本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：梅花，是中國的傳統(tǒng)名花，在我國有7000年以上的應(yīng)用史和3000年以上的栽培史，品種繁多，在引種栽培過程中，培育出了眾多優(yōu)良的園藝新品種，極大地豐富了我國的園林景觀。梅花從受粉到果實成熟僅要兩三個月左右的時間，果實發(fā)育時間短，其果實達(dá)到成熟時，胚尚未成熟。種子經(jīng)過砂藏處理，在正常條件下播種萌發(fā)率也很低。愈傷組織培養(yǎng)不僅是一種植物快繁的新手段，同時也是植物改良，種質(zhì)保存和有用化合物生產(chǎn)的理想途徑，梅花為木本植物，其愈傷組織的誘導(dǎo)比較困難，組織培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)褐變、菌絲感染及誘導(dǎo)時間長等的問題。公開號為CN102550404A、申請?zhí)枮?01110422216.3的中國專利提供了一種梅花葉片愈傷組織高效誘導(dǎo)方法，該發(fā)明中詳細(xì)介紹了梅花葉片愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分及誘導(dǎo)培養(yǎng)過程，但外植體培養(yǎng)過程往往會出現(xiàn)褐變、菌絲感染等的問題，從而影響愈傷組織的質(zhì)量及誘導(dǎo)率，該發(fā)明出沒有提供詳細(xì)的解決方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明目的是，針對現(xiàn)有技術(shù)中沒有提供詳細(xì)方法以解決外植體培養(yǎng)過程出現(xiàn)褐變、菌絲感染等的問題，提供一種能解決褐變及菌絲感染等問題，從而提高梅花葉片愈傷組織的質(zhì)量及誘導(dǎo)率的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基90-120份、母液I18-28份和純凈水15-25份；所述母液I溶液包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸鉀1-5mg/L、氟苯丙氨酸1-5mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷2-6mg/L、4-碘苯氧乙酸3-7mg/L和噻菌銅2-6mg/L。在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基100-110份、母液I20-26份和純凈水17-23份；所述母液I溶液包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸鉀2-4mg/L、氟苯丙氨酸2-4mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷3-5mg/L、4-碘苯氧乙酸4-6mg/L和噻菌銅3-5mg/L。在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基105份、母液I24份和純凈水19份；所述母液I溶液包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸5mg/L和噻菌銅4mg/L。在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，所述母液I的配制方法如下：先按重量份比稱取稱取亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入部分純凈水中，充分?jǐn)嚢柚辽鲜鑫镔|(zhì)充分溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，所述的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢?、混合均勻，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值，此為體系3；(3)取體系3，用高壓蒸汽滅菌18-28min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，進(jìn)一步的發(fā)明，所述調(diào)節(jié)體系2的pH值為5.4-6.4之間。在本發(fā)明中，進(jìn)一步的說明，所述高壓蒸汽滅菌，滅菌壓力為170-190KPa。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較具有的有益效果：本發(fā)明具有促使梅花愈傷組織快速形成，有減少褐變產(chǎn)生及菌絲感染的問題，從而提高梅花葉片愈傷組織的質(zhì)量及誘導(dǎo)率，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)梅花葉片愈傷組織，誘導(dǎo)時間縮短至6天，誘導(dǎo)率高達(dá)98.5％,褐變率僅為1.2％，愈傷組織緊密，顏色淺綠而透明，呈現(xiàn)出很好的狀態(tài)。1.在誘導(dǎo)形成愈傷組織的過程中往往會出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，褐變的產(chǎn)生會對許多酶有抑制作用，從而影響培養(yǎng)材料的生長與分化，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致死亡，組織在培養(yǎng)過程中，引起褐變的酶主要有有多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶，通過抑制酶的活性減少酶促褐變途徑，減少褐變的產(chǎn)生，亞硫酸鉀和氟苯丙氨酸的復(fù)配添加可通過分別抑制多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，可大大減少組培過程中出現(xiàn)的褐變現(xiàn)象，提高愈傷組織的質(zhì)量，甲硫基異戊烯基腺苷有細(xì)胞分裂素的生理功能，可有效促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴大作用，并調(diào)控其分化，4-碘苯氧乙酸與甲硫基異戊烯基腺苷混合使用可快速高效誘導(dǎo)愈傷組織的形成及分化；而噻菌銅有效解決了菌絲感染導(dǎo)致外植體愈傷組織誘導(dǎo)不成功的問題。2.MS培養(yǎng)基提供了外植體在誘導(dǎo)愈傷組織的過程中維持生長所需基本的生長因子，而母液I的添加對愈傷組織的形成有高效促進(jìn)作用和提高愈傷組織的作用。具體實施方式本發(fā)明提供了一種高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：一種高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基90份、母液I18份和純凈水15份；所述母液I溶液包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸鉀1mg/L、氟苯丙氨酸1mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷2mg/L、4-碘苯氧乙酸3mg/L和噻菌銅2mg/L。母液I的配制方法如下：1.稱取亞硫酸鉀1mg、氟苯丙氨酸1mg、甲硫基異戊烯基腺苷2mg、4-碘苯氧乙酸3mg和噻菌銅2mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢枋箒喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養(yǎng)基的配制方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢?、混合均勻，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為5.4，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以170KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌18min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。實施例2本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：一種高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基，其特征在于，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基105份、母液I24份和純凈水19份；所述母液I溶液包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸5mg/L和噻菌銅4mg/L。母液I的配制方法如下：2.稱取亞硫酸鉀3mg、氟苯丙氨酸3mg、甲硫基異戊烯基腺苷3mg、4-碘苯氧乙酸5mg和噻菌銅4mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢枋箒喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養(yǎng)基的配制方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢?、混合均勻，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為5.9，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以180KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌24min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。實施例3本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：一種高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基120份、母液I28份和純凈水25份；所述母液I溶液包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸鉀5mg/L、氟苯丙氨酸5mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷6mg/L、4-碘苯氧乙酸7mg/L和噻菌銅6mg/L。母液I的配制方法如下：3.稱取亞硫酸鉀5mg、氟苯丙氨酸5mg、甲硫基異戊烯基腺苷6mg、4-碘苯氧乙酸7mg和噻菌銅6mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢枋箒喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養(yǎng)基的配制方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢琛⒒旌暇鶆?，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為6.4，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以190KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌28min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。實施例4本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：一種高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基100份、母液I20份和純凈水17份；所述母液I溶液包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸鉀2mg/L、氟苯丙氨酸2mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷3mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌銅3mg/L。母液I的配制方法如下：4.稱取亞硫酸鉀2mg、氟苯丙氨酸2mg、甲硫基異戊烯基腺苷3mg、4-碘苯氧乙酸4mg和噻菌銅3mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢枋箒喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養(yǎng)基的配制方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢琛⒒旌暇鶆?，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為5.6，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以175KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌20min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。實施例5本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：一種高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基，按重量份比，包括以下物質(zhì)：MS培養(yǎng)基110份、母液I26份和純凈水23份；所述母液I溶液包括以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)：亞硫酸鉀4mg/L、氟苯丙氨酸4mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷5mg/L、4-碘苯氧乙酸6mg/L和噻菌銅5mg/L。母液I的配制方法如下：5.稱取亞硫酸鉀4mg、氟苯丙氨酸4mg、甲硫基異戊烯基腺苷5mg、4-碘苯氧乙酸6mg和噻菌銅5mg；接著，將亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅分別加入純凈水中，充分?jǐn)嚢枋箒喠蛩釟溻}、異戊烯氨基嘌呤、4-碘苯氧乙酸、水溶性氮酮水溶性氮酮和丙環(huán)唑完全溶解，然后放冷至室溫，定容至所需溶劑即得母液I。培養(yǎng)基的配制方法如下：(1)按重量份比，稱取MS培養(yǎng)基和純凈水，先將純凈水加入鍋中，加熱使純凈水煮沸后停止加熱，接著將MS培養(yǎng)基加入純凈水中，使MS培養(yǎng)基溶解，并充分?jǐn)嚢琛⒒旌暇鶆?，此為體系1；(2)按重量份比稱取母液I，將母液I加入體系1中，不斷攪拌使體系1和母液I混合均勻，此為體系2，調(diào)節(jié)體系2的pH值為6.2，此為體系3；(3)取體系3，將體系3以185KPa的滅菌壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌26min，然后取出，靜置冷卻凝固后即得培養(yǎng)基。實施例6本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：亞硫酸鉀3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌銅2.5mg/L，其余與實施例2相同。實施例7本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷4mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌銅2.5mg/L，其余與實施例2相同。實施例8本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷4mg/L和4-碘苯氧乙酸4mg/L，其余與實施例2相同。實施例9本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、甲硫基異戊烯基腺苷4mg/L和噻菌銅2.5mg/L，其余與實施例2相同。實施例10本發(fā)明提供的高效快速誘導(dǎo)梅花愈傷組織形成的培養(yǎng)基及其配制方法如下：其中，所述母液I由以下質(zhì)量-體積濃度的物質(zhì)組成：亞硫酸鉀3mg/L、氟苯丙氨酸3mg/L、4-碘苯氧乙酸4mg/L和噻菌銅2.5mg/L，其余與實施例2相同。試驗例:取幼嫩的梅花葉片，去掉葉柄，用手術(shù)刀切割成小片，用刀片沿主脈劃3刀，保證葉緣處相連，目的在于使葉片產(chǎn)生更多的傷口，再用鑷子將其接種到對應(yīng)的培養(yǎng)基上，每個瓶接種3片，每組接種30瓶，共接種11組，以上操作在超凈臺上完成，封好口后置于相同的環(huán)境中經(jīng)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至產(chǎn)生愈傷組織，培養(yǎng)條件為：(25±1)℃，暗培養(yǎng)。記錄愈傷組織形成時間、愈傷組織的顏色、顆粒散碎度，統(tǒng)計其誘導(dǎo)率和褐變率，結(jié)果如下表：試驗組形成時間(天)誘導(dǎo)率褐變率顆粒散碎度顏色實施例1796.6％1.4％緊密淺綠而透明實施例2698.5％1.2％緊密淺綠而透明實施例3797.2％1.3％緊密淺綠而透明實施例4697.1％1.6％緊密淺綠而透明實施例5895.6％1.7％緊密淺綠而透明實施例6784.3％14％緊密淺綠而透明實施例7682.3％16％緊密淺綠而透明實施例8763.4％1.4％緊密淺綠而透明實施例91288.4％1.3％疏松白色透明實施例101387.3％1.2％疏松白色透明由上表可知，由于實施例1-5使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其誘導(dǎo)時間明顯比其他試驗組短，誘導(dǎo)率比其他試驗組高，褐變率低，顆粒散碎度及顏色都明顯優(yōu)于其他試驗組。實施例6-10為對比例，其中：實施例6中母液I的成分為：亞硫酸鉀、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅；實施例7中母液I的成分為：氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅；實施例8中母液I的成分為：亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷和4-碘苯氧乙酸；實施例9中母液I的成分為：亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、甲硫基異戊烯基腺苷和噻菌銅；實施例10中母液I的成分為：亞硫酸鉀、氟苯丙氨酸、4-碘苯氧乙酸和噻菌銅。分別對比實施例6、實施例7和實施例2的數(shù)據(jù)，可證實氟苯丙氨酸和亞硫酸鉀有緩解組織培養(yǎng)過程中褐變的問題；通過對比實施例8和實施例2的數(shù)據(jù)，可證實噻菌銅有效解決了菌絲感染從而提高外植體愈傷組織誘導(dǎo)率；通過對比實施9、實施例10和實施例2的數(shù)據(jù)，可證實甲硫基異戊烯基腺苷和4-碘苯氧乙酸混合使用可加快愈傷組織形成。上述說明是針對本發(fā)明較佳可行實施例的詳細(xì)說明，但實施例并非用以限定本發(fā)明的專利申請范圍，凡本發(fā)明所提示的技術(shù)精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應(yīng)屬于本發(fā)明所涵蓋專利范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3