本發(fā)明屬于利用苔蘚植物檢測土壤和水體鎘污染技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高苔蘚植物檢測土壤鎘污染靈敏度和特異性的方法。

背景技術(shù)：

鎘在土壤環(huán)境中是一種十分危險的重金屬污染元素，其具有穩(wěn)定性強、容易積累和不易消除的特點，且可通過食物鏈的生物富集作用使人畜發(fā)生慢性中毒。當前，土壤鎘污染備受世界關(guān)注，其是否已達到安全標準，關(guān)系到農(nóng)作物及食品安全風險等諸多方面的問題。苔蘚植物檢測法是目前業(yè)內(nèi)較受推崇的環(huán)境檢測方法，其基本原理是：相對于高等植物而言，苔蘚植物由于進化程度較低，其抵抗外界環(huán)境毒性的能力也較低，在環(huán)境污染毒害下可迅速表現(xiàn)出一系列顯著癥狀及生長指標變化，通過這些變化可綜合評價出環(huán)境污染程度，利用苔蘚植物的這一特點可將其應(yīng)用到大氣、土壤及水體的重金屬污染檢測。該方法用于土壤鎘污染檢測尤為適宜，但所面臨的現(xiàn)實問題是：自然界中的苔蘚植物由于其在長期生長過程中已對污染環(huán)境產(chǎn)生了一定適應(yīng)性，相關(guān)實施例表明，將其直接用于土壤鎘檢測時效果不佳，需經(jīng)特殊處理以消除其背景適應(yīng)性，進一步提高其對土壤鎘的敏感度，才能更好地用于檢測；此外，土壤中另一常見污染性元素鉛的存在，影響了苔蘚植物對鎘元素檢測效果的專一性和特異性(檢測時很難判定苔蘚植物受到的污染毒害是來自于鎘元素亦或是鉛元素)，因此大大降低了對土壤鎘的檢測效果和可信度。本發(fā)明所涉及的技術(shù)方法很好地解決了上述兩方面的問題，從而實現(xiàn)了利用東亞金發(fā)蘚高精準、專一性地檢測土壤鎘污染。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題而提供一種提高苔蘚植物檢測土壤鎘污染靈敏度和特異性的方法，旨在解決目前技術(shù)所涉及的最佳檢測材料的獲取問題，以及干擾性元素鉛存在下難以專一性、特異性地檢測鎘污染的問題。

本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：一種提高苔蘚植物檢測土壤鎘污染靈敏度和特異性的方法，該方法包括用于檢測土壤鎘污染的植物材料的培植獲得方法，和土壤中干擾性鉛離子的掩蔽處理方法；

所述植物材料的培植獲得方法為：

制備孢子懸液：采集孢子生長期成熟的東亞金發(fā)蘚植株的孢子體若干，放于石英研缽中，加入少許液氮后，輕輕研磨至孢子體的苞蒴完全破裂，使內(nèi)藏的孢子散出，加入蒸餾水反復沖洗研缽，濾掉大部分的苞蒴殘體，從而獲得孢子懸液；

制備培養(yǎng)基質(zhì)：以體積比為1︰1的潔凈砂質(zhì)土壤和植物殘體發(fā)酵物為基質(zhì)配方，充分混合后作為東亞金發(fā)蘚培養(yǎng)基質(zhì)；

將孢子懸液均勻噴灑于培養(yǎng)基質(zhì)中，放置于人工光照氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，出苗后50～60d進入孢子生長階段，將該時期的植株作為土壤鎘污染的檢測材料；

所述土壤中干擾性鉛離子的掩蔽處理方法為：

取所培植獲得的成熟期帶有孢子體的東亞金發(fā)蘚植株，移植于經(jīng)由0.5mol/L的氨水+0.02mol/L的氫氧化鈣合成的化學掩蔽劑處理后的待檢測土壤中，以生長在無污染基質(zhì)中的植株為對照，觀測其外觀性狀變化，并在第3～5d取樣，測定并比較植株的葉綠素含量、可溶性總蛋白含量，依據(jù)指標變化，綜合評價土壤鎘污染程度。

進一步，加入蒸餾水反復沖洗研缽之后進一步包括：

將洗液一并通過網(wǎng)孔內(nèi)徑為1mm的不銹鋼濾網(wǎng)進行過濾，濾掉大部分的苞蒴殘體，從而獲得孢子懸液。

進一步，植物殘體發(fā)酵物可用花卉等植物漚制肥料代替，與砂質(zhì)土壤進行充分混合后作為東亞金發(fā)蘚培養(yǎng)基質(zhì)，之后進一步包括：

將制備好的培養(yǎng)基質(zhì)平鋪于直徑35cm、高6cm的聚乙烯淺盤中，基質(zhì)厚度為5cm。

進一步，將孢子懸液均勻噴灑于培養(yǎng)基質(zhì)中，放置于人工光照氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，之后進一步包括：

培養(yǎng)溫度設(shè)置為20℃～25℃，光照強度設(shè)置為2000Lux/10h，每日噴灑1/6濃度的Hogland營養(yǎng)液300-400mL/盤，使基質(zhì)濕度保持在70％～80％；30～40d后東亞金發(fā)蘚幼苗開始長出，此時將培養(yǎng)溫度設(shè)置為30℃～35℃，光照強度設(shè)置為4000Lux/14h；出苗后50～60d則進入孢子生長階段，將該時期的植株作為土壤鎘污染的檢測材料。

本發(fā)明一方面可有效排除檢測待檢土壤中鉛離子的干擾，提高了所采用的苔蘚植物對鎘檢測效果的特異性，另一方面通過培植和利用對鎘敏感性最強的植株材料，進一步強化和提高了這種苔蘚植物對鎘污染的檢測效果。

本發(fā)明采用了一種對土壤中的鎘具有極高敏感性的苔蘚植物——東亞金發(fā)蘚，該種植物是一種進化程度較低的孢子植物(即在成熟期時通過孢子進行繁殖)。它結(jié)構(gòu)簡單，對鎘毒性的抵抗力低，容易受到土壤中鎘元素的毒害并快速地表現(xiàn)出癥狀，而且該種植物在外觀上不同于一般的細小苔蘚，其植株個體相對較大，成熟的植株高度可達6～8cm，受到鎘毒害后表現(xiàn)出來的癥狀非常明顯，很容易進行觀測，因此非常適合進行土壤和水體鎘污染檢測。但在實際應(yīng)用時發(fā)現(xiàn)，自然界中的東亞金發(fā)蘚，由于在長期生長過程中已對污染環(huán)境產(chǎn)生了一定適應(yīng)性，導致其對鎘的敏感度降低，若直接采集后用于土壤鎘污染檢測，則檢測效果不佳，需對其進行特殊處理后，消除其背景適應(yīng)性，以獲得最佳的植物檢測材料。此外，土壤中另一常見污染性元素鉛的存在，降低了東亞金發(fā)蘚對土壤鎘元素的檢測效果和專一性。本發(fā)明一方面可有效排除檢測待檢土壤中鉛離子的干擾，提高了所采用的苔蘚植物對鎘檢測效果的特異性，另一方面通過培植和利用對鎘敏感性最強的植株材料，進一步強化和提高了這種苔蘚植物對鎘污染的檢測效果。本發(fā)明采用了可高效排除土壤和水體中鉛離子影響的“絡(luò)合-沉淀掩蔽劑”，將其應(yīng)用于經(jīng)本發(fā)明培植獲得的具有高敏感度的東亞金發(fā)蘚植株，可較好地解決前述問題，從而為利用東亞金發(fā)蘚高精準、專一性地檢測土壤鎘污染提供了技術(shù)保障。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的提高苔蘚植物檢測土壤鎘污染靈敏度和特異性的方法流程圖。

具體實施方式

為能進一步了解本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容、特點及功效，茲例舉以下實施例，并配合附圖詳細說明如下。

本發(fā)明采用了一種對土壤中的鎘具有極高敏感性的苔蘚植物——東亞金發(fā)蘚，該種植物對鎘毒性的抵抗力低，極易受到土壤中鎘的毒害并快速地表現(xiàn)出顯著癥狀，很容易進行觀測，因此非常適合進行土壤和水體鎘污染檢測。但在實際應(yīng)用時發(fā)現(xiàn)，若直接采集自然界中的東亞金發(fā)蘚用于土壤鎘污染檢測，則檢測效果不佳，這是由于野生植株在長期生長過程中，已對污染環(huán)境產(chǎn)生了一定適應(yīng)性，導致其對鎘的敏感度降低，需通過一定手段消除其背景適應(yīng)性，以獲得最佳的植物檢測材料。此外，土壤中另一常見污染性元素鉛的存在，降低了東亞金發(fā)蘚對土壤鎘元素的檢測效果和專一性。本發(fā)明采用了可高效排除土壤和水體中鉛離子影響的“絡(luò)合-沉淀掩蔽劑”，并將其應(yīng)用于經(jīng)本發(fā)明培植獲得的具有高敏感度的東亞金發(fā)蘚植株，可較好地解決前述問題，從而實現(xiàn)了利用東亞金發(fā)蘚高精準、專一性地檢測土壤鎘污染。

本發(fā)明提供的提高苔蘚植物檢測土壤鎘污染靈敏度和特異性的方法，具體包括以下步驟：

步驟1，植物材料的培植獲得過程：①制備孢子懸液：采集孢子生長期成熟的東亞金發(fā)蘚植株的孢子體若干，放于石英研缽中，加入少許液氮后，輕輕研磨至孢子體的苞蒴(聚藏孢子的器官)完全破裂，使內(nèi)藏的孢子散出，加入蒸餾水反復沖洗研缽，將洗液一并通過網(wǎng)孔內(nèi)徑為1mm的不銹鋼濾網(wǎng)進行過濾，濾掉大部分的苞蒴殘體，從而獲得孢子懸液。②制備培養(yǎng)基質(zhì)：以體積比為1︰1的潔凈砂質(zhì)土壤和植物殘體發(fā)酵物(以花卉漚制肥料代替)為基質(zhì)配方，充分混合后作為東亞金發(fā)蘚培養(yǎng)基質(zhì)，該基質(zhì)具有質(zhì)地疏松、有機質(zhì)含量豐富、保濕性強、透氣性好等特點，適合東亞金發(fā)蘚生長。將制備好的培養(yǎng)基質(zhì)平鋪于直徑35cm、高6cm的聚乙烯淺盤中，基質(zhì)厚度為5cm。③將孢子懸液均勻噴灑于培養(yǎng)基質(zhì)中，放置于人工光照氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，初始培養(yǎng)溫度設(shè)置為20℃～25℃，光照強度設(shè)置為2000Lux/10h(該時期模擬出苗前三四月份的野外環(huán)境)，每日噴灑1/6濃度的Hogland營養(yǎng)液300-400mL/盤，使基質(zhì)濕度保持在70％～80％；30～40d后東亞金發(fā)蘚幼苗開始長出，此時將培養(yǎng)溫度設(shè)置為30℃～35℃，光照強度設(shè)置為4000Lux/14h(該時期模擬出苗后五六月份的野外環(huán)境)；出苗后50～60d進入孢子生長階段，將該時期的植株作為土壤鎘污染的檢測材料。

步驟2，土壤中干擾性鉛離子的掩蔽處理：本發(fā)明提供了一種可高效排除土壤鉛離子干擾的掩蔽劑，其組成為：0.5mol/L的氨水+0.02mol/L的氫氧化鈣。其研發(fā)依據(jù)及原理是：當環(huán)境中有鎘、鉛離子同時存在時，氨加入后首先與鎘離子發(fā)生特異性絡(luò)合反應(yīng)，其化學式為Cd²⁺+NH₃·H₂O→Cd(NH₄)₂+H₂O，反應(yīng)生成的氨-鎘絡(luò)合物仍具有與鎘離子相同的毒性；待繼續(xù)加入氫氧化鈣溶液后，該溶液中大量的氫氧根離子不能與氨-鎘絡(luò)合物反應(yīng)，但可與鉛離子迅速發(fā)生沉淀反應(yīng)，從而將其掩蔽，其化學反應(yīng)過程式為Pb²⁺+2OH^-→Pb(OH)₂↓；之所以選擇低濃度的氨水及氫氧化鈣溶液，主要在于該兩種物質(zhì)對土壤環(huán)境無任何損害，相反可適當補充土壤中植物生長所需要的大量元素N、Ca的含量，增強土壤肥力，更有利于作物的生長。

步驟3，土壤鎘污染檢測實施過程：取上述經(jīng)本發(fā)明培植獲得的的東亞金發(fā)蘚植株，移植于化學掩蔽劑處理后的待檢測土壤中，以生長在無污染基質(zhì)中的植株為對照，觀測其外觀性狀變化，并在第3～5d取樣，測定并比較植株的葉綠素含量、可溶性總蛋白含量，依據(jù)相關(guān)指標變化，綜合評價土壤鎘污染程度。

為進一步驗證本發(fā)明所涉及植株材料培植過程產(chǎn)生的效果，分別將直接采集獲得、經(jīng)本發(fā)明培植的植株材料，同時移植于含有不同濃度鎘污染的土壤中，比較兩類植株對鎘敏感度的大小。由表1數(shù)據(jù)可知，直接采集與經(jīng)本發(fā)明培植獲得的植株，對鎘的敏感度表現(xiàn)出了顯著的差異性。在任一鎘濃度下，經(jīng)本發(fā)明培植獲得植株的葉綠素含量、可溶性蛋白含量與空白對照相比，其降低幅度均大于直接采集的植株，即說明經(jīng)本發(fā)明培植獲得的植株材料，其對鎘的敏感度得到了顯著提升，因此更適合于作為土壤鎘污染的檢測材料。

為進一步驗證本發(fā)明所涉及掩蔽劑的效果，采用了無土栽培的方式，設(shè)置了多個試驗重復樣品，將東亞金發(fā)蘚植株根部浸沒于營養(yǎng)液中，分別向不同樣品營養(yǎng)液中以硝酸鹽的形式施加一定量的鎘離子、鉛離子及鎘鉛混合離子，再分別以單獨施加0.5mol/L的氨水、0.02mol/L的氫氧化鈣溶液，以及共同施加前述兩種溶液的方式進行處理(按照氨水在前、氫氧化鈣在后的順序施加)，觀測東亞金發(fā)蘚植株在不同處理環(huán)境下的生長狀況、葉綠素含量、可溶性總蛋白含量等指標參數(shù)(表2～表4)，并與不添加重金屬及掩蔽劑的空白營養(yǎng)液中的植株作對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白純培養(yǎng)液中的東亞金發(fā)蘚植株生長正常，無任何受脅迫毒害的癥狀，而添加了鎘、鉛及其混合液的植株均有明顯受害癥狀，葉綠素及可溶性蛋白含量與空白樣品相比顯著降低；單獨施加氨水不能消除單一的鎘、鉛離子及其混合液的毒性，單獨施加氫氧化鈣則可通過沉淀掩蔽作用消除單一的鎘、鉛離子及其混合液的毒性；先后施加氨水和氫氧化鈣(即本發(fā)明所涉及的掩蔽劑)則能有效地去除鎘鉛離子混合液中鉛離子的毒性而保留鎘離子的毒性。綜上可知，對于鎘鉛離子混合液來講，所涉及的化學掩蔽劑可有效地沉淀掩蔽鉛離子，從而排除其干擾。

在上述實驗的基礎(chǔ)上，將所涉及的化學掩蔽劑應(yīng)用于含有一定濃度鎘、鉛復合污染的土壤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，東亞金發(fā)蘚植株所表現(xiàn)出的生長反應(yīng)及性狀指標，均與上述水培實施例中的試驗結(jié)果相符合。綜合說明本發(fā)明適用于東亞金發(fā)蘚專一性地檢測土壤鎘污染。

本實施例中對樣品的具體處理方法及觀測效果如下表1～4所示：

表1野外采集與本發(fā)明培植獲得的植株材料對土壤鎘的敏感性比較

通過上表1中對幾種敏感性指標的檢測對比，可清楚地看出，經(jīng)過本發(fā)明技術(shù)所培植獲得的東亞金發(fā)蘚植株材料，在檢測性能上明顯優(yōu)于不經(jīng)培植過程而直接采集獲得的植株。

表2施加掩蔽劑對水培液鎘毒性的影響效果

表3施加掩蔽劑對水培液鉛毒性的影響效果

表4施加掩蔽劑對水培液鎘、鉛毒性的影響效果

通過綜合分析比較上表2～表4中的實施效果可見，在環(huán)境中有鎘、鉛同時存在的情況下，本發(fā)明所涉及掩蔽劑組合的施用，有效地排除了干擾性鉛元素的毒性影響，從而單一性地保留了鎘元素的毒性。

以上所述僅是對本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改，等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。