本發(fā)明屬于農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寬葉不死鳥轉(zhuǎn)染體系的方法。
背景技術(shù)：
寬葉不死鳥(K.daigremontian)，又名大葉落地生根、花蝴蝶、倒吊蓮、傷藥、打不死、曬不死、古仔燈、新娘燈、大疔黃、土三七、葉生根、番鬼牡丹、葉爆芽、天燈籠、槍刀草、厚面皮、著生藥、大還魂、復(fù)葉落地生根、墨西哥斗笠。是景天科(Crassulaceae)，伽藍(lán)菜屬(Kalanchoe)中一種極易栽培的觀賞植物。景天科植物有其特殊的光合作用方式景天酸代謝，景天酸代謝途徑是一種植物應(yīng)對干旱環(huán)境的生理生態(tài)適應(yīng)，是光合作用的一條重要節(jié)水型途徑。寬葉不死鳥原產(chǎn)非洲馬達(dá)加斯加地區(qū)，多年生肉質(zhì)草本植物，株高50～100cm，莖單生且直立，基部木質(zhì)化，葉片肉質(zhì)，葉背具有不規(guī)則淡紅褐斑紋，葉長15～20cm，邊緣鋸齒，能夠自發(fā)地在葉片邊緣鋸齒處產(chǎn)生胎生苗從而進(jìn)行無性生殖，聚傘狀圓錐花序，寬筒狀下垂，淡灰紫色。寬葉不死鳥的胎生苗在葉片邊緣鋸齒處發(fā)生，對稱地排列于葉片邊緣缺刻處；待到根系系統(tǒng)形成時，胎生苗從母葉上脫落，掉在地上并成長為新的植株。
寬葉不死鳥因其奇特的造型而成為一種重要的園藝觀賞植物，不僅可以獨自盆栽觀賞以及作為植物配制中的背景植物，而且作為冬切花能在溫度低的條件下保持較長花期。此外，寬葉不死鳥也可以作為科學(xué)研究的一個重要模型：寬葉不死鳥在景天酸代謝植物的生理生化、系統(tǒng)進(jìn)化方面扮演著非常重要的角色；寬葉不死鳥不通過種子形成體細(xì)胞胚的能力為研究體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程提供了一個極具吸引力的模型。因為寬葉不死鳥有著重要的園藝經(jīng)濟(jì)價值與科研價值，所以建立一個以寬葉不死鳥作為模型的研究平臺有著重要的意義。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)目前廣泛應(yīng)用于植物基因工程研究。根癌農(nóng)桿菌中含Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒的部分DNA片段可整合到宿主細(xì)胞中，從而整合到植物的基因組中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化雖然比較常見，但由于植物基因的屏障作用，農(nóng)桿菌并非能夠介導(dǎo)任意植物基因。寬葉不死鳥的基因屏障作用較強(qiáng)，目前還沒有文獻(xiàn)和專利報道過利用農(nóng)桿菌成功將外源基因?qū)氲綄捜~不死鳥中。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)無法在寬葉不死鳥中建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，提供了一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寬葉不死鳥轉(zhuǎn)染體系的方法，所述方法能夠打破寬葉不死鳥的基因屏障，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)寬葉不死鳥轉(zhuǎn)化，打通寬葉不死鳥農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染體系，這是使寬葉不死鳥快速獲得目的性狀的第一步，也是較為重要的一步。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寬葉不死鳥轉(zhuǎn)染體系的方法，所述方法包括以下步驟：
步驟(1)無菌苗培養(yǎng)：摘取帶寬葉不死鳥的小芽，進(jìn)行清洗滅菌；將清洗滅菌后的小芽接種到SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，小芽均勻分布在培養(yǎng)基上進(jìn)行光照培養(yǎng)；將長至3～5cm高的苗整株取出，切成小段，每段帶有一個葉節(jié)，然后把葉節(jié)接入SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)得到寬葉不死鳥幼苗；
所述寬葉不死鳥葉片清洗滅菌操作如下：用流水沖洗除去葉片表面的灰塵和泥土，使用75％酒精消毒50～70s，用無菌水涮洗3～5次，轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)瓶中，加入0.1～0.2％的升汞消毒3～5min，升汞倒回原來的瓶中，最后用無菌水洗5-7次。
所述SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分如下：SH基礎(chǔ)配方+瓊脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高溫滅菌20～30min，
SH基礎(chǔ)配方成分如下：硝酸鉀2.5～5.0g·L-1，硫酸鎂0.195～0.4g·L-1，磷酸二氫銨0.3～0.6g·L-1，氯化鈣151～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，鹽酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，鹽酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，煙酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸鐵納19.8～40mg·L-1，六水氯化鈷0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸銅0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化鉀1～2mg·L-1，一水硫酸錳10～20mg·L-1，二水鉬酸鈉0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸鋅1～2mg·L-1，以下步驟所述的SH基礎(chǔ)配方也采用該配方。
所述光照培養(yǎng)的條件如下：光照強(qiáng)度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃培養(yǎng)15～20天。
所述擴(kuò)繁培養(yǎng)的條件如下：光照強(qiáng)度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃培養(yǎng)15～20天。
步驟(2)侵染和共培養(yǎng)：將擴(kuò)繁培養(yǎng)后的寬葉不死鳥幼苗取出，并將葉片剝下，沿主葉脈方向?qū)⑷~片切為2-3截，放入無菌三角瓶；加入農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行侵染；結(jié)束后將葉片取出，濾去菌液，待葉片晾干后接種到墊有濾紙的共培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)；
所述含有AS的農(nóng)桿菌菌液的OD600為0.4～0.8，AS終濃度為100～500μmol/L；侵染期間將葉片與含有AS(乙酰丁香酮)的農(nóng)桿菌菌液輕輕搖勻，靜置1～2h，靜置過程中采用0.5～0.9MPa真空處理40～80min。
所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基由以下成分組成：SH基礎(chǔ)配方、2，4-D 0.1～0.9mg/L、NAA 0.2～1.0mg/L、6-BA 1.0～3.0mg/L、蔗糖20～50g/L、葡萄糖10～50g/L、200～500ul/L AS、瓊脂8～16g/L；所述共培養(yǎng)的條件為：22～26℃暗培養(yǎng)3～5天，共培養(yǎng)基中采用的激素組合及加入量能夠保證侵染后的寬葉不死鳥葉片存活和正常生長。
步驟(3)篩選和分離抗性苗：共培養(yǎng)結(jié)束后，將葉片轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，有少部分活下來并分化出小芽；將小芽轉(zhuǎn)接到抗性苗培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性苗分離培養(yǎng)；然后將分離出的抗性苗再轉(zhuǎn)接到新的抗性苗培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性苗生長培養(yǎng)；
所述篩選培養(yǎng)基由以下成分組成：SH基礎(chǔ)配方、2,4-D 0.1～1.2mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、6-BA0.3～0.9mg/L、蔗糖20～60g/L、Hyg 10～40mg/L、carb 250～750mg/L、cef 250～750mg/L、瓊脂8～16g/L；篩選培養(yǎng)基中抗生素組合以及抗生素添加量能有效抑制農(nóng)桿菌生長，篩選出抗性陽性苗。
所述篩選培養(yǎng)條件如下：光照強(qiáng)度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃光照培養(yǎng)15～20天。
所述抗性苗培養(yǎng)基由以下成分組成：SH基礎(chǔ)配方、蔗糖30～60g/L、carb 250～750mg/L、cef250～750mg/L、瓊脂8～16g/L。
步驟(3)所述抗性苗分離培養(yǎng)的條件：當(dāng)抗性苗長大到2mm長度，就可以進(jìn)行分離培養(yǎng)；
抗性苗生長培養(yǎng)的條件為：光照強(qiáng)度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃光照培養(yǎng)15～20天。
步驟(4)驗證：提取獲得的抗性苗的葉片的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，得到農(nóng)桿菌成功侵染寬葉不死鳥的陽性苗，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寬葉不死鳥轉(zhuǎn)染體系。
本發(fā)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寬葉不死鳥轉(zhuǎn)染體系的要點如下：農(nóng)桿菌植物轉(zhuǎn)化雖然比較常見，但一般都針對水稻等谷物植物；由于觀賞類植物的基因屏障作用較強(qiáng)，農(nóng)桿菌很難侵染到觀賞植物基因中。以寬葉不死鳥為模型的研究平臺，建立寬葉不死鳥的組織培養(yǎng)體系以及轉(zhuǎn)基因體系的重點在于共培養(yǎng)、篩選和抗性苗分離。而共培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、以及抗性苗分離培養(yǎng)基中加入的激素種類及組合、激素添加量以及培養(yǎng)時間，都有不可預(yù)知、不可控的結(jié)果。根據(jù)研究，發(fā)現(xiàn)寬葉不死鳥對本發(fā)明采用的激素配方以及培養(yǎng)時間比較適合，容易打破其基因屏障，農(nóng)桿菌能夠成功介導(dǎo)，并且愈傷組織形成頻率較高。本發(fā)明通過對共培養(yǎng)、篩選和抗性苗分離步驟的不斷探索，摸索出最佳培養(yǎng)條件，成功打通寬葉不死鳥農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染體系。
與現(xiàn)有育種技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化寬葉不死鳥，建立了穩(wěn)定的寬葉不死鳥的轉(zhuǎn)基因體系，為寬葉不死鳥的轉(zhuǎn)基因育種提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持，能夠以寬葉不死鳥作為研究景天科植物的模式植物，能夠培育出具有高觀賞價值的寬葉不死鳥新品種。
附圖說明
圖1為寬葉不死鳥潮霉素轉(zhuǎn)化陽性苗PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳圖。
具體實施方式
下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制；下述實施例中未注明的具體技術(shù)或條件，均為常規(guī)技術(shù)或條件，或按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。所述的百分比若無特殊說明是指質(zhì)量百分比。
SH：Protocol for Schenk and Hildebrandt，SH培養(yǎng)基；
6-BA：6-芐氨基腺嘌呤；
NAA：a-萘乙酸；
AS：乙酰丁香酮；
Hyg：潮霉素；
Cef：頭孢霉素；
Carb：羧芐青霉素；
2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸；
實施例1：寬葉不死鳥的誘導(dǎo)愈傷及農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染
步驟1外植體消毒階段：摘取大棚里寬葉不死鳥，葉片上的小芽若干，用流水沖洗去掉表面的灰塵和泥土等，放入培養(yǎng)瓶中，在超凈臺里用75％酒精消毒60s，用無菌水涮洗3～5次，轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)瓶中，加入0.1％的升汞，晃動消毒5min，升汞到會原來的瓶中，用無菌水洗5-7次即可。
步驟2接種階段：
將消毒后的小芽，用鑷子接種后到SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每瓶接種3-4個小芽，均勻分布在培養(yǎng)基上，接完后放到培養(yǎng)間，光照強(qiáng)度1800～2000lx，每天光照12～13h，23～25℃光照培養(yǎng)15～17天；
SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分如下：硝酸鉀3.0g·L-1，硫酸鎂0.25g·L-1，磷酸二氫銨0.4g·L-1，氯化鈣200mg·L-1，甘氨酸3mg·L-1，肌醇150mg·L-1，鹽酸硫胺素0.5mg·L-1，鹽酸吡哆素0.7mg·L-1，煙酸0.7mg·L-1，乙二胺四乙酸鐵納25mg·L-1，六水氯化鈷0.15mg·L-1，五水硫酸銅0.25mg·L-1，硼酸7mg·L-1，碘化鉀1.25mg·L-1，一水硫酸錳12mg·L-1，二水鉬酸鈉0.15mg·L-1，七水硫酸鋅1.5mg·L-1，瓊脂12g·L-1，蔗糖30g·L-1，pH5.2～5.5，118～122℃高溫滅菌20～30min。
步驟3無菌苗的擴(kuò)繁階段：
一般無菌苗長到5cm左右即可用于擴(kuò)繁。用鑷子把無菌苗取出放入培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀把無菌苗切成小段，每段帶有一個葉節(jié)，然后把葉節(jié)接入SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每瓶4-5個，放入培養(yǎng)間22～23℃光照培養(yǎng)，一個月至兩個月就能長大作為實驗材料用于轉(zhuǎn)基因。
步驟4農(nóng)桿菌的制備階段：
將導(dǎo)入植物雙元載體PCAMBIA1301的農(nóng)桿菌加入到同時添加了卡那霉素和利福平抗生素的YM培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速200r/min，28℃培養(yǎng)過夜，之后把菌液放入離心機(jī)，4000r/min，4℃離心10min，倒掉上清液，加入重懸液使OD值達(dá)到0.4-0.8；重懸液為SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH5.2～5.5，118～121℃滅菌20-30min。最后向菌液中加入200μmol/L AS，混勻備用；
步驟5侵染和共培養(yǎng)階段：
把植株從培養(yǎng)瓶取出放入培養(yǎng)皿中，將葉片從植株上剝下，剩下的莖和頂芽放到一邊，在主葉脈豎著方向上用手術(shù)刀將葉片切成2-3截，切完后將切好的葉片放入三角瓶中，一般切取5-6瓶的無菌苗。把重懸好的菌液倒入三角瓶中，一般一瓶倒40-50ml菌液，用刀或者鑷子把瓶壁上材料推入菌液，套上塑料封口膜并用橡筋扎緊，在超凈臺內(nèi)放置1.5～2小時，使菌液充分與材料接觸。0.5MPa真空處理1小時，期間輕輕搖勻。抽完真空后將材料從真空泵取出，靜置1-3小時，放入超凈臺，倒去菌液，把葉片放入鋪有2-3層濾紙的培養(yǎng)皿中，待其菌液晾干后，接入墊有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，接種時要接的較分散，完全鋪滿整個培養(yǎng)皿，接種完后用封口膜封口25℃暗培養(yǎng)3個整天。共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為：SH基礎(chǔ)配方、2,4-D 0.1mg/L、NAA 0.2mg/L、6-BA 1.0mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、200ul/L AS、瓊脂8g/L；所述共培養(yǎng)的條件為：22～24℃暗培養(yǎng)3天；
SH基礎(chǔ)配方：硝酸鉀4.0g·L-1，硫酸鎂0.30g·L-1，磷酸二氫銨0.35g·L-1，氯化鈣190mg·L-1，甘氨酸2.5mg·L-1，肌醇110mg·L-1，鹽酸硫胺素0.5mg·L-1，鹽酸吡哆素0.7mg·L-1，煙酸0.7mg·L-1，乙二胺四乙酸鐵納22mg·L-1，六水氯化鈷0.11mg·L-1，五水硫酸銅0.20mg·L-1，硼酸7.5mg·L-1，碘化鉀1.45mg·L-1，一水硫酸錳13mg·L-1，二水鉬酸鈉0.14mg·L-1，七水硫酸鋅1.5mg·L-1；
步驟6篩選階段：
把共培養(yǎng)時間到的材料取出，接種到篩選培養(yǎng)基上，一皿接種5-6排，每個材料間隔2cm左右，接種完以后，封口膜封口，放到培養(yǎng)間，25℃光照培養(yǎng)，培養(yǎng)期間隨時觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染后及時轉(zhuǎn)移未污染材料到新的培養(yǎng)基上，繼續(xù)光照培養(yǎng)，一般培養(yǎng)20天，大部分材料會死亡，少部分活下來并分化出小芽。篩選培養(yǎng)基成分為：SH基礎(chǔ)配方(同步驟5)、2,4-D 0.1mg/L、NAA 0.2mg/L、6-BA 1.0mg/L、蔗糖30g/L、Hyg 10mg/L、carb 250mg/L、cef 250mg/L、瓊脂8g/L。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1500～2000lx，每天光照12～13h，22～24℃光照培養(yǎng)17天。
步驟7抗性苗分離階段：
將篩選后出芽的材料轉(zhuǎn)入抗性苗培養(yǎng)基中長大并檢測，未分化出小芽的材料繼續(xù)接種到新的篩選培養(yǎng)基中，抗性苗培養(yǎng)基即加入抗生素的普通SH培養(yǎng)基，其成分為：SH基礎(chǔ)配方(同步驟5)、蔗糖30g/L、carb 250mg/L、cef250mg/L、瓊脂8g/L。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1800～2000lx，每天光照12～13h，22～23℃。
步驟8抗性苗生長階段：
抗性苗培養(yǎng)基中的抗性苗生長比較緩慢，需要更換一次新的抗性苗培養(yǎng)基才能較快速的生長，所以分離下來的抗性苗在生長18天以后需要更換一次新的抗性苗培養(yǎng)基，待其生長至40天即可移栽；培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1900～2000lx，每天光照12～13h，22～24℃。
步驟9陽性苗的驗證階段：
抗性苗經(jīng)過PCR檢測和凝膠電泳驗證為陽性苗。
取0.5cm抗性苗葉片作為樣品，放入滅菌的1.5ml離心管中利用CTAB法提取總DNA，具體步驟如下：
(1)在含有樣品的1.5ml離心管中加入滅菌鋼珠，蓋上蓋子在液氮中防止2～5分鐘后利用研磨儀將葉片磨碎；
(2)加入800μl的CTAB提取緩沖液，混勻(CTAB在65℃水浴預(yù)熱)，每5min輕輕震蕩幾次，20min后12000r/min，離心15min；
(3)小心吸取上清液，加入等體積的酚：氯仿為1:1的(各400μl)溶液，混勻，4℃，12000r/min，離心10min；
(4)小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4℃，12000r/min，離心10min。
(5)重復(fù)步驟(4)1-2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止；
(6)取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，離心10min；
(7)棄去上清液，用70％乙醇洗滌沉淀2次；
(8)室溫下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50μl去離子水中，于-20℃或者-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
在提取出了樣品的DNA后，就可以進(jìn)行PCR了，標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系如下：
10×擴(kuò)增緩沖液 2.5μl
2.5mmol/L dNTP混合物 1.5μl
引物F、R各0.5μl
模板DNA(即提取出的樣品DNA) 1μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl
加雙或三蒸水至 25μl
按照上面的比例配置完成標(biāo)準(zhǔn)體系后進(jìn)行PCR反應(yīng)的程序如下：
PCR體系中所使用的引物是本實驗室根據(jù)載體pCambia1301中GUS基因設(shè)計序列如下：
引物F:5'-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC
引物R:5'-CCTGACCTATTGCATCTCCC
本發(fā)明檢測的抗性植株對于潮霉素具有一定的抗性，證明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗性基因已經(jīng)表達(dá)。
篩選之后分化所得的陽性苗經(jīng)過如上驗證，證實了本發(fā)明中通過農(nóng)桿菌遺傳介導(dǎo)的方法能將外源基因引入寬葉不死鳥基因組(參見圖1，9號，26號，43號泳道為DL2000marker購買自大連寶生物技術(shù)公司；50號泳道為陽性對照；51號泳道為陰性對照；1號，2號，3號，4號，8號，10號，12號，13號，15號，19，20號，21號，24號，25號，29號，31號，33號，34號，35號，36號，37號，38號，40號，44號，45號泳道經(jīng)PCR證明為陽性植株)。并且經(jīng)過對傳代的植株進(jìn)行了如上驗證后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過本體系傳代得到的轉(zhuǎn)基因植株傳代穩(wěn)定。
本實施例中愈傷組織形成頻率為95.4％，長綠苗的頻率為82.1％，生根率98.8％，轉(zhuǎn)化率54.3％，結(jié)果如表1、表2和表3所示。
表1
表2
表3
實施例2
步驟1外植體消毒階段：
摘取大棚里寬葉不死鳥，葉片上的小芽若干，用流水沖洗去掉表面的灰塵和泥土等，放入培養(yǎng)瓶中，在超凈臺里用75％酒精消毒70s，用無菌水涮洗3～5次，轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)瓶中，加入0.1％的升汞，晃動消毒5min，升汞到會原來的瓶中，用無菌水洗5-7次即可。
步驟2接種階段：
將消毒后的小芽，用鑷子接種后到SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每瓶接種3-4個小芽，均勻分布在SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，接完后放到培養(yǎng)間，光照強(qiáng)度2400～2500lx，每天光照13～14h，25～26℃光照培養(yǎng)18～20天；
SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分：硝酸鉀3.6g·L-1，硫酸鎂0.30g·L-1，磷酸二氫銨0.45g·L-1，氯化鈣250mg·L-1，甘氨酸2.5mg·L-1，肌醇150mg·L-1，鹽酸硫胺素0.6mg·L-1，鹽酸吡哆素0.8mg·L-1，煙酸0.85mg·L-1，乙二胺四乙酸鐵納25mg·L-1，六水氯化鈷0.1mg·L-1，五水硫酸銅0.2mg·L-1，硼酸6mg·L-1，碘化鉀1.0mg·L-1，一水硫酸錳20mg·L-1，二水鉬酸鈉0.2mg·L-1，七水硫酸鋅1.2mg·L-1，瓊脂10g·L-1，蔗糖40g·L-1；pH5.4～5.8，120～121℃高溫滅菌20～30min。
步驟3無菌苗的擴(kuò)繁階段：
一般無菌苗長到5cm左右即可用于擴(kuò)繁。用鑷子把無菌苗取出放入培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀把無菌苗切成小段，每段帶有一個葉節(jié)，然后把葉節(jié)接入SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每瓶4-5個，放入培養(yǎng)間25～26℃光照培養(yǎng)，一個月至兩個月就能長大作為實驗材料用于轉(zhuǎn)基因。
步驟4農(nóng)桿菌的制備階段：
將導(dǎo)入植物雙元載體PCAMBIA1301的農(nóng)桿菌加入到同時添加了卡那霉素和利福平抗生素的YM培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速200r/min，28℃培養(yǎng)過夜，之后把菌液放入離心機(jī)，4000r/min，4℃離心10min，倒掉上清液，加入重懸液使OD值達(dá)到0.6-1.0；重懸液為SH基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH5.4～5.8，122～125℃滅菌20-30min。最后向菌液中加入400μmol/L AS，混勻備用；
步驟5侵染和共培養(yǎng)階段：
把植株從培養(yǎng)瓶取出放入培養(yǎng)皿中，將葉片從植株上剝下，剩下的莖和頂芽放到一邊，在主葉脈豎著方向上用手術(shù)刀將葉片切成2-3截，切完后將切好的葉片放入三角瓶中，一般切取5-6瓶的無菌苗。把重懸好的菌液倒入三角瓶中，一般一瓶倒40-50ml菌液，用刀或者鑷子把瓶壁上材料推入菌液，套上塑料封口膜并用橡筋扎緊，在超凈臺內(nèi)放置1.5～2.5小時，使菌液充分與材料接觸。0.5MPa真空處理1小時，期間輕輕搖勻。抽完真空后將材料從真空泵取出，靜置1-3小時，放入超凈臺，倒去菌液，把葉片放入鋪有2-3層濾紙的培養(yǎng)皿中，待其菌液晾干后，接入墊有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，接種時要接的較分散，完全鋪滿整個培養(yǎng)皿，接種完后用封口膜封口25℃暗培養(yǎng)3個整天。共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分為：SH基礎(chǔ)配方、2，4-D 0.5mg/L、NAA 0.8mg/L、6-BA2.5mg/L、蔗糖40g/L、葡萄糖45g/L、500ul/L AS、瓊脂12g/L；所述共培養(yǎng)的條件為：25～26℃暗培養(yǎng)4～5天；
SH基礎(chǔ)配方：硝酸鉀2.7g·L-1，硫酸鎂0.2g·L-1，磷酸二氫銨0.30g·L-1，氯化鈣160mg·L-1，甘氨酸2.1mg·L-1，肌醇110mg·L-1，鹽酸硫胺素0.5mg·L-1，鹽酸吡哆素0.78mg·L-1，煙酸0.55mg·L-1，乙二胺四乙酸鐵納28mg·L-1，六水氯化鈷0.16mg·L-1，五水硫酸銅0.35mg·L-1，硼酸8mg·L-1，碘化鉀1.6mg·L-1，一水硫酸錳15mg·L-1，二水鉬酸鈉0.12mg·L-1，七水硫酸鋅1.6mg·L-1
步驟6篩選階段：
把共培養(yǎng)時間到的材料取出，接種到篩選培養(yǎng)基上，一皿接種5-6排，每個材料間隔2cm左右，接種完以后，封口膜封口，放到培養(yǎng)間，25℃光照培養(yǎng)，培養(yǎng)期間隨時觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染后及時轉(zhuǎn)移未污染材料到新的培養(yǎng)基上，繼續(xù)光照培養(yǎng)，一般培養(yǎng)20天，大部分材料會死亡，少部分活下來并分化出小芽。篩選培養(yǎng)基成分為：SH基礎(chǔ)配方(同步驟5)、2，4-D 0.5mg/L、NAA 0.8mg/L、6-BA2.5mg/L、蔗糖40g/L、Hyg 30mg/L、carb350mg/L、cef 400mg/L、瓊脂11g/L。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度2400～2500lx，每天光照13～14h，25～26℃光照培養(yǎng)15～20天。
步驟7抗性苗分離階段：
將篩選后出芽的材料轉(zhuǎn)入抗性苗培養(yǎng)基中長大并檢測，未分化出小芽的材料繼續(xù)接種到新的篩選培養(yǎng)基中，抗性苗培養(yǎng)基即加入抗生素的普通SH培養(yǎng)基，其成分為：SH基礎(chǔ)配方(同步驟5)、蔗糖40g/L、carb 550mg/L、cef450mg/L、瓊脂15g/L。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度2300～2500lx，每天光照13～14h，24～26℃。
步驟8抗性苗生長階段：
抗性苗培養(yǎng)基中的抗性苗生長比較緩慢，需要更換一次新的抗性苗培養(yǎng)基才能較快速的生長，所以分離下來的抗性苗在生長15～20天以后需要更換一次新的抗性苗培養(yǎng)基，待其生長至40天即可移栽；培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃。然后進(jìn)行驗證，確認(rèn)得到陽性苗。
本實施例中愈傷組織形成頻率為96.5％，長綠苗的頻率為81.8％，生根率98.5％，轉(zhuǎn)化率52.7％，結(jié)果如表4、表5和表6所示。
表4
表5
表6
實施例3
分別改變侵染條件、共培養(yǎng)條件，具體結(jié)果如表7、8、9和10所示。
表7
說明：表中的轉(zhuǎn)化率是指共培養(yǎng)后，葉片就進(jìn)行GUS染色，得到的轉(zhuǎn)化率。(采用組織化學(xué)法檢測，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作為反應(yīng)底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若組織細(xì)胞發(fā)生了gus基因的轉(zhuǎn)化，并表達(dá)出Gus，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物。)
由表7可知：本發(fā)明提供的侵染條件和共培養(yǎng)條件可以使農(nóng)桿菌成功介導(dǎo)寬葉不死鳥，且轉(zhuǎn)化率較高。
其中，雖然共培養(yǎng)8～10天轉(zhuǎn)化率稍高一些，但是后期農(nóng)桿菌抑制不住，在篩選的時候全部死亡。共培養(yǎng)3～7天后，上篩選農(nóng)桿菌能抑制住，在篩選的時候農(nóng)桿菌污染比較少。
表8
說明：表中的轉(zhuǎn)化率是指共培養(yǎng)后，葉片就進(jìn)行GUS染色，得到的轉(zhuǎn)化率。(采用組織化學(xué)法檢測，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作為反應(yīng)底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若組織細(xì)胞發(fā)生了gus基因的轉(zhuǎn)化，并表達(dá)出Gus，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物。)
表8可以看出在合適的正空度下(0.5～0.9Kpa)，轉(zhuǎn)化率比較好。
表9
說明：表中的轉(zhuǎn)化率是指共培養(yǎng)后，葉片就進(jìn)行GUS染色，得到的轉(zhuǎn)化率。(采用組織化學(xué)法檢測，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作為反應(yīng)底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若組織細(xì)胞發(fā)生了gus基因的轉(zhuǎn)化，并表達(dá)出Gus，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物。)
表9可以看出在合適的侵染時間范圍內(nèi)(1h～4h)，轉(zhuǎn)化率比較好。時間過長，則會造成侵染過度，使得植物細(xì)胞死亡。
表10
說明：表中的轉(zhuǎn)化率是指共培養(yǎng)后，葉片就進(jìn)行GUS染色，得到的轉(zhuǎn)化率。(采用組織化學(xué)法檢測，以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)作為反應(yīng)底物，將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡。若組織細(xì)胞發(fā)生了gus基因的轉(zhuǎn)化，并表達(dá)出Gus，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物。)
表10可以看出，缺少某一種激素培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)化率都偏低。