本發(fā)明涉及蛙的多倍體繁育方法，具體涉及蛙三倍體純系高效育成方法。

背景技術：

蛙，常見的有虎紋蛙、棘胸蛙等，無尾，善于跳躍，屬于兩棲動物的蛙科。三倍體蛙的不育特征，使其在生長速度、抗逆性、抗病性以及肉質等方面表現出更為顯著的優(yōu)勢?，F有技術中，要獲得三倍體不育蛙，最快捷有效的方法是通過四倍體與二倍體倍間雜交獲得，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度極高的四倍體魚系。目前為止尚未發(fā)現關于蛙雄性四倍體高效育成的報道，更未見用全雄四倍體與二倍體母本回交的先例。

技術實現要素：

針對上述現有技術存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種方法穩(wěn)定、種群純度高達100%的蛙三倍體純系高效育成方法。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

蛙三倍體純系高效育成方法，包括如下步驟：

（1）他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到蛙人工飼養(yǎng)飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為25～30g/kg喂養(yǎng)料，待用；

（2）投喂：在母蛙產卵前5～10天，按常規(guī)飼料投喂方法對母蛙進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8：00每100g母蛙投喂10～20g，下午6：00每100g母蛙投喂10～15g；至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄蛙放在一起，使其自然產卵交配受精，得受精卵，備用；

（3）熱休克處理：在第一次卵裂前3～5min，把步驟（2）的受精卵放入水溫為39～42℃、溶氧達5-8mg/l以上的水體中，保持3～5min；然后取出，放入常規(guī)孵化水槽中待用；

（4）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為80～140mg/l，睪酮的濃度為20～80mg/l；

（5）取步驟（3）處理后的受精卵放入按步驟（4）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡10～30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗成蝌蚪；

（6）取步驟（5）中的蝌蚪，投喂氯米芬幼體料；配比量為每kg幼體料加10～15g氯米芬，投喂量為每1000只投喂10～20g加有氯米芬的幼體料，直至變?yōu)橛淄?；從而獲得雄性蛙四倍體純系。

（7）取步驟（6）的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。

本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明中在母本中投喂他莫昔芬，起到抑制DNA復制和促雄性的雙重作用的同時，推延了受精卵第一次卵裂的時間（3-5min）、提高了所有受精卵第一次卵裂的同步程度（可達99%），為操作下一步提供時間保障和奠定了染色體加倍的基礎；2、在受精卵一次卵裂采用較短的熱休克處理時間，有效減少長時間熱休克對受精卵的破壞作用，提高受精卵的成活率；3、雌激素抑制劑溶液浸泡，進一步強化了雄性轉化率；4、蝌蚪繼續(xù)投喂氯米芬，再次強化與保證雄性的轉化率；5、用純系的雄性四倍體與原有的雌性二倍體回交，有效保證了三倍體的純度。因而通過此方法，可獲得100%的三倍體純系，提高了三倍體的育成率與出苗率，減少了育種與選種的麻煩，更主要是對自然水產品種種質和生態(tài)環(huán)境無污染。

具體實施方式

現結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步描述。

實施例一

虎紋蛙三倍體純系高效育成方法，包括如下步驟：

（1）他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到蛙人工飼養(yǎng)飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為30g/kg喂養(yǎng)料，待用；

（2）投喂：在母蛙產卵前5天，按常規(guī)飼料投喂方法對母蛙進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8：00每100g母蛙投喂20g，下午6：00每100g母蛙投喂15g；至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄蛙放在一起，使其自然產卵交配受精，得受精卵，備用；

（3）熱休克處理：第一次卵裂前3min，把步驟（2）的受精卵放入水溫為40℃、溶氧達5mg/l以上的水體中，保持5min；然后取出，放入常規(guī)孵化水槽中待用；

（4）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為80mg/l，睪酮的濃度為20mg/l；

（5）取步驟（3）處理后的受精卵放入按步驟（4）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗；

（6）取步驟（5）中的蝌蚪，投喂氯米芬幼體料；配比量為每kg幼體料加15g氯米芬，投喂量為每1000只20g幼體料，直至變?yōu)橛淄埽粡亩@得雄性蛙四倍體純系。

（7）取步驟（6）的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。

實施例二

棘胸蛙三倍體純系高效育成方法，包括如下步驟：

（1）他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到蛙人工飼養(yǎng)飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為25g/kg喂養(yǎng)料，待用；

（2）投喂：在母蛙產卵前10天，按常規(guī)飼料投喂方法對母蛙進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8：00每100g母蛙投喂20g，下午6：00每100g母蛙投喂15g；至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄蛙放在一起，使其自然產卵交配受精，得受精卵，備用；

（3）熱休克處理：處理后產的受精卵在第一次卵裂前5min，放入水溫為42℃、溶氧達8mg/l以上的水體中，保持3min；然后取出，放入常規(guī)孵化水槽中待用；

（4）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為120mg/l，睪酮的濃度為60mg/l；

（5）取步驟（3）處理后的受精卵放入按步驟（4）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡15s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗；

（6）取步驟（5）中的蝌蚪，投喂氯米芬幼體料；配比量為每kg幼體料加10g氯米芬，投喂量為每1000只10g幼體料，直至變?yōu)橛淄埽粡亩@得雄性蛙四倍體純系。

（7）取步驟（6）的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。

上述兩個實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護范圍，任意與本發(fā)明等同或相似的技術手段視為本發(fā)明的保護范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式及結果統計。

附：蛙三倍體育成結果統計

注：上述結果是在母蛙產卵前10天投喂他莫昔芬，一次卵裂前5min熱休克保持3min所取得的結果，雌激素抑制劑常溫浸泡15s，每萬尾投喂氯米芬0.1g所取得的結果。