本發(fā)明涉及一種氧化石墨烯-納米銀復(fù)合抗菌劑的制備方法，具體是一種在水溶液中利用自組裝將O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀均勻負(fù)載在氧化石墨烯表面的制備方法。

背景技術(shù)：

利用抗菌劑來抑制和殺滅有害細(xì)菌是提高人類健康水平的一個重要方法，傳統(tǒng)的抗菌劑，如抗生素、季銨鹽等不但會導(dǎo)致微生物的耐藥性，還會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。納米銀由于具有較好的廣譜抗菌性、不易產(chǎn)生耐藥性等特點已逐步應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)及臨床等相關(guān)領(lǐng)域。然而納米銀具有易團聚、易氧化及水溶性差等特點，使得其進一步應(yīng)用受到限制。氧化石墨烯是一種準(zhǔn)二維片層狀碳質(zhì)材料，其表面還含有較多的含氧官能團如羰基、羧基、羥基等。這些官能團的存在不僅使氧化石墨烯能夠均勻的分散，而且為氧化石墨烯納米銀復(fù)合材料的形成提供了有利的結(jié)合位點，因此氧化石墨烯是一種理想的納米銀載體材料。

目前在已有的氧化石墨烯-納米銀抗菌劑大多采用銀鹽的絡(luò)合反應(yīng)或氧化石墨烯銀離子混合液加還原劑還原的方法來制備。制備過程中含有大量的硝酸根、鹽酸根及各種有機物等有毒物質(zhì)，制造出來的納米銀溶液毒性很大，應(yīng)用領(lǐng)域受到限制。

例如，公布號為CN105772739A的“一種石墨烯/納米銀復(fù)合抗菌材料的制備方法”的發(fā)明專利，該專利將吸附有銀離子的氧化石墨烯放入還原劑溶液中加熱處理，離心分離即得石墨烯/納米銀復(fù)合材料。但是該專利在制備過程中使用毒性較高的乙醛酸作為還原劑，使得在醫(yī)用材料應(yīng)用方面受到限制，易對人體健康產(chǎn)生威脅，同時制備過程中長時間的加熱導(dǎo)致耗能過大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提出一種低毒、安全和耗能小的殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復(fù)合抗菌材料的制備方法。

上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

一種殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復(fù)合抗菌材料的制備方法，所述制備方法是按下列步驟進行的：

(1) 將0.1%wt的硝酸銀溶液與0.1%wt 的O-羧甲基殼聚糖溶液按體積比為20:80-1:99進行混合，室溫攪拌0.5-1h；

(2) 將上述混合溶液置于4mL石英比色皿中，通氮氣20s除盡空氣并密封；

(3) 將石英比色皿置于272nm紫外燈5cm處照射15min，紫外燈功率20w；

(4) 將混合溶液中加入一倍體積無水乙醇在14000r/min轉(zhuǎn)速下離心60min取沉淀，并用50%wt乙醇離心洗滌兩次；

(5) 沉淀再次溶于超純水，并超聲處理5-10min，即得O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液；

(6) O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與氧化石墨烯分散液按體積比為1:5-5:1混合，超聲處理5-10min。

在上述技術(shù)方案中，所述超聲處理為水浴超聲處理或探頭超聲處理；所述硝酸銀被還原后是單質(zhì)銀；所述O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液濃度為0.1- 0.5 mg/mL；所述氧化石墨烯分散液濃度為0.1-0.5 mg/mL。

上述技術(shù)方案是在本課題組項目研究的基礎(chǔ)上，深入探討了納米粒子與氧化石墨烯組裝過程。首先采用光化學(xué)還原法制備O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液，再將該分散液與氧化石墨烯分散液混合超聲，本發(fā)明基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復(fù)合抗菌材料的制備方法具有的工藝特點和優(yōu)越性如下。

O-羧甲基殼聚糖覆蓋于納米銀表面，在水溶液中O-羧甲基殼聚糖包裹的納米銀通過O-羧甲基殼聚糖與氧化石墨烯的氫鍵作用進行自組裝，O-羧甲基殼聚糖覆蓋于納米銀可均勻負(fù)載在氧化石墨烯表面，整個反應(yīng)過程無需加熱，制備方法簡單、快捷、耗能小。

O-羧甲基殼聚糖在納米銀制備過程中充當(dāng)還原劑和穩(wěn)定劑，制備過程不引入其他無抗菌效果或有毒試劑，使用安全可靠，可廣泛用于醫(yī)療、衛(wèi)生、環(huán)境治理，功能涂料、紡織品抗菌整理等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1是本發(fā)明殼聚糖包裹納米銀/氧化石墨烯自組裝復(fù)合抗菌材料的X射線衍射譜圖。圖中可見在2θ=9.7^o、38.1^o、44.3^o、64.4^o和77.3^o出現(xiàn)五個特征衍射峰，其中9.7^o的衍射峰是氧化石墨烯的特征峰。通過與JCPDS(4-0781)標(biāo)準(zhǔn)卡片對比，我們可以知道38.1^o、44.3^o、64.4^o和77.3^o這四個衍射峰分別是對應(yīng)著立方相金屬銀的(111)、(200)、(220)和(311)四個晶面的衍射峰。表明本發(fā)明所制備的是含有氧化石墨烯和納米銀的復(fù)合抗菌劑，其中的銀是立方結(jié)構(gòu)晶系的單質(zhì)銀。

具體實施方式

本發(fā)明上述所提供的一種O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復(fù)合抗菌材料是按硝酸銀溶液和O-羧甲基殼聚糖溶液進行混合后，經(jīng)紫外光照射，將獲得的的懸浮液進行離心、洗滌、水溶液分散，并與氧化石墨烯分散液按體積比為1:5-5:1混合制得。

下面通過具體實施例來進一步詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施方式。

實施例1

(1) 將0.1%wt硝酸銀溶液與0.1%wt O-羧甲基殼聚糖溶液按體積比為5:95加入攪拌器，室溫下攪拌1h。

(2) 將上述混合溶液置于4mL石英比色皿中，通氮氣20s除盡空氣并密封。

(3) 將石英比色皿置于272nm紫外燈5cm處照射15min，紫外燈功率20w。

(4) 將混合溶液中加入一倍體積無水乙醇在14000r/min轉(zhuǎn)速下離心60min取沉淀，并用50%wt乙醇離心洗滌兩次。

(5) 沉淀再次溶于超純水，并超聲處理10min，即得O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液。

(6) 將0.1 mg/mL O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與0.1 mg/mL氧化石墨烯分散液按體積比為5:1混合，超聲處理10min，得到O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復(fù)合抗菌材料。

通過上述制備方法中，硝酸銀溶液與O-羧甲基殼聚糖溶液的體積之比為5:9.5，O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與氧化石墨烯分散液按體積比為5:1。

微量肉湯稀釋法最小抑菌濃度試驗：

將大腸桿菌(ATCC11229)和金黃色葡萄球菌(ATCC6538)的菌種分別以劃線法接種到配置好的營養(yǎng)瓊脂上，置于恒溫培養(yǎng)箱中在下培養(yǎng)后，取典型的菌落移種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，再次培養(yǎng)，用營養(yǎng)肉湯對菌懸液進行稀釋，配制成10⁵CFU/mL細(xì)菌懸液備用。

選取滅菌的96孔聚苯乙烯板中并排的八個孔，每孔依次加入雙倍濃度的滅菌MH(B)完全培養(yǎng)基100μL、10⁵CFU/mL細(xì)菌懸液50μL和倍比稀釋后不同濃度的O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復(fù)合抗菌材料50μL。此時第1孔至第8孔藥物濃度分別為16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。將96孔聚苯乙烯板置于37^o培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，用酶標(biāo)儀檢測630nm處各孔的OD值。

試驗結(jié)果表明本實施例O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀/氧化石墨烯自組裝復(fù)合抗菌材料對大腸桿菌的最小抑菌濃度為1 μ/mL，對金色葡萄球菌的最小抑菌濃度為2 μ/mL。

實施例2

按照實施例1的工藝方法，實施例2的區(qū)別在于：O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與氧化石墨烯分散液按體積比為3:3。

微量肉湯稀釋法最小抑菌濃度試驗同實施例1。

試驗結(jié)果表明本實施例O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復(fù)合抗菌材料對大腸桿菌的最小抑菌濃度為4 μ/mL，對金色葡萄球菌的最小抑菌濃度為4 μ/mL。

實施例3

按照實施例1的工藝方法，實施例3的區(qū)別在于：O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀分散液與氧化石墨烯分散液按體積比為2:4。

微量肉湯稀釋法最小抑菌濃度試驗同實施例1。

試驗結(jié)果表明本實施例O-羧甲基殼聚糖包裹納米銀氧化石墨烯復(fù)合抗菌材料對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.25 μ/mL，對金色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1 μ/mL。