/或tp53位點。

26.段落18-24中任一項的方法，其應用于制備修飾的腫瘤抑制基因。

27.段落18-26中任一項的方法，還包含調整第一hdr模板與第二hdr模板的比率。

28.段落18-27中任一項的方法，其中所述第一模板包含用于第一限制酶的第一位點，以及第二模板包含對于第二限制酶的第二位點。其中所述第一位點和第二位點相對于靶位點和/或靶染色體和/或品種和/或物種和/或動物是新的?；蛘撸簩τ陬~外的獨特酶的添加位點，因此存在3個或更多個限制酶位點，例如數(shù)目從3至10；例如，4、5、6、7、8、9。

29.段落18-28中任一項的方法，其包含對多個細胞篩選遺傳修飾，所述方法包含鑒定包含所述第一位點和所述第二位點的細胞?；?-10個位點。

30.動物或細胞或胚胎，其包含基因組修飾的腫瘤抑制基因，所述基因是雜合修飾的。

31.段落30的動物或細胞或胚胎，其通過18-30中任一項的方法制備。

32.段落30-31中任一項動物或細胞或胚胎，其中除了野生型nf1等位基因具有至少一個沉默突變之外，所述修飾基因的一個等位基因是野生型等位基因。或者：僅具有1、2、3、4，或5個沉默突變。

33.段落30-32的動物或細胞或胚胎，其中所述沉默突變?yōu)橄拗泼柑峁┝斯粑稽c。例如：提供1、2、3、4，或5個位點的1、2、3、4、5個沉默突變，其中所述位點是單個酶特異性的或為多個限制酶提供位點。

34.段落30-33中任一項動物或細胞或胚胎，其包含在基因上(在修飾完成后的基因的一個或兩個等位基因上)的修飾(沉默或其他)，所述修飾由于該修飾而為限制酶提供攻擊位點。例子：提供1、2、3、4，或5個位點的1、2、3、4、5個突變，其中所述位點是單個酶特異性的或為多個限制酶提供位點。

35.段落30-34中任一項動物或細胞或胚胎，其是家畜、牛、豬、微型豬(miniaturepig)和/或ossabaw豬和/或長白豬(landracepig)和/或建立者和/或f1。

36.段落30-35中任一項的細胞，其是原代和/或動物和/或低傳代(低于13代)細胞。

37.段落30-36中任一項的細胞，其是其是受精卵、卵母細胞、配子、精子，或胚胎/卵裂球的成員。

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