本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領域，具體為一種蕙蘭種子萌發(fā)快繁方法，通過蘭花種質(zhì)資源種子的離體萌發(fā)，達到快速生產(chǎn)幼苗的目的。

背景技術(shù)：

蘭花，中國的傳統(tǒng)名花，種質(zhì)資源豐富，分布廣泛，并具有較高的觀賞價值。其繁殖方法一般為分株繁殖，3-4年才能進行一次，繁殖速度較慢，難以滿足市場需要。蘭花種子雖然很小，但數(shù)量驚人，一個蒴果中有幾百萬粒種子。蘭花種子數(shù)量很大，但由于蘭花種子非常細小、呈粉狀，只有在顯微鏡下才能看清楚它的結(jié)構(gòu)。它沒有胚乳，只有一個簡單的胚，外面包著疏松、透明、不易透水的種皮。胚內(nèi)含有很少的營養(yǎng)物質(zhì)，絕大部分為脂類物質(zhì)，自然條件下存在的蘭花種子，只有被適宜的真菌感染才能成功地萌發(fā)，發(fā)芽率都很低，一般不超過5％。因此，研究蘭花種子離體萌發(fā)技術(shù)一直是科研工作者研究的重點，也是利用種子快速繁殖幼苗是一條切實可行的途徑。隨著科研工作者研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)在沒有真菌共生通過提供外源營養(yǎng)物質(zhì)的情況下，蘭花種子也能萌發(fā)，但普遍存在萌發(fā)率低，成苗率低的困難，不能滿足大規(guī)模商品化生產(chǎn)。

蕙蘭(Cymbidiumfaberi)蕙蘭又稱九子蘭、九節(jié)蘭、夏蘭，是中國蘭花的一大種類，是栽培最久和最普及的蘭花之一。因其株型飄逸，香氣馥郁，花形優(yōu)美，在東南亞地區(qū)被視為高檔的盆栽花卉。蕙蘭自然生長在山坡樹林中，多數(shù)栽培品種均是由野生種馴化或自然變異篩選而來。從資源上來說，由于對野生國蘭資源的大量采挖，天然資源已遭到了大量破壞，可采集的野生資源越來越少，再加上自身繁殖速度極其緩慢，我國野生蕙蘭資源日趨緊缺，有些珍稀品種已瀕臨滅絕。只有通過有計劃的培育、繁殖發(fā)展瀕危、特有種類，才能避免該物種滅絕，并且滿足當前國蘭日益蓬勃的市場需求。通過種子播種萌發(fā)可以快速獲得繁殖后代及篩選優(yōu)良種性，進行物種繁衍和有效保護。種子無菌播種技術(shù)即在人工調(diào)控的環(huán)境下加速促進種子萌發(fā)及快速繁殖，尤其適合一些自然條件下萌發(fā)率極低的植物種子。目前已有適應于其它蘭花離體萌發(fā)的成功案例，但是蘭花對萌發(fā)條件要求苛刻，特別是蕙蘭，對培養(yǎng)基的成分、激素種類、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間尤為敏感，現(xiàn)有的適應于蕙蘭的方案較少，專利名稱為“一種適宜蕙蘭種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基組合物及其方法”，申請?zhí)枮椤?00910101739.0”的專利公開了使用改良的MS培養(yǎng)基培育蕙蘭的技術(shù)方案，但依然存在萌發(fā)率低，繁殖速度慢，不能滿足規(guī)?；a(chǎn)的弊端。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種蕙蘭種子萌發(fā)快繁方法，通過給蕙蘭種子提供適宜的營養(yǎng)成分和適量的激素誘導原球莖，建立原球莖快速無性繁殖體系，進一步分化成幼苗，本發(fā)明的方法能夠縮短成苗時間，快速、有效提高繁殖速率，培育壯苗，實現(xiàn)快速的大規(guī)模商品化生產(chǎn)。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種蕙蘭種子萌發(fā)及快繁方法，包括先使用種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)后使用原球莖分化成苗培養(yǎng)基培養(yǎng)；所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基為含有0.5-1.0mg/L的6-芐基嘌呤的VW培養(yǎng)基；所述原球莖分化成苗培養(yǎng)基為含有質(zhì)量分數(shù)為10％的香蕉汁的KC培養(yǎng)基。

本發(fā)明還具有以下附加技術(shù)特征：

優(yōu)選的，所述使用種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)條件為：溫度25℃，光照強度2000lx，每天光照8小時；待原球莖重達4-6mg之后，溫度增加到28℃，光照為強度改為3000lx，每天光照12小時。

優(yōu)選的，所述原球莖分化成苗培養(yǎng)基培養(yǎng)條件為：光照強度3000lx，每天光照10小時。

優(yōu)選的，所述溫度為25℃。

優(yōu)選的，所述光照強度改為3000lx后，每天光照時間為12小時。

優(yōu)選的，該方法具體包括以下步驟：采收種子已經(jīng)成熟但尚未開裂的蒴果消毒后，剖開蒴果取出種子涂抹于權(quán)利要求1所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待原球莖分化成幼苗后轉(zhuǎn)移至權(quán)利要求1所述的原球莖分化成苗培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至長出幼苗即得。

優(yōu)選的，所述消毒為首先用水進行表面清洗，然后用質(zhì)量分數(shù)為70％酒精消毒30秒后，再用質(zhì)量分數(shù)為0.1％的氯化汞水溶液消毒10分鐘，用無菌水洗滌3-5次，晾干或用濾紙吸干表面水分。

優(yōu)選的，所述蕙蘭為紫荊祥云、老染字或下山蕙蘭與紫荊祥云雜交品種。

優(yōu)選的，所述老染字品種在消毒前還包括將其置于冰箱5℃條件下冷處理15天的步驟。

優(yōu)選的，培養(yǎng)老染字時，所述的VW培養(yǎng)基中還包括0.5g/L萘乙酸。

本發(fā)明的方法具體為：

(1)消毒：蘭花通過人工授粉后4個月左右，采收種子已經(jīng)成熟但尚未開裂的蒴果，首先用自來水或洗衣粉溶液進行表面清洗，然后用70％酒精消毒30秒后，再用0.1％的氯化汞溶液消毒10分鐘，用無菌水洗滌3-5次，晾干或用濾紙吸干表面水分；

(2)配置種子萌發(fā)培養(yǎng)基：提供的外源營養(yǎng)成分為Vacin和Went(VW)培養(yǎng)基，內(nèi)含碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽(包括微量元素)以及維生素等，配以0.5-1.0mg/L的激素(6-芐基嘌呤)，組成種子萌發(fā)培養(yǎng)培養(yǎng)基；

(3)萌發(fā)培養(yǎng)：用消毒過的手術(shù)刀片將蒴果剖開，用鑷子、接種針等工具輕輕取出種子，均勻涂抹在試管或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的表面，以大多數(shù)種子都能接觸到培養(yǎng)基為宜，避免埋入培養(yǎng)基中，引起窒息死亡，及時密封并做好標記，將帶有培養(yǎng)物的試管或培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度25℃左右，光照強度2000lx，每天光照8小時；培養(yǎng)約3-10個月后，種子萌發(fā)時間，因品種不同常有較大差異，待胚明顯增長到谷粒大小后，重量約5mg左右，培養(yǎng)溫度再增加到28℃，光照強度3000lx，每天光照12小時。萌發(fā)時先是胚逐漸膨大，初為淡黃色，后逐漸變?yōu)辄S綠色，直至綠色，再由胚長出原球莖；

(4)分化成苗培養(yǎng)：原球莖分化成幼苗使用分化培養(yǎng)基，采用Knudson C(KC)培養(yǎng)基，輔以10％的香蕉汁；將種子生長出的原球莖用鑷子或其他工具轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(KC)上，由原球莖產(chǎn)生幼苗。通常接種20天后，第l枚葉片從原球莖頂部中間生出，待出現(xiàn)第2～3片葉時，原球莖伸長，并且有第1條根生出；30天后，等到幼苗有2-3條根，5-6片葉時，將幼苗移栽在育苗基質(zhì)中，生長較弱的個體可轉(zhuǎn)換到分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

本發(fā)明的方法適應于所有蘭花品種，尤其可以改善最難萌發(fā)的蕙蘭屬的蘭花，經(jīng)試驗證明，本發(fā)明的方法可以較快的促進蕙蘭種子的萌發(fā)，明顯縮短培養(yǎng)蕙蘭的時間，能快速建立無性繁殖系，短時間內(nèi)培育出大量的健壯試管苗。不同的蕙蘭屬的品種在萌發(fā)培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間有較大差別，最少是紫荊祥云為3個月，最長時間的是較難萌發(fā)的老染字。

其中，培養(yǎng)基配方表1：

表1VW及KC培養(yǎng)基配方

本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點在于：

1)通過在溫室控制溫度、光照及營養(yǎng)條件，加速授粉后種子的成熟速度，一般在授粉后4個月即可達到9成熟的種子，比現(xiàn)有技術(shù)提前2-3個月；

2)種子在培養(yǎng)基上萌發(fā)70天左右，由胚發(fā)育成原球莖，原球莖繼續(xù)擴繁、增殖，建立快速無性繁殖體系，繁殖到一定數(shù)量后，再由原球莖分化成大量蘭花試管苗；

3)分化培養(yǎng)基添加香蕉汁后，由于香蕉汁富含多種維生素及其它營養(yǎng)成分，分化后的幼苗生長速度快，植株健壯；

4)本發(fā)明的方法能夠顯著提高蕙蘭種子萌發(fā)、繁殖速度，尤其是對于紫荊祥云以及難以萌發(fā)、培養(yǎng)的老染字品種，有助于縮短培養(yǎng)時間，培養(yǎng)技術(shù)簡單，為其商業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造條件，滿足供不應求的蘭花市場。

說明書附圖

圖1為將蕙蘭-紫荊祥云種子均勻涂抹在培養(yǎng)基表面的觀察圖；

圖2為圖1中的蕙蘭-紫荊祥云種子培養(yǎng)3個月誘導出原球莖的觀察圖；

圖3為圖2中的蕙蘭-紫荊祥云種子原球莖培養(yǎng)30天時進一步增殖、增大的觀察圖；

圖4為圖3中的蕙蘭-紫荊祥云種子原球莖分化成幼苗后20天的觀察圖。

具體實施方式

以下公開本發(fā)明的一些實施例，本領域技術(shù)人員可以根據(jù)本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。

實施例1

培養(yǎng)蕙蘭一批次：蕙蘭屬的紫荊祥云

(1)消毒：紫荊祥云人工輔助自花授粉后，在溫室中控制溫度為20-25℃，自然光每天光照8-10小時，增施鉀肥，輔以葉面肥料，授粉120天后，蒴果中的種子基本成熟，采收種子已經(jīng)成熟但尚未開裂的蒴果，首先用自來水或洗衣粉溶液進行表面清洗，然后用70％酒精消毒30秒后，再用0.1％的氯化汞溶液消毒10分鐘，用無菌水洗滌3-5次，晾干或用濾紙吸干表面水分；

(2)配置種子萌發(fā)培養(yǎng)基：提供的外源營養(yǎng)成分為Vacin和Went(VW)培養(yǎng)基，內(nèi)含碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽(包括微量元素)以及維生素等，配以0.5g/L的激素(6-芐基嘌呤)，組成種子萌發(fā)培養(yǎng)培養(yǎng)基；

(3)萌發(fā)培養(yǎng)：用消毒過的手術(shù)刀片將蒴果剖開，用鑷子、接種針等工具輕輕取出種子，均勻涂抹在試管或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的表面，以大多數(shù)種子都能接觸到培養(yǎng)基為宜，避免埋入培養(yǎng)基中，引起窒息死亡，及時密封并做好標記，將帶有培養(yǎng)物的試管或培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度25℃左右，光照強度2000lx，每天光照8小時；培養(yǎng)70天，胚逐漸膨大，初為淡黃色，后逐漸變?yōu)辄S綠色，待生長到谷粒大小，約5mg后，再增加溫度到28℃，光照強度3000lx，每天12小時，種子培養(yǎng)90天后，原球莖慢慢變成綠色，不斷增值成簇生狀原球莖；

(4)分化成苗培養(yǎng)：原球莖分化成幼苗使用分化培養(yǎng)基，采用表1中輔以質(zhì)量分數(shù)為10％香蕉汁的Knudson C(KC)培養(yǎng)基；將種子生長出的原球莖用鑷子或其他工具轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(KC)上，由原球莖產(chǎn)生幼苗，接種20天后，第l枚葉片從原球莖頂部中間生出，待出現(xiàn)第2～3片葉時，原球莖伸長，并且有第1條根生出；等到幼苗有2-3條根，5-6片葉時，將幼苗移栽在育苗基質(zhì)中，則第一批蕙蘭苗育出，此時，成苗培養(yǎng)時間為30天，本批次的紫荊祥云從人工授粉萌到種子成熟、萌發(fā)、誘導成苗約240天。

實施例2

培養(yǎng)蕙蘭二批次：蕙蘭屬的名貴品種—老染字

(1)預處理：老染字通過人工自花授粉后130天后，采收種子已經(jīng)成熟但尚未開裂的蒴果，置于冰箱5℃條件下冷處理15天；

(2)消毒：首先用自來水或洗衣粉溶液進行表面清洗，然后用70％酒精消毒30秒后，再用0.1％的氯化汞溶液消毒10分鐘，用無菌水洗滌3-5次，晾干或用濾紙吸干表面水分

(3)配置種子萌發(fā)培養(yǎng)基：提供的外源營養(yǎng)成分為Vacin和Went(VW)培養(yǎng)基，內(nèi)含碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽(包括微量元素)以及維生素等，配以1.0g/L的激素(6-芐基嘌呤)+0.5g/L萘乙酸，組成種子萌發(fā)培養(yǎng)培養(yǎng)基；

(4)萌發(fā)培養(yǎng)：用消毒過的手術(shù)刀片將蒴果剖開，用鑷子、接種針等工具輕輕取出種子，均勻涂抹在試管或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的表面，以大多數(shù)種子都能接觸到培養(yǎng)基為宜，避免埋入培養(yǎng)基中，引起窒息死亡，及時密封并做好標記，將帶有培養(yǎng)物的試管或培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度25℃左右，光照強度2000lx，每天光照8小時；培養(yǎng)300天胚逐漸膨大，初為淡黃色，后逐漸變?yōu)辄S綠色，待生長到谷粒大小，約5mg后，再增加到光照強度3000lx，每天光照12小時，320天后，原球莖慢慢變成綠色，不斷增值成簇生狀原球莖，在培養(yǎng)過程中應及時補充無菌水，以防培養(yǎng)基失水、干燥；

(5)分化成苗培養(yǎng)：原球莖分化成幼苗使用分化培養(yǎng)基，采用表1中輔以質(zhì)量分數(shù)為10％香蕉汁的Knudson C(KC)培養(yǎng)基；將種子生長出的原球莖用鑷子或其他工具轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(KC)上，由原球莖產(chǎn)生幼苗，接種20天后，第l枚葉片從原球莖頂部中間生出，待出現(xiàn)第2～3片葉時，原球莖伸長，并且有第1條根生出；等到幼苗有2-3條根，5-6片葉時，將幼苗移栽在育苗基質(zhì)中，則第二批蕙蘭苗育出，此時，培養(yǎng)時間為30天，本批次的老染字從從人工授粉萌到種子成熟、萌發(fā)、誘導成苗約495天，本發(fā)明在誘導分化培養(yǎng)基KC中添加了總質(zhì)量為10％的香蕉汁，香蕉汁富含維生素及其它有機養(yǎng)分，給幼苗生長提供全面、充足的養(yǎng)分，培育出的試管苗健康、健壯，有利于下一步試管苗移栽，提高移栽成活率。

實施例3

培養(yǎng)蕙蘭三批次：下山蕙蘭為母本、紫荊祥云做父本的雜交種子

(1)消毒：以下山蕙蘭為母本、紫荊祥云做父本，通過人工輔助手段將父本紫荊祥云的花粉授到下山蕙蘭母本的柱頭上，在溫室通過提高溫度、控制光照、增施有機養(yǎng)分等措施，授粉120天后，蒴果中的種子基本成熟，采收種子已經(jīng)成熟但尚未開裂的蒴果，首先用自來水或洗衣粉溶液進行表面清洗，然后用70％酒精消毒30秒后，再用0.1％的氯化汞溶液消毒10分鐘，用無菌水洗滌3-5次，晾干或用濾紙吸干表面水分；

(2)配置種子萌發(fā)培養(yǎng)基：提供的外源營養(yǎng)成分為Vacin和Went(VW)培養(yǎng)基，內(nèi)含碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽(包括微量元素)以及維生素等，配以0.5g/L的激素(6-芐基嘌呤)，組成種子萌發(fā)培養(yǎng)培養(yǎng)基；

(3)萌發(fā)培養(yǎng)：用消毒過的手術(shù)刀片將蒴果剖開，用鑷子、接種針等工具輕輕取出種子，均勻涂抹在試管或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的表面，以大多數(shù)種子都能接觸到培養(yǎng)基為宜，避免埋入培養(yǎng)基中，引起窒息死亡，及時密封并做好標記，將帶有培養(yǎng)物的試管或培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度25℃左右，光照強度2000lx，每天光照8小時；培養(yǎng)70天，胚逐漸膨大，初為淡黃色，后逐漸變?yōu)辄S綠色，待生長到谷粒大小，約5mg后，再增加溫度到28℃，光照強度3000lx，每天12小時，種子培養(yǎng)90天后，原球莖慢慢變成綠色，不斷增值成簇生狀原球莖；

(4)分化成苗培養(yǎng)：原球莖分化成幼苗使用分化培養(yǎng)基，采用表1中輔以質(zhì)量分數(shù)為10％香蕉汁的Knudson C(KC)培養(yǎng)基；將種子生長出的原球莖用鑷子或其他工具轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(KC)上，由原球莖產(chǎn)生幼苗，接種20天后，第l枚葉片從原球莖頂部中間生出，待出現(xiàn)第2～3片葉時，原球莖伸長，并且有第1條根生出；等到幼苗有2-3條根，5-6片葉時，將幼苗移栽在育苗基質(zhì)中，則第一批蕙蘭苗育出，此時，成苗培養(yǎng)時間為30天，本批次的蕙蘭雜交種從人工授粉萌到種子成熟、萌發(fā)、誘導成苗約240天。

對比例1

按照現(xiàn)有專利：名稱為“一種適宜蕙蘭種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基組合物及其方法”，申請?zhí)枮椤?00910101739.0”中的方法對紫荊祥云進行培養(yǎng)，統(tǒng)計成苗時間，從萌發(fā)培養(yǎng)到成苗時間為170天，多于本申請實施例1中從種子萌發(fā)到誘導出苗的120天，從授粉算起則為350天，顯著多于實施例1中的240天。

對比例2

按照現(xiàn)有專利：名稱為“一種適宜蕙蘭種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基組合物及其方法”，申請?zhí)枮椤?00910101739.0”中的方法對老染字進行培養(yǎng)，統(tǒng)計成苗時間，從萌發(fā)培養(yǎng)到成苗時間為390天，多于本申請實施例1中從種子萌發(fā)到誘導出苗的350天，從授粉算起則為590天，顯著多于實施例1中的495天。老染字為蕙蘭中的名貴品種，由于其萌發(fā)率低，萌發(fā)時間長，培養(yǎng)技術(shù)復雜，也是蘭花種較難培養(yǎng)的品種，實施例2顯著縮短了老染字的培養(yǎng)時間，培養(yǎng)技術(shù)簡單，為其商業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造條件。

對比例3

本發(fā)明在原球莖的增殖過程中，在培養(yǎng)溫度為28℃，光照強度3000lx，每天光照12小時，原球莖增殖速度大大提高，比傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)(MS培養(yǎng)基)每30天繼代培養(yǎng)一次，縮短為20天繼代培養(yǎng)一次，對建立原球莖快速無性繁殖體系，培育大量試管苗，提供技術(shù)支撐，為滿足市場需求提供充足的蘭花資源。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。