本發(fā)明涉及植物培養(yǎng)繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蝴蝶蘭培養(yǎng)繁殖方法。

背景技術(shù)：

蝴蝶蘭是當(dāng)前國(guó)際花壇的名花，屬于蘭科蝴蝶蘭屬植物，原產(chǎn)地主要是亞熱帶、熱帶，天然分布在大洋洲、亞洲。蝴蝶蘭具有觀賞期長(zhǎng)、色澤豐富、花色秀麗以及體態(tài)優(yōu)美輕盈等特點(diǎn)，也被人們稱(chēng)為“洋蘭皇后”，在蘭科植物中是一種最普及、最廣泛的栽培種類(lèi)，具有很高的商業(yè)價(jià)值，是國(guó)際四大觀賞熱帶蘭的一種。蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，側(cè)枝發(fā)育非常少，因此很難常規(guī)進(jìn)行分株繁殖，而且很少形成種子，種子發(fā)育也比較困難，基本上在自然條件下萌發(fā)的難度比較大，因此蝴蝶蘭高效繁殖的主要手段就是組織培養(yǎng)。國(guó)外一些發(fā)達(dá)國(guó)家采用工廠化育苗技術(shù)以及組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，不僅可以創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也培育了很多優(yōu)良品種，然而我國(guó)關(guān)于蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的快繁技術(shù)研究仍然處于初級(jí)階段，在很大程度上阻礙了蝴蝶蘭的規(guī)模化生產(chǎn)。同時(shí)越來(lái)越多的蝴蝶蘭應(yīng)用于切花之中，這就急需要一種快速培養(yǎng)繁殖的方法，從而推動(dòng)蝴蝶蘭商業(yè)性發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)繁殖快、成苗率高的蝴蝶蘭培養(yǎng)繁殖方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種蝴蝶蘭培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟：

(1)材料選?。哼x取無(wú)病蟲(chóng)害長(zhǎng)勢(shì)良好的蝴蝶蘭，挑選植株中外形呈筍狀、花苞和分叉始露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗，切取花梗中部節(jié)位上的花梗芽作為外植體；

(2)材料消毒：將外植體放置在洗潔精水中浸泡10min進(jìn)行預(yù)處理，然后用自來(lái)水沖洗30min，沖洗后用無(wú)菌濾紙吸干外植體上的水珠，然后用體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精棉球擦拭外植體表面，用滅菌水清洗2～3遍，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的氯化汞溶液浸泡外植體，浸泡時(shí)間為10min，浸泡后用無(wú)菌水沖洗3～4遍，剝?nèi)グ?，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的氯化汞溶液浸泡外植體，浸泡時(shí)間為8min，浸泡后用無(wú)菌水沖洗3～4遍；

(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)：切除消毒后外植體的兩端切口，將外植體接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為22～25d，前10天為暗培養(yǎng)，剩余時(shí)間為光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度均為23～25℃，光培養(yǎng)時(shí)，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為2000～2500lx；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+1～3mg/L 6-BA+0.5～1.5mg/L TDZ+0.1～0.3mg/L NAA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉膠；預(yù)培養(yǎng)后，再將培養(yǎng)材料整體移入新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為15～20d，培養(yǎng)溫度23～25℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為2000～2500lx；

(4)增殖繼代培養(yǎng)：將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的外植體放入增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+2.5～3.5mg/L 6-BA+0.2～0.4mg/L NAA+0.1～0.3mg/L TDZ+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉膠+8～12％椰汁，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度23～25℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為2000～2500lx；

(5)壯苗培養(yǎng)：增殖繼代培養(yǎng)后，選擇高2cm以上、外植體上有明顯突起的小苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+2.5～3.5mg/L6-BA+0.4～0.6mg/L NAA+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉膠+8～12％香蕉汁，培養(yǎng)時(shí)間為15～20d，培養(yǎng)溫度23～25℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為2000～2500lx；培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，再向壯苗培養(yǎng)基中加入0.3％活性炭，培養(yǎng)溫度27～29℃，光照時(shí)間為15h/d，光照強(qiáng)度為2500～3000lx；

(6)移栽：當(dāng)試管苗生長(zhǎng)至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時(shí)，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開(kāi)瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養(yǎng)苗，用清水洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，清洗時(shí)注意不要損害根部，然后移栽至水苔和腐殖土質(zhì)量比為1:2的混合基質(zhì)中，保持濕度和通風(fēng)，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃。

如上所述的一種蝴蝶蘭培養(yǎng)繁殖方法，進(jìn)一步說(shuō)明為，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+2mg/L 6-BA+1mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3+25g/L白砂糖+7g/L卡拉膠。

如上所述的一種蝴蝶蘭培養(yǎng)繁殖方法，進(jìn)一步說(shuō)明為，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+0.2mg/L TDZ+25g/L白砂糖+7g/L卡拉膠+10％椰汁。

如上所述的一種蝴蝶蘭培養(yǎng)繁殖方法，進(jìn)一步說(shuō)明為，所述壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25g/L白砂糖+7g/L卡拉膠+10％香蕉汁。

本發(fā)明的有益效果是：通過(guò)本發(fā)明能對(duì)蝴蝶蘭進(jìn)行快速培養(yǎng)繁殖，并且培養(yǎng)后的蝴蝶蘭苗株發(fā)病率低，成苗率高，苗株品質(zhì)好，栽培后適應(yīng)性強(qiáng)，通過(guò)生物技術(shù)手段在短時(shí)間內(nèi)，滿(mǎn)足了商業(yè)化生產(chǎn)的需求，為企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)蝴蝶蘭提供了技術(shù)支持，同時(shí)滿(mǎn)足了蝴蝶蘭切花市場(chǎng)的需要。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式做進(jìn)一步的闡述。

本發(fā)明提供的一種蝴蝶蘭培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟：

(1)材料選?。哼x取無(wú)病蟲(chóng)害長(zhǎng)勢(shì)良好的蝴蝶蘭，挑選植株中外形呈筍狀、花苞和分叉始露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗，切取花梗中部節(jié)位上的花梗芽作為外植體；

我們將花苞和分叉始露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗選為樣本1，將花苞和分叉完全未露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗作為樣本2，將花苞和分叉完全露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗作為樣本3，分別取樣本上不同部位的花梗芽做外植體，放置在普通誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)；

表1為不同樣本對(duì)花梗芽的誘導(dǎo)影響

由表1可以看出，不同樣本上的花梗芽誘導(dǎo)率存在明顯差異，樣本1的花梗芽生產(chǎn)力強(qiáng)，其枯死率都很低，且成活率和誘導(dǎo)率最高，最適合做外植體誘導(dǎo)材料；樣本2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化難，枯死率都很高，且成活率和誘導(dǎo)率都很低，不適合做外植體誘導(dǎo)材料；樣本3中隨著花梗側(cè)芽和花朵的生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)逐漸轉(zhuǎn)移到花梗上部的分叉和花朵上，花梗上的花梗芽生長(zhǎng)勢(shì)弱，枯死率高，且成活率和誘導(dǎo)率低，也不適合做誘導(dǎo)材料；

從表1中還可以看出，同一樣本中花梗上不同節(jié)位的花梗芽誘導(dǎo)也不相同，基部成熟節(jié)位的花梗芽大多比較瘦弱，生長(zhǎng)力弱，枯死率較高，誘導(dǎo)率較低；上部幼嫩節(jié)位的花梗芽雖然相比基部的花梗芽成活率高，但幼嫩花梗抽生的新芽大都細(xì)長(zhǎng)，芽體瘦弱，尾部常發(fā)生枯死；中部節(jié)位的花梗芽，生長(zhǎng)力強(qiáng)，枯死率較低，誘導(dǎo)率高，是最好的誘導(dǎo)材料；故挑選植株中外形呈筍狀、花苞和分叉始露出花梗苞片、高在50～70cm的花梗，切取花梗中部節(jié)位上的花梗芽作為外植體，能有效提高生產(chǎn)率。

(2)材料消毒：將外植體放置在洗潔精水中浸泡10min進(jìn)行預(yù)處理，然后用自來(lái)水沖洗30min，沖洗后用無(wú)菌濾紙吸干外植體上的水珠，然后用體積分?jǐn)?shù)為75％的酒精棉球擦拭外植體表面，用滅菌水清洗2～3遍，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的氯化汞溶液浸泡外植體，浸泡時(shí)間為10min，浸泡后用無(wú)菌水沖洗3～4遍，剝?nèi)グ?，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的氯化汞溶液浸泡外植體，浸泡時(shí)間為8min，浸泡后用無(wú)菌水沖洗3～4遍；采用氯化汞溶液分兩次消毒，并且兩次消毒的氯化汞溶液濃度不同，這樣可以能較好起到滅菌作用的同時(shí)而又對(duì)其活性影響較??；

表2為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化汞溶液及操作次數(shù)對(duì)花梗芽的誘導(dǎo)影響

由表2可以看出采用氯化汞溶液分兩次消毒，其污染率低，且消毒后花梗芽的成活率高，初次采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的氯化汞溶液浸泡外植體，能有效殺滅大部分細(xì)菌，使外植體得到有效保護(hù)，無(wú)菌水沖洗后，剝?nèi)グ?，在用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的氯化汞溶液浸泡外植體，保護(hù)外植體活性的同時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行殺菌。

(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)：切除消毒后外植體的兩端切口，將外植體接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為22～25d，前10天為暗培養(yǎng)，剩余時(shí)間為光培養(yǎng)，通過(guò)一段時(shí)間的暗培養(yǎng)，能一定程度上有效抑制褐化現(xiàn)象，培養(yǎng)溫度均為23～25℃，光培養(yǎng)時(shí)，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為2000～2500lx；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+1～3mg/L 6-BA+0.5～1.5mg/L TDZ+0.1～0.3mg/L NAA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉膠，通過(guò)加入VC和GA3，能有效遏制培養(yǎng)材料的褐化；預(yù)培養(yǎng)后，再將培養(yǎng)材料整體移入新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為15～20d，培養(yǎng)溫度23～25℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為2000～2500lx；

表3為誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分及用量

作為優(yōu)選，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+2mg/L 6-BA+1mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3+25g/L白砂糖+7g/L卡拉膠，即為表3中誘導(dǎo)培養(yǎng)基1的成分及用量；

表4為外植體褐化程度和暗處理之間的試驗(yàn)關(guān)系，將外植體接種在表3中誘導(dǎo)培養(yǎng)基1上進(jìn)行培養(yǎng)

由表4可知，隨著時(shí)間的推移，經(jīng)過(guò)不同處理都會(huì)有一定的褐化現(xiàn)象，但是經(jīng)過(guò)暗培養(yǎng)后，褐化率能降低，由此可知，暗培養(yǎng)能在一定程度上抑制褐化現(xiàn)象的發(fā)生。

(4)增殖繼代培養(yǎng)：將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的外植體放入增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+2.5～3.5mg/L 6-BA+0.2～0.4mg/L NAA+0.1～0.3mg/L TDZ+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉膠+8～12％椰汁，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度23～25℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為2000～2500lx；

表5為增殖培養(yǎng)基成分及用量

作為優(yōu)選，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+0.2mg/L TDZ+25g/L白砂糖+7g/L卡拉膠+10％椰汁，即為表5中增殖培養(yǎng)基1的成分及用量，采用1/2MS培養(yǎng)基，適當(dāng)降低了大量元素濃度，更有利于提高蝴蝶蘭花梗芽的誘導(dǎo)增殖率。

(5)壯苗培養(yǎng)：增殖繼代培養(yǎng)后，選擇高2cm以上、外植體上有明顯突起的小苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+2.5～3.5mg/L6-BA+0.4～0.6mg/L NAA+22～27g/L白砂糖+5～9g/L卡拉膠+8～12％香蕉汁，培養(yǎng)時(shí)間為15～20d，培養(yǎng)溫度23～25℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為2000～2500lx；培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，再向壯苗培養(yǎng)基中加入0.3％活性炭，培養(yǎng)溫度27～29℃，光照時(shí)間為15h/d，光照強(qiáng)度為2500～3000lx；

表6為壯苗培養(yǎng)基成分及用量

作為優(yōu)選，所述壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25g/L白砂糖+7g/L卡拉膠+10％香蕉汁，即為表6中壯苗培養(yǎng)基1的成分及用量。

(6)移栽：當(dāng)試管苗生長(zhǎng)至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時(shí)，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開(kāi)瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養(yǎng)苗，用清水洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，清洗時(shí)注意不要損害根部，然后移栽至水苔和腐殖土質(zhì)量比為1:2的混合基質(zhì)中，保持濕度和通風(fēng)，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃。通過(guò)本發(fā)明能對(duì)蝴蝶蘭進(jìn)行快速培養(yǎng)繁殖，并且培養(yǎng)后的蝴蝶蘭苗株發(fā)病率低，成苗率高，苗株品質(zhì)好，栽培后適應(yīng)性強(qiáng)，通過(guò)生物技術(shù)手段在短時(shí)間內(nèi)，滿(mǎn)足了商業(yè)化生產(chǎn)的需求，為企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)蝴蝶蘭提供了技術(shù)支持，同時(shí)滿(mǎn)足了蝴蝶蘭切花市場(chǎng)的需要。

本發(fā)明并不限于上述實(shí)例，在本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員不經(jīng)創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種變形或修改均受本專(zhuān)利的保護(hù)。