本發(fā)明涉及一種攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因家兔及其構(gòu)建方法，具體涉及通過顯微注射構(gòu)建出增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因家兔，表達(dá)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記家兔個(gè)體的全部細(xì)胞，在藍(lán)色光的激發(fā)條件下發(fā)射出綠色熒光。
背景技術(shù)：
：綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是一種在當(dāng)今生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中被廣泛使用的示蹤物，由GFP基因編碼，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色螢光。基于GFP的光學(xué)成像技術(shù)使人們可以直接觀察到從微觀到宏觀各個(gè)層次上豐富多彩的生命現(xiàn)象。GFP由238個(gè)氨基酸組成，分子量為26.9kDa，最初是從維多利亞多管發(fā)光水母中分離出來的，在藍(lán)光照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光。來源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分別有主要和次要的激發(fā)峰，它的發(fā)射峰在509nm，處于可見光譜的綠色區(qū)域(圖1)。錢永健(RogerTsien)在1995年完成GFP的單點(diǎn)突變。S65T突變顯著提高了GFP的光譜性質(zhì)，熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性也大大增強(qiáng)。突變后的GFP激發(fā)峰轉(zhuǎn)移至488nm，而發(fā)射峰仍保持在509nm，這和常用的FITC濾光片匹配，提高了GFP的應(yīng)用潛力。而F64L點(diǎn)突變則改善了GFP在37℃的折疊能力，綜上就產(chǎn)生了增強(qiáng)型GFP，也就是我們常見的EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein)。GFP已被廣泛用于標(biāo)記轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如小鼠、大鼠、山羊、牛豬等。2000年在法國已制備出GFP的轉(zhuǎn)基因家兔，但迄今尚未有制備出EGFP轉(zhuǎn)基因家兔的報(bào)道。與GFP相比EGFP熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性增強(qiáng)，更適用于活體標(biāo)記；但較強(qiáng)的EGFP表達(dá)會(huì)影響胚胎的早期發(fā)育，降低轉(zhuǎn)基因動(dòng)物出生率，甚至不能得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。因此，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建仍有待研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因家兔及其構(gòu)建方法，其具有顯著的遺傳標(biāo)記，用于區(qū)分非標(biāo)記樣本(包括家兔個(gè)體、組織和細(xì)胞)為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：一種攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因家兔，表達(dá)的EGFP標(biāo)記家兔個(gè)體的全部細(xì)胞，在藍(lán)色光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。所述的轉(zhuǎn)基因家兔由下述方法構(gòu)建得到：將重組EGFP編碼基因?qū)爰彝檬芫阎校@得EGFP轉(zhuǎn)基因兔；所述重組EGFP編碼基因是pCAG-GFP質(zhì)粒通過SnaBI+HindIII雙酶切得到的2.8kbDNA片段；對(duì)仔兔進(jìn)行EGFP基因鑒定或綠色熒光檢測(cè)，陽性為首建兔。首建兔與正常家兔雜交，得到遺傳穩(wěn)定的EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系，建系的家兔組織和培養(yǎng)細(xì)胞均被激發(fā)出綠色熒光。本發(fā)明還公開了用上述的轉(zhuǎn)基因家兔構(gòu)建EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系的方法，是將上述獲得的首建兔與正常家兔雜交，得到遺傳穩(wěn)定的EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系，建系的家兔組織和培養(yǎng)細(xì)胞均被激發(fā)出綠色熒光。本發(fā)明通過優(yōu)化啟動(dòng)子序列，應(yīng)用EGFP制作出了轉(zhuǎn)基因家兔，EGFP標(biāo)記的家兔可提供從宏觀(個(gè)體)到微觀(細(xì)胞)層次的直觀可見的顯著生物標(biāo)記樣本。本發(fā)明由于采取以上技術(shù)方案，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)EGFP熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性更強(qiáng)，不易被組織和細(xì)胞的背景熒光掩蓋和混淆。EGFP標(biāo)記的家兔，其組織和細(xì)胞攜帶顯著的綠色熒光標(biāo)記，非常容易與非標(biāo)記組織和細(xì)胞區(qū)分開。(2)優(yōu)化了EGFP的啟動(dòng)序列，通過縮短啟動(dòng)子序列，使EGFP在胚胎中穩(wěn)定而又溫和地表達(dá)，減少其對(duì)胚胎發(fā)育的影響。提高了EFGP轉(zhuǎn)基因兔的出生率。附圖說明圖1是EGFP的表達(dá)質(zhì)粒。圖2是EGFP基因表達(dá)框。圖3是用于顯微注射的EGFP基因。圖4是家兔受精卵顯微注射過程。圖5是胚胎注射EGFP基因后被激發(fā)出綠色熒光。圖6是轉(zhuǎn)基因兔檢測(cè)到EGFP基因。圖7是轉(zhuǎn)基因兔被激發(fā)出綠色熒光。圖8是轉(zhuǎn)基因兔皮膚組織被激發(fā)出綠色熒光。圖9是轉(zhuǎn)基因兔皮膚培養(yǎng)細(xì)胞被激發(fā)出綠色熒光。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)的描述。本發(fā)明通過顯微注射方式，將EGFP編碼基因?qū)爰彝檬芫阎?，再移植到代孕母兔體內(nèi)使其出生。(2)仔兔3周齡時(shí)，用打孔器取耳尖皮膚，于熒光顯微鏡下觀察激發(fā)的綠色熒光(3)首建兔通過與正常家兔雜交，得到遺傳穩(wěn)定的EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系，建系的家兔組織和培養(yǎng)細(xì)胞均被激發(fā)出綠色熒光。實(shí)施例1(1)EGFP表達(dá)序列的制備與優(yōu)化pCAG-GFP質(zhì)粒(Addgene,http://www.addgene.org/11150/)結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括CMV增強(qiáng)子、雞β啟動(dòng)蛋白和CAG啟動(dòng)子組成的復(fù)合啟動(dòng)序列、EGFP的編碼cDNA、兔肌球蛋白polyA序列；在大腸桿菌中擴(kuò)增并大量提取pCAG-GFP質(zhì)粒。為比較啟動(dòng)子序列對(duì)胚胎發(fā)育的影響，制備了兩種表達(dá)構(gòu)件。常規(guī)啟動(dòng)子表達(dá)構(gòu)件(以下簡(jiǎn)稱常規(guī)構(gòu)件):用SpeI+hindIII雙酶切pCAG-GFP質(zhì)粒，回收得到3.1kb片段，包括CMV增強(qiáng)子、雞β啟動(dòng)蛋白和CAG啟動(dòng)子組成的復(fù)合啟動(dòng)序列、EGFP的編碼cDNA、兔肌球蛋白polyA序列。優(yōu)化啟動(dòng)子表達(dá)構(gòu)件(以下簡(jiǎn)稱優(yōu)化構(gòu)件)：質(zhì)粒通過SnaBI+HindIII雙酶切得到2.8kbDNA片段，包括雞β啟動(dòng)蛋白和CAG啟動(dòng)子組成的復(fù)合啟動(dòng)序列、EGFP的編碼cDNA、兔肌球蛋白polyA序列，如圖2所示。割膠純化EGFP基因表達(dá)片段通過瓊脂糖凝聚電泳驗(yàn)證DNA的質(zhì)量，如圖3所示，用于顯微注射。(2)優(yōu)化構(gòu)件與常規(guī)構(gòu)件對(duì)兔胚胎影響的比較如圖3所示純化的EGFP片段，稀釋到3ng/μl。運(yùn)用顯微注射的方法分別將EGFP優(yōu)化構(gòu)件與常規(guī)構(gòu)件注射到家兔受精卵的原核中，經(jīng)過2-4天的體外培養(yǎng)，分別記錄2細(xì)胞期、囊胚期的胚胎發(fā)育率及EGFP表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化構(gòu)件組的胚胎顯示出更優(yōu)的發(fā)育能力，且EGFP表達(dá)比例更高(表1)。表1(3)顯微注射制備轉(zhuǎn)基因兔運(yùn)用顯微注射的方法分別將上述制備的兩種EGFP基因表達(dá)構(gòu)件注射到家兔受精卵的原核中，經(jīng)過短期體外培養(yǎng)后，成活的胚胎被移植到受體兔的輸卵管中，經(jīng)過約31天的妊娠，獲得基因注射兔。具體過程如下：性成熟(6月齡以上)的家兔將進(jìn)行超數(shù)排卵處理，連續(xù)三天，每天兩次按劑量遞增的方式(3，3；4，4和5，5mg)實(shí)施頸皮下注射FSH(促濾泡激素)，F(xiàn)SH處理完畢后，超排母兔與公兔交配兩次，并注射100IUhCG/供體(IU國際單位，hCG人絨毛促性腺激素)。hCG處理后18-20h，從供體兔的輸卵管中沖洗出受精卵。受精卵經(jīng)15000g的條件離心7-8分鐘，充分顯示雄性與雌性原核，如圖4中A所示。整個(gè)顯微注射的過程見圖4，在明顯確立了原核膨脹后，如圖4中B和D所示，注射過的卵子移入10％FBSM199培養(yǎng)液中在38.5℃，5％CO2培養(yǎng)箱中短暫培養(yǎng)，以檢查注射胚胎的成活率和分裂的狀況，并在顯微鏡下觀察綠色熒光激發(fā)情況，如圖5所示。約15-20枚注射胚胎將被移植到經(jīng)過同期發(fā)情處理的受體母兔的輸卵管中。結(jié)果顯示，導(dǎo)入優(yōu)化構(gòu)件的胚胎產(chǎn)子率為15.1％，共得到3個(gè)陽性的EGFP轉(zhuǎn)基因兔，總轉(zhuǎn)基因效率為5.5％(表1，n＝55)。常規(guī)構(gòu)件的胚胎產(chǎn)子率為10.2％，得到1個(gè)轉(zhuǎn)基因兔，但其在出生后1周死亡。表2為EGFP轉(zhuǎn)基因兔制作效率。表2構(gòu)件名稱優(yōu)化構(gòu)件常規(guī)構(gòu)件供體兔數(shù)量119胚胎收集數(shù)529447平均排卵數(shù)4849基因?qū)肱咛?shù)401356胚胎移植數(shù)364315受體兔數(shù)1311產(chǎn)子數(shù)5532產(chǎn)子率15.1％10.2％EGFP陽性數(shù)31(出生1周后死亡)EGFP陽性率5.5％3.1％(4)轉(zhuǎn)基因兔EGFP基因鑒定仔兔3周齡時(shí)，用打孔器取耳尖組織提取DNA，采用PCR方法鑒定EGFP基因在家兔基因組中的整合。PCR引物為GFP-F5：ACCACTACCAGCAGAACACCC(SEQIDNO.1)、GFP-R5：TTGCCAAACTCTAAACCAAATACTC(SEQIDNO.2)擴(kuò)增EGFP上的564bp片段，如圖6所示，EGFP陽性圖擴(kuò)增得到564bp片段，而正常家兔無任何條帶。(5)轉(zhuǎn)基因兔的綠色熒光檢測(cè)仔兔1周齡時(shí)，用紫外光源激發(fā)EGFP，如圖7所示，激發(fā)后家兔顯現(xiàn)綠色熒光。同時(shí)為進(jìn)一步驗(yàn)證激發(fā)光的可靠性，在仔兔3周齡時(shí)，用打孔器取耳尖組織，于熒光顯微鏡下觀察激發(fā)的綠色熒光，如圖8所示，耳尖組織顯示出亮綠色熒光。(6)EGFP兔組織及細(xì)胞綠色熒光檢測(cè)EGFP兔與正常家兔雜交3代以上，得到遺傳穩(wěn)定的EGFP轉(zhuǎn)基因兔品系。子代家兔取耳尖皮膚組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下驗(yàn)證其組織水平和細(xì)胞水平的綠色熒光標(biāo)記，如圖9所示，EGFP兔的組織和細(xì)胞均顯現(xiàn)出明亮的綠色熒光。SEQUENCELISTING<110>南京師范大學(xué)<120>一種攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因家兔及其構(gòu)建方法<130><160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1accactaccagcagaacaccc21<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2ttgccaaactctaaaccaaatactc25當(dāng)前第1頁1 2 3