本發(fā)明屬于植物倍性育種領(lǐng)域，為紅葉衛(wèi)矛三倍體細(xì)胞工程育種方法。涉及野生紅葉衛(wèi)矛種子胚乳細(xì)胞誘導(dǎo)形成愈傷組織；游離原生質(zhì)體，染色及倍性分選三倍體原生質(zhì)體；原生質(zhì)體誘導(dǎo)再生小植株；小植株頂芽休眠解除等進(jìn)程和方法。

背景技術(shù)：

紅葉衛(wèi)矛（Euonymus alatus ‘Compactus’）是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬落葉灌木，樹枝幼時(shí)綠色、無(wú)毛，老枝上有木栓質(zhì)的翅。花淺紅或淺黃色。春夏季葉片深綠色，秋季變?yōu)樽霞t色或火紅色故稱‘火焰衛(wèi)矛’，作為園林花木孤植、列植、群植于景區(qū)、校園、庭院、湖旁、草坪中，具有極高觀賞價(jià)值（劉艷霞，2015），喬灌搭配群體綠化具有萬(wàn)山紅遍層林盡染之感。紅葉衛(wèi)矛抗旱，耐瘠薄，抗寒－34.4℃，在美國(guó)廣為栽培。由于該樹種適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖能力、生存能力強(qiáng)，在21個(gè)州已列為入侵種?？的铱舜髮W(xué)新英格蘭地區(qū)入侵物種研究中心改良E.alatus ‘Compactus’，獲得三倍體植株，擬取代野生二倍體或通過(guò)種子繁育的群體，已申報(bào)美國(guó)國(guó)家專利保護(hù)。

目前，人工培育三倍體的主要方法是通過(guò)四倍體與二倍體雜交、胚乳細(xì)胞離體培養(yǎng)后篩選、2n配子誘導(dǎo)后雜交等方式（蘇靜，等，2012）。其中胚乳作為多倍體細(xì)胞混合組織，其內(nèi)含有天然的三倍體細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)再生植株，可從中篩選出三倍體植株。此方法已用于多種植物的三倍體育種，如柑桔（王大元，張進(jìn)仁，1978）、獼猴桃（黃貞光，等,1982）、枸杞（米佳麗，等,2011）、巴戟天（姚焱，等,2015）等?？的铱舜髮W(xué)新英格蘭地區(qū)入侵物種研究中心即是采用胚乳離體培養(yǎng)的方式，經(jīng)過(guò)愈傷組織及其不定芽的誘導(dǎo)，獲得再生植株，最后對(duì)其進(jìn)行倍性篩選，獲得三倍體植株（Thammina, et al.,2011）。在該實(shí)驗(yàn)中，成熟胚乳誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的誘導(dǎo)率為14.0%；愈傷組織誘導(dǎo)再生不定芽（植株）的誘導(dǎo)率為13.4%；其中，三倍體植株占28.6%，成熟胚乳細(xì)胞形成三倍體植株的幾率為0.34%；若采用未成熟胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，形成三倍體植株的幾率為0.42%.該實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單易行，便于操作，但工作量大，愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)率低，且胚乳組織中多數(shù)為二倍體細(xì)胞，再生植株中三倍體植株比率較小。

由于流式細(xì)胞儀可高效檢測(cè)顆粒樣品所帶熒光強(qiáng)度，因而在植物DNA含量檢測(cè)與倍性分析中得到廣泛應(yīng)用。雖然未見流式細(xì)胞儀用于植物細(xì)胞倍性分選的相關(guān)報(bào)道，但已有人利用流式細(xì)胞儀分選有活力的原生質(zhì)體（郭艷萍，等，2014）。Hoechst 33342為一種活體DNA熒光染料，可與活體DNA特異結(jié)合，在紫外光下發(fā)射藍(lán)色熒光。鑒于植物細(xì)胞壁在紫外光下亦產(chǎn)生藍(lán)色的自發(fā)熒光，因而進(jìn)行倍性分選的植物材料宜選用原生質(zhì)體。而Hoechst 33342染色并不影響原生質(zhì)體活力，可培養(yǎng)形成愈傷組織（van der Valk, et al,1988）。因此，可利用流式細(xì)胞儀分選三倍體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)再生植株，提高三倍體植株所占比率。

我國(guó)2012年立項(xiàng)引進(jìn)美國(guó)三倍體紅葉衛(wèi)矛培育技術(shù)。通過(guò)引進(jìn)、消化、吸收過(guò)程，對(duì)原技術(shù)進(jìn)行改良、優(yōu)化和創(chuàng)新形成在育種工藝、配方和效率等方便獲得改進(jìn)和提升的新的育種技術(shù)體系?；诙啾扼w胚乳愈傷組織直接誘導(dǎo)小植株從中篩選三倍體植株的育種程序，本研究用多倍體胚乳愈傷組織游離原生質(zhì)體，利用流式細(xì)胞儀分選三倍體原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，精準(zhǔn)誘導(dǎo)三倍體植株再生，三倍體植株獲得效率在0.42%基礎(chǔ)上大大提升。小植株頂芽休眠解除在以低溫處理基礎(chǔ)上研發(fā)了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑整合低溫處理和容器苗技術(shù)，休眠解除效率提高到90%以上，且為容器苗，移栽成活率得到保證。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要點(diǎn)一，提供了一種紅葉衛(wèi)矛胚乳愈傷組織誘導(dǎo)方式。其愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分包含基本培養(yǎng)基：MS無(wú)機(jī)鹽，維生素B1 0.1-1.0 mg/L、維生素B6 0.1-0.5 mg/L、煙酸0.1-0.5 mg/L、甘氨酸1.0-2.0 mg/L、水解酪蛋白0.3-0.6 g/L、嗎啉乙磺酸0.5-1.0 g/L；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：6-BA 1.0-3.0 mg/L、NAA0.5-2.0 mg/L；蔗糖20-30 g/L；瓊脂6-8 g/L。胚與胚乳黑暗條件下室內(nèi)共同培養(yǎng)4周后，將胚剝離，胚乳轉(zhuǎn)接至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)黑暗培養(yǎng)。胚伴隨的胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于無(wú)胚伴隨的胚乳愈傷組織誘導(dǎo)率，可達(dá)80%。

本發(fā)明要點(diǎn)二，提供了紅葉衛(wèi)矛愈傷組織游離原生質(zhì)體的酶解方法。其酶解液成分包含原生質(zhì)體洗滌液：KH₂P0₄ 20-27.2 mg/L、KNO₃ 90-101 mg/L、MgSO₄ ?7H₂O 180-246 mg/L、KI 0.10-0.16 mg/L、CuSO₄ 0.010-0.025 mg/L、CaCl₂?2H₂O 1000-1480 mg/L、甘露醇 0.5-0.7 M/L、嗎啉乙磺酸5-25 mM/L；細(xì)胞壁水解酶：纖維素酶 1.0-2.0%、離析酶 0.5-1.0%、果膠酶 0.5-1.0%；HCl 1 M/L和NaOH 1 M/L水溶液用于調(diào)節(jié)pH值為5.2-5.8。其酶解條件為黑暗條件下25-29℃酶解4-8小時(shí)，期間每小時(shí)輕柔顛倒混勻一次。

本發(fā)明要點(diǎn)三，提供了一種紅葉衛(wèi)矛原生質(zhì)體DNA染色及倍性分選的方法。胚乳愈傷組織與葉片愈傷組織分別游離原生質(zhì)體后進(jìn)行DNA染色，染色液為濃度5-10 μg/ml 的Hoechst 33342，染色時(shí)間為3-5 min。原生質(zhì)倍性分選，原生質(zhì)體用原生質(zhì)體洗滌液清洗后，以葉片愈傷組織的原生質(zhì)體為二倍體對(duì)照，在無(wú)菌條件下利用流式細(xì)胞儀分選胚乳愈傷組織原生質(zhì)體內(nèi)的三倍體細(xì)胞，使其得到富集，從而提高其后不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中三倍體植株的再生機(jī)率。注：Hoechst 33342為活體DNA染色劑，可特異性結(jié)合在DNA雙鏈上，染色后不影響原生質(zhì)體活力。

本發(fā)明要點(diǎn)四，提供了一種紅葉衛(wèi)矛原生質(zhì)體再生植株的方法，包括三個(gè)連續(xù)階段。

階段1，原生質(zhì)體培養(yǎng)形成愈傷組織。在無(wú)菌條件下將分選的原生質(zhì)體與含低熔點(diǎn)瓊脂糖（凝固點(diǎn)為26~30℃）的原生質(zhì)體培養(yǎng)基混勻后，傾倒于5cm培養(yǎng)皿內(nèi)，四等分后，轉(zhuǎn)入含原生質(zhì)體培養(yǎng)基的9cm培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。原生質(zhì)體培養(yǎng)基成分包括上述發(fā)明要點(diǎn)一所述的基本培養(yǎng)基、甘露醇 0.5 M、6-BA 0.5-2.0 mg/L、NAA 0.5-1.0 mg/L。黑暗條件下24℃震蕩培養(yǎng)；形成愈傷組織塊后，將其轉(zhuǎn)接至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

階段2，愈傷組織誘導(dǎo)再生不定芽。將愈傷組織接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在24℃，光照強(qiáng)度36 μmol·m^-2·s^-1，光照時(shí)間16 h/d條件下培養(yǎng)8周，誘導(dǎo)形成不定芽。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分包括上述發(fā)明要點(diǎn)一所述的基本培養(yǎng)基；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA 2.0-6.0 mg/L、IBA 0.1-0.2 mg/L；瓊脂0.6-0.8 g/L。

階段3，不定芽誘導(dǎo)生根形成小植株。不定芽以兩步法誘導(dǎo)生根。第一步，不定芽在生根培養(yǎng)基Ⅰ上培養(yǎng)2周。生根培養(yǎng)基Ⅰ為?WPM+硝酸銨0.4-1.0 g/L+蔗糖 20-30 g/L+IBA 1.0-3.0 mg/L ，pH為5.8。第二步，經(jīng)過(guò)第一步培養(yǎng)的不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)4周形成根系。生根培養(yǎng)基Ⅱ成分為?WPM+硝酸銨0.4-1.0 g/L+蔗糖 20-30 g/L+活性炭 2.0-4.0 g/L ，pH為5.8）。

本發(fā)明要點(diǎn)五，提供了一種紅葉衛(wèi)矛多倍體細(xì)胞獲得的小植株頂芽休眠的解除方法。上述紅葉衛(wèi)矛多倍體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的小植株種植接種在含GA₃ 2.0-4.0 mg/L及6-BA 1.0-2.0 mg/L的上述生根培養(yǎng)基Ⅱ上，置于3-8℃下暗處理30-45d；移至25℃，光照36 μmol·m^-2·s^-1，16 h/d條件下培養(yǎng)15-30 d，頂芽休眠解除率90%以上。

附圖說(shuō)明

圖 1為胚乳誘導(dǎo)的愈傷組織；

圖 2為愈傷組織游離出的原生質(zhì)體；

圖 3為愈傷組織再生形成的不定芽；

圖4為流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測(cè)峰圖，其中200處為二倍體熒光強(qiáng)度，300處為三倍體熒光強(qiáng)度。

圖5為芽休眠解除后的生根組培苗。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

紅葉衛(wèi)矛胚乳誘導(dǎo)愈傷組織

紅葉衛(wèi)矛（Euonymus alatus ‘Compactus’），在11月下旬采集成熟種子，去除假種皮，清水沖洗30 min，并用70%乙醇浸泡60s，置于含1% 吐溫-80及二氯異氰尿酸鈉的消毒液（有效氯濃度為1.0%）中震蕩處理20 min。無(wú)菌水沖洗種子5次，每次3 min。將已消毒的種子接種在含瓊脂的半凝固培養(yǎng)基的試管內(nèi)。7天后篩選無(wú)菌種子，在無(wú)菌條件下以滅菌（121℃，0.11 MPa，20 min，下同）的解剖刀和鑷子去除種皮，將胚及胚乳一同接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，24℃下黑暗培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代一次。第4周去除胚，胚乳繼續(xù)黑暗培養(yǎng)，第8周統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)80%。

實(shí)施例二

愈傷組織游離原生質(zhì)體

紅葉衛(wèi)矛（Euonymus alatus ‘Compactus’）胚乳愈傷組織，選取淡黃色的胚乳愈傷組織，在4℃下暗處理24h，在無(wú)菌條件下用滅菌鑷子及解剖刀將愈傷組織切片，在電子天平上稱取愈傷組織0.5g。將愈傷組織置于含10 ml酶解液的50 ml離心管內(nèi)，以封口膜封口，27 ℃下黑暗處理4 h，每小時(shí)輕柔地顛倒混勻一次。酶處理后，以300目細(xì)胞篩過(guò)濾，濾液置入新的離心管內(nèi)并以封口膜封口，用低溫離心機(jī)離心，離心力為100 g，離心時(shí)間為3min。吸棄上清，加入原生質(zhì)體洗滌液重懸，吸棄-重懸重復(fù)三次。將懸浮液定容至500μl，取少許懸浮液，用臺(tái)盼藍(lán)染色。染色液濃度為0.04%，染色時(shí)間為5 min。染色后的懸浮液滴加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體游離個(gè)數(shù)及存活率。1 g愈傷組織可游離出2×10⁶ 個(gè)原生質(zhì)體，存活率為91%。

實(shí)施例三

原生質(zhì)體倍性分選與植株再生

紅葉衛(wèi)矛（Euonymus alatus‘Compactus’）原生質(zhì)體以Hoechst 33342染色液進(jìn)行染色。染色液濃度為5 μg/ml，染色時(shí)間為5 min。100 g離心3 min，吸棄染色液，并用原生質(zhì)體培養(yǎng)基重懸，重復(fù)三次。收集原生質(zhì)體，在無(wú)菌條件下進(jìn)行流式細(xì)胞分選，根據(jù)儀器使用說(shuō)明書分選三倍體原生質(zhì)體。

將分選所得三倍體原生質(zhì)體與含低熔點(diǎn)瓊脂糖（凝固點(diǎn)為26~30℃），溫度為30-40℃的原生質(zhì)體培養(yǎng)基混勻，倒入直徑5 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)。待凝固后，用已滅菌的解剖刀切成四等分，轉(zhuǎn)入含原生質(zhì)體培養(yǎng)液的直徑9 cm的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，輕柔震蕩培養(yǎng)。待形成愈傷組織塊后，將其接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度36 μmol·m^-2·s^-1，光周期16 h/ 8 h（光/暗）下培養(yǎng)4周，將綠色致密的愈傷組織接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽發(fā)生和生長(zhǎng)。

取二倍體組培苗葉片與再生不定芽葉片各50mg，置于預(yù)冷的5ml塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，并分別加入解離染色液 500 μl。解離染色液包含PI 50 μg/ml、檸檬酸鈉 0.1%及Triton-X 100 0.3 μl/ml。于1min內(nèi)以雙面刀片快速切割葉片成碎塊，并用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液置于流式細(xì)胞儀上樣管內(nèi)。冰上孵化5min后，上機(jī)檢測(cè)，以二倍體細(xì)胞核為對(duì)照，檢測(cè)再生不定芽倍性。對(duì)7個(gè)再生不定芽進(jìn)行倍性檢測(cè)，其中6個(gè)樣品倍性為三倍體，三倍體所占比率為85.7%。

實(shí)施例四

紅葉衛(wèi)矛不定芽生根及芽休眠解除

選取粗壯的株高2-3cm的紅葉衛(wèi)矛三倍體原生質(zhì)體再生的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基Ⅰ上，誘導(dǎo)根原基。2周后轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基Ⅱ上，進(jìn)行根系生長(zhǎng)。紅葉衛(wèi)矛的生根組培苗普遍出現(xiàn)芽休眠現(xiàn)象，移栽煉苗成活率低。將生根苗接種于含3.0 mg/L GA3及1.0 mg/L 6-BA的生根培養(yǎng)基Ⅱ上，置于5℃下暗處理30d后，移至25℃下光照培養(yǎng)。芽休眠破除率可達(dá)90%以上。