本發(fā)明涉及植物無(wú)毒培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蝴蝶蘭無(wú)毒苗培養(yǎng)繁殖方法。

背景技術(shù)：

蝴蝶蘭是當(dāng)前國(guó)際花壇的名花，屬于蘭科蝴蝶蘭屬植物，原產(chǎn)地主要是亞熱帶、熱帶，天然分布在大洋洲、亞洲。蝴蝶蘭具有觀(guān)賞期長(zhǎng)、色澤豐富、花色秀麗以及體態(tài)優(yōu)美輕盈等特點(diǎn)，也被人們稱(chēng)為“洋蘭皇后”，在蘭科植物中是一種最普及、最廣泛的栽培種類(lèi)，具有很高的商業(yè)價(jià)值，是國(guó)際四大觀(guān)賞熱帶蘭的一種。蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，側(cè)枝發(fā)育非常少，因此很難常規(guī)進(jìn)行分株繁殖，而且很少形成種子，種子發(fā)育也比較困難，基本上在自然條件下萌發(fā)的難度比較大，因此蝴蝶蘭高效繁殖的主要手段就是組織培養(yǎng)。

但是采用組織培養(yǎng)帶來(lái)快速繁殖的同時(shí)，引發(fā)的病毒傳播也越來(lái)越嚴(yán)重，嚴(yán)重危害蝴蝶蘭的病毒主要有建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒，病毒傳播嚴(yán)重制約了蘭花產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，病毒可造成植株葉斑、壞死以及花朵變色、畸形等癥狀，嚴(yán)重影響其品質(zhì)，目前尚無(wú)確切的藥物能有效防治病毒的危害與傳播，因此繁殖蝴蝶蘭無(wú)毒苗是產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必經(jīng)之路，但是其他蘭花品種的方法又不能直接運(yùn)用到蝴蝶蘭身上，因此需要獨(dú)立開(kāi)發(fā)一種針對(duì)蝴蝶蘭培養(yǎng)無(wú)毒苗的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種蝴蝶蘭無(wú)毒苗培養(yǎng)繁殖方法，使培養(yǎng)后的蝴蝶蘭苗株品質(zhì)好、脫毒率高且長(zhǎng)勢(shì)健壯，實(shí)現(xiàn)蝴蝶蘭的無(wú)病毒栽培。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種蝴蝶蘭無(wú)毒苗培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟：

(1)植株熱處理：將長(zhǎng)勢(shì)良好的蝴蝶蘭放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，培養(yǎng)箱內(nèi)濕度為80～90％，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度開(kāi)始時(shí)為30℃，每隔一天上升1℃，直至38℃，培養(yǎng)時(shí)間為22～25d，光照時(shí)間為16h/d，光照強(qiáng)度為3000～5000lx；

(2)材料選?。簩⑸鲜鰺崽幚砗蟮暮m從培養(yǎng)箱中取出，切取蝴蝶蘭的莖尖；

(3)材料消毒：將上述切取的莖尖用清水沖洗干凈，沖洗后剝?nèi)ネ鈱尤~片，在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精浸泡20～30s，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒5～6min，每次用氯化汞溶液消毒后用無(wú)菌水漂洗5次，并用消毒濾紙吸干表面水分；

(4)材料預(yù)處理：將消毒后的蝴蝶蘭莖尖浸泡在19～20mg/L病毒唑溶液中20min；

(5)組織培養(yǎng)：將預(yù)處理后的蝴蝶蘭莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，從而培養(yǎng)出蝴蝶蘭無(wú)毒苗。

如上所述的一種蝴蝶蘭無(wú)毒苗培養(yǎng)繁殖方法，進(jìn)一步說(shuō)明為，所述組織培養(yǎng)步驟包括以下子步驟：

(a)原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將材料預(yù)處理后的蝴蝶蘭莖尖在解剖鏡下剝離成長(zhǎng)度為0.5～1.0mm的莖段，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.3～0.7mg/L 6-BA+0.3～0.5mg/L NAA+10～15g/L蔗糖，pH值為5.4～5.5，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為1500～2000lx；

(b)增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的原球莖放入到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+3～5mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L NAA+0.1～0.2mg/L IBA+25～30g/L蔗糖+95～105g/L香蕉泥+95～105g/L馬鈴薯泥，pH值為5.4～5.5，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為1500～2000lx；

(c)壯苗培養(yǎng)：增殖繼代培養(yǎng)后，選擇高2cm以上、基部有明顯突起的小苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+0.3～0.7mg/L6-BA+0.3～0.5mg/L NAA+30～35g/L蔗糖，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時(shí)間為13h/d，光照強(qiáng)度為1800～21000lx；

(d)移栽：當(dāng)試管苗生長(zhǎng)至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時(shí)，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開(kāi)瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養(yǎng)苗，用清水洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，清洗時(shí)注意不要損害根部，然后移栽至培養(yǎng)基質(zhì)中，保持濕度和通風(fēng)，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃。

如上所述的一種蝴蝶蘭無(wú)毒苗培養(yǎng)繁殖方法，進(jìn)一步說(shuō)明為，所述材料消毒步驟中，每次用氯化汞溶液消毒時(shí)，向氯化汞溶液中加入3～4滴吐溫-20。

本發(fā)明的有益效果是：采用本方法能使培養(yǎng)后的蝴蝶蘭苗株發(fā)病率低，成苗率高，苗株品質(zhì)好，栽培后適應(yīng)性強(qiáng)，苗株長(zhǎng)勢(shì)良好，通過(guò)生物技術(shù)手段在短時(shí)間內(nèi)，滿(mǎn)足了商業(yè)化生產(chǎn)的需求，為企業(yè)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)蝴蝶蘭無(wú)毒苗提供了技術(shù)支持。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式做進(jìn)一步的闡述。

本發(fā)明提供了一種蝴蝶蘭無(wú)毒苗培養(yǎng)繁殖方法，從而培養(yǎng)蝴蝶蘭無(wú)毒苗，實(shí)現(xiàn)蝴蝶蘭的無(wú)病毒栽培，該方法包括以下步驟：

(1)植株熱處理：將長(zhǎng)勢(shì)良好的蝴蝶蘭放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，培養(yǎng)箱內(nèi)濕度為80～90％，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度開(kāi)始時(shí)為30℃，每隔一天上升1℃，直至38℃，培養(yǎng)時(shí)間為22～25d，光照時(shí)間為16h/d，光照強(qiáng)度為3000～5000lx；溫度呈階梯式增長(zhǎng)，具體是這樣的，第一天溫度為30℃，第二天溫度為31℃，第三天溫度為32℃，依次類(lèi)推，直到第九天第一天溫度為38℃，剩余的培養(yǎng)時(shí)間均為38℃，直至培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束。部分病毒在高溫條件下會(huì)失去活性，持續(xù)一定時(shí)間后，病毒含量不斷下降，經(jīng)過(guò)熱處理能在一定程度上脫掉部分病毒，蝴蝶蘭熱處理的溫度上限為38℃，超過(guò)38℃，會(huì)使蝴蝶蘭失去活性，甚至枯死，熱處理溫度采用階梯上升，能使蝴蝶蘭植物逐漸適應(yīng)溫度的變化，提高蝴蝶蘭。

(2)材料選取：將上述熱處理后的蝴蝶蘭從培養(yǎng)箱中取出，切取蝴蝶蘭的莖尖；植物病毒在植株體內(nèi)主要沿植物輸導(dǎo)組織蔓延發(fā)展，植物頂端分生組織沒(méi)有導(dǎo)管、篩管的分化，同時(shí)植物頂端細(xì)胞生活力強(qiáng)，能不斷分裂擺脫病毒的侵入，所以植物頂端分生細(xì)胞中一般不含病毒，切取蝴蝶蘭的莖尖進(jìn)行組培，從而可以獲得蝴蝶蘭無(wú)毒苗，大大降低蝴蝶蘭苗株的發(fā)病率。

(3)材料消毒：將上述切取的莖尖用清水沖洗干凈，沖洗后剝?nèi)ネ鈱尤~片，在超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精浸泡20～30s，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒5～6min，每次用氯化汞溶液消毒后用無(wú)菌水漂洗5次，并用消毒濾紙吸干表面水分；一般消毒用的0.1％氯化汞溶液滅菌效果不佳，而濃度較高的氯化汞溶液又易使莖尖失去活性，抑制誘導(dǎo)，而本培育方法采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的氯化汞溶液能較好起到滅菌作用而又對(duì)其活性影響較小，并且采用分2～3次操作，能更好的保護(hù)莖尖活性；作為優(yōu)選，每次用氯化汞溶液消毒時(shí)，向氯化汞溶液中加入3～4滴吐溫-20。

(4)材料預(yù)處理：將消毒后的蝴蝶蘭莖尖浸泡在19～20mg/L病毒唑溶液中20min；由于病毒唑通過(guò)抑制病毒核酸復(fù)制的方式來(lái)阻止病毒的增加，因其對(duì)核酸的復(fù)制過(guò)程有阻礙作用，所以采用病毒唑溶液來(lái)對(duì)蝴蝶蘭莖尖進(jìn)行預(yù)處理，從而增加蝴蝶蘭苗株的脫毒率。表1為病毒唑不同濃度和處理時(shí)間對(duì)蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)的影響：

從表1中可以看出，使用了病毒唑處理后，蝴蝶蘭芽尖死亡率基本都要高于未使用病毒唑處理的芽尖，這說(shuō)明病毒唑?qū)ρ考馍L(zhǎng)具有一定的抑制作用，但是經(jīng)過(guò)病毒唑處理后，脫毒率明顯增加，病毒唑濃度越高，脫毒率也越高，但是病毒唑濃度越高，死亡率也相應(yīng)增加，且長(zhǎng)勢(shì)越弱，因此選用對(duì)蝴蝶蘭莖尖采用19～20mg/L病毒唑溶液中浸泡20min。

(5)組織培養(yǎng)：將預(yù)處理后的蝴蝶蘭莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，從而培養(yǎng)出蝴蝶蘭無(wú)毒苗。所謂組織培養(yǎng)就是通過(guò)蝴蝶蘭莖尖經(jīng)誘導(dǎo)出原球莖后，在經(jīng)過(guò)增殖、壯苗等操作培養(yǎng)出苗株的過(guò)程。

所述組織培養(yǎng)包括以下子步驟：

(a)原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)：將材料預(yù)處理后的蝴蝶蘭莖尖在解剖鏡下剝離成長(zhǎng)度為0.5～1.0mm的莖段，然后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.3～0.7mg/L 6-BA+0.3～0.5mg/L NAA+10～15g/L蔗糖，pH值為5.4～5.5，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為1500～2000lx；表2為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的多種實(shí)施例：

(b)增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)出的原球莖放入到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基為：1/2MS+3～5mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L NAA+0.1～0.2mg/L IBA+25～30g/L蔗糖+95～105g/L香蕉泥+95～105g/L馬鈴薯泥，pH值為5.4～5.5，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時(shí)間為12h/d，光照強(qiáng)度為1500～2000lx；表3為增殖培養(yǎng)基的多種實(shí)施例：

(c)壯苗培養(yǎng)：增殖繼代培養(yǎng)后，選擇高2cm以上、基部有明顯突起的小苗轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+0.3～0.7mg/L6-BA+0.3～0.5mg/L NAA+30～35g/L蔗糖，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時(shí)間為13h/d，光照強(qiáng)度為1800～21000lx；表4為壯苗培養(yǎng)基的多種實(shí)施例：

(d)移栽：當(dāng)試管苗生長(zhǎng)至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時(shí)，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開(kāi)瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養(yǎng)苗，用清水洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，清洗時(shí)注意不要損害根部，然后移栽至培養(yǎng)基質(zhì)中，保持濕度和通風(fēng)，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃。

本發(fā)明并不限于上述實(shí)例，在本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員不經(jīng)創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種變形或修改均受本專(zhuān)利的保護(hù)。