本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種兩面針愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
兩面針（Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.）為蕓香科花椒屬植物，具有很高的藥用價(jià)值，其干燥根入藥，為我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)中藥，1977年開(kāi)始被收入《中國(guó)藥典》。兩面針具有行氣止痛、活血化瘀、祛風(fēng)通絡(luò)之功效。其中的氯化兩面針堿可以抗肝癌和乳腺癌；兩面針還是牙膏工業(yè)的原料。兩面針?lè)植加谖覈?guó)南方各省，生于山野坡地灌木叢中。兩面針?lè)植茧m然廣闊，但資源并不豐富。由于兩面針用量巨大，其野生資源幾近枯竭，市場(chǎng)上兩面針?biāo)幉牡膫纹芬虼艘草^多?；謴?fù)兩面針的資源首先需要種苗?？梢酝ㄟ^(guò)種子萌發(fā)、扦插繁殖和組織培養(yǎng)獲得種苗。另外兩面針?lè)N質(zhì)資源較為缺乏，隨著細(xì)胞融合技術(shù)和基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)植物在分子水平上改進(jìn)可大大促進(jìn)種質(zhì)資源的擴(kuò)大，對(duì)植物在分子水平的改進(jìn)需要先對(duì)植物進(jìn)行處理，一般是誘導(dǎo)形成愈傷組織，現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有兩面針的愈傷組織的培養(yǎng)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種兩面針愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種兩面針愈傷組織的誘導(dǎo)方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基或者愈傷組織的誘導(dǎo)方法的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：
6-糠基氨基嘌呤在兩面針愈傷組織誘導(dǎo)中的應(yīng)用，所述6-糠基氨基嘌呤在培養(yǎng)基中的濃度為0.2～6 mg/L。
發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)在兩面針中加入6-糠基氨基嘌呤（又名激動(dòng)素，簡(jiǎn)稱KT）可誘導(dǎo)出兩面針愈傷組織，利用愈傷組織進(jìn)行組織培養(yǎng)或者細(xì)胞融合和基因轉(zhuǎn)化的材料，為兩面針?lè)N質(zhì)資源的擴(kuò)大提供基礎(chǔ)。
優(yōu)選地，所述6-糠基氨基嘌呤在培養(yǎng)基中的濃度為1～4 mg/L。
本發(fā)明還提供一種兩面針愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA。
更優(yōu)選地，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L KT＋2.0 mg/LNAA。
本發(fā)明還提供一種兩面針愈傷組織誘導(dǎo)的方法，是以兩面針無(wú)根苗的莖段為外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA。
優(yōu)選地，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：溫度23～27℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照強(qiáng)度為32.5～34.5 μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時(shí)間各半。
優(yōu)選地，兩面針無(wú)根苗的莖段是取帶腋芽的兩面針的幼嫩莖段，消毒后，再接種于于MS+1.0 mg/L～2.0 mg/L KT＋0.2 mg/L～0.4 mg/L NAA培養(yǎng)長(zhǎng)成3～4cm的無(wú)根苗，再截取無(wú)根苗的莖段即可。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明以兩面針無(wú)根苗的莖段為外植體，在含有適宜激素配比的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織形成；所得到的愈傷組織可以為兩面針細(xì)胞融合或者基因轉(zhuǎn)化研究提供材料，建立技術(shù)平臺(tái)，為種子資源的改良打下基礎(chǔ)，利用本發(fā)明所述愈傷組織進(jìn)行后續(xù)的組織培養(yǎng)，建立的組織培養(yǎng)體系，提高了繁殖系數(shù)（現(xiàn)有通過(guò)叢生芽的誘導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)增殖的方法的增殖系數(shù)為2.4～3.6，而本發(fā)明方法的增殖系數(shù)可以達(dá)到5.0），為大量種植兩面針奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
植物材料：兩面針無(wú)根苗莖段。帶腋芽的兩面針幼嫩莖段采自廣州中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，用70%乙醇浸泡30秒，再用0.1%HgCl2浸泡8分鐘，用0.5%NaClO浸泡10分鐘，最后用無(wú)菌水沖洗3次，接種于MS＋2.0 mg·L-1 KT＋0.4 mg·L-1 NAA中培養(yǎng)，12天后開(kāi)始生長(zhǎng)，約12周后可長(zhǎng)成3～4 cm的無(wú)根苗。
以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g·L-1，卡拉膠8.0 g·L-1，pH5.8～6.0作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。植物生長(zhǎng)物質(zhì)包括α－萘乙酸（α-naphthalene acetic acid，NAA）、吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）、6-糠基氨基嘌呤（kinetin，KT）。
愈傷組織誘導(dǎo)率：分別在莖段愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)第10、20、30天，觀察愈傷組織生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率（誘導(dǎo)率=(出愈外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%）。
愈傷組織分化率：愈傷組織分化培養(yǎng)4周或8周，統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率（分化率=(分化出芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織總塊數(shù))×100%）。
芽增殖系數(shù)：芽分化培養(yǎng)8周后，轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)4周或8周統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)(芽增殖系數(shù)=全部增殖芽數(shù)/接種芽數(shù))。
生根率：生根培養(yǎng)8周，統(tǒng)計(jì)生根率（生根率=(生根的芽數(shù)/接種的芽數(shù))×100%）。
實(shí)施例1
一、愈傷組織誘導(dǎo)
在無(wú)菌條件下將無(wú)根苗的莖切成約6 mm的小段，水平放置在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的表面（愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成具體見(jiàn)表1）；每瓶接種3段；每種培養(yǎng)基各接種25瓶。培養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照強(qiáng)度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時(shí)間各半，一個(gè)月繼代1次。
兩面針莖段在三種不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)組合構(gòu)成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（A1、A2、A3培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和表1中的植物生長(zhǎng)物質(zhì)組成，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含量相同）中都能產(chǎn)生愈傷組織，說(shuō)明適當(dāng)濃度的KT和NAA能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。比較三種培養(yǎng)基產(chǎn)生愈傷組織的效果，在A3培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到74.84%；其次是A1培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為66.84%；最差的是A2培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率只有58.76%。產(chǎn)生的愈傷組織的質(zhì)量也有不同，在A3和A1上產(chǎn)生的愈傷組織的顏色是淡黃色、顆粒狀、質(zhì)地疏松而且濕潤(rùn)的；而在A2上產(chǎn)生的愈傷組織的顏色是淡黃色、塊狀、質(zhì)地干硬的；因此A3和A1培養(yǎng)基上產(chǎn)生的愈傷組織比較適宜作為愈傷組織分化的材料，由于A3培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率最高，所以選取A3培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行分化實(shí)驗(yàn)。
二、愈傷組織的分化
將繼代1次，在A3培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的愈傷組織塊切成5 mm×5 mm大小，接種于分化培養(yǎng)基中（表2，培養(yǎng)基B1、B2、B3由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和表2的植物生長(zhǎng)物質(zhì)組成，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含量相同），每瓶接種4塊，每種培養(yǎng)基各接種50瓶。培養(yǎng)1個(gè)月后，將在培養(yǎng)基B3上產(chǎn)生的愈傷組織再轉(zhuǎn)移到另4種分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)（表3），每個(gè)培養(yǎng)皿接種8塊，每種培養(yǎng)基各接種12個(gè)培養(yǎng)皿。培養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照強(qiáng)度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時(shí)間各半。
結(jié)果見(jiàn)表2。在培養(yǎng)基B1中沒(méi)有芽的分化。而在培養(yǎng)基B2和B3上可以分化出芽，但分化率低，只有4.50%和12.50%，每塊愈傷組織的芽平均數(shù)為1.00和1.30。在培養(yǎng)基B1上沒(méi)有分化出芽的原因可能是KT的濃度太低。從表2的結(jié)果可以看出，三種培養(yǎng)基中，含4 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA的B3培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織分化有一定的效果，但效果還不夠理想。為了進(jìn)一步提高芽的分化率，將在B3進(jìn)行過(guò)分化培養(yǎng)的不含芽的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到其他四種分化培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行芽的分化培養(yǎng)（表3，B3、B4、B5、B6由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和表3的植物生長(zhǎng)物質(zhì)組成，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含量相同）。
從表3結(jié)果可以看出，四種含植物生長(zhǎng)物質(zhì)組合的培養(yǎng)基都可以促進(jìn)芽的分化，在培養(yǎng)基B4中的愈傷組織的分化效果較好，芽分化率為36.46%，顯著高于在其它三個(gè)培養(yǎng)基中的分化率，且每塊愈傷組織的平均芽數(shù)達(dá)到3.30。在培養(yǎng)基B3、B5和B6的中的愈傷組織芽分化率分別為20.83%、16.67%和23.96％，它們之間沒(méi)有顯著性差異。四種培養(yǎng)基中，B4的KT含量最高，分化出的芽較小、顏色偏黃、葉片細(xì)小，說(shuō)明芽的質(zhì)量較差。因此表3的結(jié)果表明，高濃度的KT對(duì)芽的分化有利，但KT的濃度太高，會(huì)使芽的質(zhì)量變差。
綜合表2和表3的結(jié)果分析，在芽分化培養(yǎng)中，除了KT的濃度不能過(guò)低外，生長(zhǎng)素的濃度對(duì)芽的分化率也有影響，在KT濃度相同的處理中，生長(zhǎng)素濃度高，則有芽分化率高的趨勢(shì)。另外，表3的B3培養(yǎng)基的芽分化率高于表2中的B3培養(yǎng)基的芽分化率，原因可能是表3的愈傷組織的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。
三、芽的增殖
將來(lái)自分化培養(yǎng)基B4的帶芽愈傷組織轉(zhuǎn)接到芽增殖培養(yǎng)基中（表4），每個(gè)培養(yǎng)皿接種6塊愈傷組織，每塊愈傷組織帶1～2個(gè)芽，每種培養(yǎng)基各接種8個(gè)培養(yǎng)皿。4周后繼代1次，接種到培養(yǎng)瓶中，每瓶接種3塊帶1～2個(gè)芽的愈傷組織，每種培養(yǎng)基各接種16瓶。培養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照強(qiáng)度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時(shí)間各半。
B4培養(yǎng)基中芽的分化率明顯高于其它培養(yǎng)基，但芽的質(zhì)量較差，可能的原因是B4培養(yǎng)基的KT濃度過(guò)高。為了獲得高的芽分化率而又得到好質(zhì)量的芽，將B4培養(yǎng)基上的芽重新轉(zhuǎn)接到低KT濃度的B3、B5和B6培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，培養(yǎng)4周和8周后，芽增殖效果最好的是B6培養(yǎng)基，其芽增殖系數(shù)分別是3.33（培養(yǎng)4周）和5.00（培養(yǎng)8周）。其次是B3培養(yǎng)基，培養(yǎng)4周和8周后，芽增殖系數(shù)分別是2.66和3.50。增殖系數(shù)較高的這兩個(gè)培養(yǎng)基的KT濃度都是4.0 mg·L-1，它們的芽生長(zhǎng)速度較慢，芽稍短，但芽的顏色較綠，說(shuō)明芽的質(zhì)量是好的。B5培養(yǎng)基上的增殖效果最差，它的KT濃度為2.0 mg·L-1。所以，在增殖培養(yǎng)中，KT的濃度過(guò)低不利于芽的增殖。
比較B5和B6培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)物質(zhì)組成，它們的KT與NAA的濃度比值都是5，但兩者芽的增殖效果卻不同，這說(shuō)明當(dāng)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素比值相同，而它們的絕對(duì)濃度不同時(shí)，芽的分化能力也有差異，也就是說(shuō)，芽的分化能力不但受細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值的影響，還受兩種激素的絕對(duì)濃度影響。4.0 mg·L-1 KT和0.8 mg·L-1 NAA的生長(zhǎng)物質(zhì)的組合更有利于芽的增殖。
四、生根培養(yǎng)
增殖培養(yǎng)后，將來(lái)自培養(yǎng)基B6的高于2 cm的芽塊（帶少量愈傷組織）轉(zhuǎn)接到1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)（表5），每瓶接種4塊愈傷組織，每塊帶1～3個(gè)芽，每種培養(yǎng)基接種20瓶。培養(yǎng)條件：溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照強(qiáng)度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時(shí)間各半。
取生長(zhǎng)在B6培養(yǎng)基中高于2 cm的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)芽下部開(kāi)始分化形成根。培養(yǎng)8周后的生根情況見(jiàn)表5。三種生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基（C1、C2、C3培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和表5的植物生長(zhǎng)物質(zhì)組成，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含量相同）中，生根效果較好的是C1和C2，它們的生根率分別是66.75%和46.85%，根多且長(zhǎng)；而C3培養(yǎng)基的生根率較低，為25.30%，根也較短。表5的結(jié)果表明，隨著KT濃度的升高，生根率下降。生根誘導(dǎo)最好的培養(yǎng)基是C1。
五、煉苗與移栽
將在C1培養(yǎng)基中獲得的再生苗進(jìn)行鍛煉。把培養(yǎng)瓶放置在室內(nèi)靠窗處接受散射的自然光照射3天，然后打開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋，在相同位置又放置3天。之后取出再生苗，用清水洗凈植株基部的培養(yǎng)基，移栽到含1/3砂、2/3土的培養(yǎng)基質(zhì)中。除了注意在苗期時(shí)遮蔭外，不需要特別護(hù)理。移栽后的兩面針幼苗生長(zhǎng)良好，移栽成活率為91%。
對(duì)比例1
實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例1，唯一不同的是，本對(duì)比例中培養(yǎng)基不含有KT，其愈傷組織誘導(dǎo)率只有1.34～5.31%。