本發(fā)明涉及種植方法，尤其是一種白芨微球莖的制備方法。

背景技術(shù)：

白芨（Bletilla striata (Thunb.ex A.Murray)Rchb.f）為一味常用中藥材，白芨具有較好的收斂止血，消腫生肌功效。野生白芨日趨枯竭，主要靠人工種植來(lái)滿(mǎn)足市場(chǎng)；雖然白芨有大量種子，但種子壽命短沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)貯備，萌發(fā)條件苛刻，幼苗期較長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境敏感，白芨的種子非常細(xì)小且無(wú)胚乳，因此在自然狀況下很難萌發(fā)和生長(zhǎng)，實(shí)生苗的栽培較為困難，傳統(tǒng)栽培主要靠分株繁殖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明旨在提供一種高效生產(chǎn)白芨微球莖的方法，

包括如下操作步驟：

1）選取發(fā)育飽滿(mǎn)成熟的白芨果莢，將采摘的白芨果莢進(jìn)行真空包裝后放入冰箱中2-4℃保存代用；

2）播種前先用75％的酒精將果莢浸泡2分鐘，再用自來(lái)水清洗果莢5次后，時(shí)間5-10分鐘，再把果莢放入0.1 %的HgCl2溶液中滅菌5 min，然后用無(wú)菌水沖洗6～8 min，至少?zèng)_洗5次，然后放入已經(jīng)消毒的吸水紙中吸干果莢表皮水分，置于無(wú)菌容器內(nèi)；

3）播種時(shí)，用消毒過(guò)的鑷子剖開(kāi)果莢輕蘸種子使其疏松，然后將白芨種子均勻鋪灑在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-芐氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，培養(yǎng)40-50日后得到具有兩片葉子的白芨種苗，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1000-3000lx，溫度為23—26℃；

4）將已具有兩片葉子的白芨種苗從種子萌發(fā)培養(yǎng)基中去出，再移栽到微球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分為的6-糖基氨基嘌呤KT濃度為 0.8 mg/L、萘乙酸NAA濃度為 0.8 mg/L、糖濃度為3 %，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的肌醇濃度提高到500 mg/L，培養(yǎng)45天后得到基部帶有微球莖的白芨種苗，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度1000-3000lx，溫度為23—26℃；

5）將基部帶有微球莖的白芨種苗培養(yǎng)瓶移至大棚中，打開(kāi)封口膜，在常溫下練苗4-5日后移栽到大棚培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)一步培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間2-3個(gè)月；

6）白芨種苗在大棚中培養(yǎng)直至倒苗后，將白芨種莖去除洗凈，去除須根，保留球莖部分，并將獲取的微球莖放入到0.5%的高錳酸鉀溶液中進(jìn)行消毒5—8min，然后放入到活性炭: 滑石粉: 多菌靈比例為3:1:0.02的粉末中滾動(dòng)3-5min，再?lài)姙?-糖基氨基嘌呤KT濃度為 0.1 mg/L、萘乙酸NAA濃度為 0.1mg/L、赤霉素GA3濃度為 0.1mg/L的1/2MS培養(yǎng)溶液，之后重復(fù)上述步驟3次操作，放入5%的褐藻酸鈉溶液中侵泡5—7min取出置于空氣中固化10-15min，再將已固化的微球莖放入0.4g/L氯化鈣溶液中侵泡1-2min取出置于空氣中固化后，即可用透氣性良好的聚乙烯塑料袋包裝貯藏。

本發(fā)明中白芨微球莖是指在組織培養(yǎng)條件下，以種子為原材料直接接入到培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，45日后得到具有兩片葉子的白芨種苗，在將種苗取出接入到微球莖培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)，45天后得到基部帶有微球莖的白芨種苗，再將白芨種苗移栽到大棚培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)直至倒苗后取出，去除根部洗凈即可得到白芨微球莖。

該方法繁殖速度快，生產(chǎn)效率高，生產(chǎn)成本低，能周年工廠化生產(chǎn)；生產(chǎn)出來(lái)的白芨微球莖具有無(wú)病毒、體積小、貯藏運(yùn)輸方便特點(diǎn)，是一項(xiàng)具有產(chǎn)業(yè)前景，能從根本上解決白芨資源匱乏等問(wèn)題，成活率可達(dá)90%以上。

具體實(shí)施方式

施秉縣中藥材種苗繁育組培室。

1）材料的選取

以蘭科植物白芨Bletilla striata（ Thunb.） Reichb.f.的果莢為原材料，胚齡不低與18周，選取健狀無(wú)病菌果莢為培養(yǎng)誘導(dǎo)萌發(fā)出白芨組培種苗；

2）果莢的儲(chǔ)存

白芨果莢摘取后，放在陰涼處放置7-8天，使果莢表面陰干變脆，按每10個(gè)一袋規(guī)格放入真空包裝袋中進(jìn)行真空包裝，放入冰箱中儲(chǔ)存，溫度2-4℃；

3）培養(yǎng)基的配制

在配制MS培養(yǎng)基時(shí)，MS培養(yǎng)基為現(xiàn)有技術(shù)，含有MS培養(yǎng)基0.7 %瓊脂，MS培養(yǎng)基pH 5.8～6.0，由于MS培養(yǎng)基含有近30種營(yíng)養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對(duì)這幾十種成分進(jìn)行稱(chēng)量，所以將培養(yǎng)基中的各種成分配成濃縮母液，包括大量元素母液，微量元素，有機(jī)物母液，鐵鹽母液，除了大量元素母液為20倍濃縮液之外，其他均為100倍的濃度，冷藏待用，本次所用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為萘乙酸NAA、6-芐氨基腺嘌呤6-BA、6-糖基氨基嘌呤6-糖基氨基嘌呤KT，均配制為1 mg/mL的溶液，冷藏留待量??；

在配制培養(yǎng)基時(shí)，用移液管量取每種母液適宜的量，稱(chēng)取相應(yīng)的蔗糖，瓊脂，蔗糖和瓊脂，根據(jù)不同培養(yǎng)基的要求稱(chēng)取不同的量，用移液管量取設(shè)計(jì)培養(yǎng)基所需的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑量，攪拌均勻，定容至所需培養(yǎng)基容積，用電磁爐加熱煮沸10 min左右以溶解瓊脂，加熱完畢后，加入蒸餾水定容，再用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值在5.8～6.0之間，分裝進(jìn)培養(yǎng)瓶，由于本次培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，因此每瓶倒置培養(yǎng)基溶液高度不低與30mm，用封口膜和膠圈密封培養(yǎng)瓶瓶口；

培養(yǎng)基倒好后，將培養(yǎng)瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，注意要完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底完成；

當(dāng)鍋內(nèi)溫度達(dá)121 ℃，開(kāi)始計(jì)時(shí)20 min，到時(shí)間后關(guān)閉電源，等滅菌鍋壓力降到常壓后將培養(yǎng)瓶取出，放到指定位置冷卻凝固后，即可放入培養(yǎng)基儲(chǔ)存架上留待使用；

所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-芐氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂；

所述微球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為的6-糖基氨基嘌呤KT濃度為 0.8 mg/L、萘乙酸NAA濃度為 0.8 mg/L、糖濃度為3 %，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的肌醇濃度提高到500 mg/L，

4）滅菌處理

在無(wú)菌操作臺(tái)上，播種前先用75％的酒精將果莢浸泡2分鐘，再用自來(lái)水清洗果莢5次后，時(shí)間不低與5分鐘，再把果莢放入0.1 %的HgCl2溶液中滅菌5 min，然后用無(wú)菌水沖洗6～8 min，沖洗5次，每一步都要不停的搖動(dòng)，使材料、消毒液與無(wú)菌水充分接觸，目的是提高消毒效果以及讓無(wú)菌水更好的去除殘留的消毒劑，降低消毒劑對(duì)材料的毒害作用，對(duì)果莢進(jìn)行消毒之后，將其放入已經(jīng)消毒的吸水紙中吸干果莢表皮水分，置于無(wú)菌容器內(nèi)備用，放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，應(yīng)立即使用，避免外界病菌再次侵入；

5）種子的接入

播種時(shí)，用消毒過(guò)的鑷子剖開(kāi)果莢輕蘸種子使其疏松，然后將白芨種子均勻鋪灑在種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基為MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-芐氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，培養(yǎng)45日后得到具有兩片葉子的白芨種苗，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1000-3000lx，溫度為23—26℃；

6）微球莖的誘導(dǎo)

將已具有兩片葉子的白芨種苗從種子萌發(fā)培養(yǎng)基中去出，再移栽到微球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分為的6-糖基氨基嘌呤KT濃度為 0.8 mg/L、萘乙酸NAA濃度為 0.8 mg/L、糖濃度為3 %，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的肌醇濃度提高到500 mg/L，培養(yǎng)45天后得到基部帶有微球莖的白芨種苗，培養(yǎng)條件為光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度1000-3000lx，溫度為23—26℃左右；

7）練苗

將基部已帶有微球莖類(lèi)型物的白芨種苗培養(yǎng)瓶移至大棚中，打開(kāi)封口膜，在常溫下練苗4-5日，練苗期間應(yīng)注意觀察，出現(xiàn)缺水時(shí)，應(yīng)及時(shí)噴施無(wú)菌水，避免種苗出現(xiàn)脫水死亡；

8）大棚培養(yǎng)基質(zhì)的配制

將椰糠、腐殖土、有機(jī)基質(zhì)按體積2：1：1比例混合，加入上述混合物總重量10%的充分腐熟牛糞，反復(fù)翻動(dòng)使其充分混合，用1000 倍50%多菌靈溶液澆透培養(yǎng)基質(zhì)，放于陽(yáng)光下爆曬10-15天，至培養(yǎng)基質(zhì)變干，水份低于5%；

9）培養(yǎng)盤(pán)的準(zhǔn)備

將培養(yǎng)基質(zhì)放入盤(pán)體長(zhǎng)54cm寬28cm穴深40mm口徑25mmX25mm的穴盤(pán)中，輕輕壓實(shí)后將培養(yǎng)基扒平，再用清水將基質(zhì)充分澆透，蓋上塑料薄膜保濕并防止異物進(jìn)入；

10）微球莖的培養(yǎng)

將基部帶有微球莖的白芨種苗移栽培養(yǎng)穴盤(pán)中，每穴1株，移栽過(guò)程中要輕拿輕放，避免損傷種苗，同時(shí)覆土厚度不宜過(guò)深，以剛好覆蓋微球莖為準(zhǔn)；

11）水肥管理

移栽后要第一時(shí)間噴施無(wú)菌水，注意保持土壤濕度，做到少施多次，以保持基質(zhì)體積不萎縮、用力捻不出水為標(biāo)準(zhǔn)，每隔7-10日噴施一次葉面肥；

12）微球莖的包衣、貯藏

白芨種苗在大棚中培養(yǎng)直至倒苗后，將白芨種莖去除洗凈，去除須根，保留球莖部分，選取直徑為0.5-1.5cm的白芨種莖到0.5%的高錳酸鉀溶液中進(jìn)行消毒5—8min，然后放入到活性炭: 滑石粉: 多菌靈比例為3:1:0.02的粉末中滾動(dòng)3-5min，再?lài)姙?-糖基氨基嘌呤KT濃度為 0.1 mg/L、萘乙酸NAA濃度為 0.1mg/L、赤霉素GA3濃度為 0.1mg/L的1/2MS培養(yǎng)溶液，之后重復(fù)上述步驟3次操作，放入5%的褐藻酸鈉溶液中侵泡5—7min取出置于空氣中固化10-15min，再將已固化的微球莖放入0.4%氯化鈣溶液中侵泡1-2min取出置于空氣中固化后，即可用透氣性良好的聚乙烯塑料袋包裝貯藏，亦可直接用于大田生產(chǎn)。