本發(fā)明屬于植物脫毒技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及植物組織培養(yǎng)脫毒外植體脫毒方法。

背景技術(shù)：

病毒對植物危害嚴重，病毒可導致植物樹體衰弱，果實變小并且畸形，品質(zhì)變劣，產(chǎn)量嚴重下降，病毒病屬于難治療病害，迄今還沒有一種有效的藥物。因此，培育無病毒植物苗木已經(jīng)成為防止病毒危害的主要措施。目前通常采用的培育無病毒植物苗木的方法是莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)。莖尖培養(yǎng)可以從植物組織中脫除病毒，形成無病毒(或脫毒)植株。莖尖培養(yǎng)，有時也稱微莖尖培養(yǎng)，此處所稱的莖尖實質(zhì)是指莖尖的分生區(qū)。莖尖培養(yǎng)是利用莖尖的分生區(qū)為分生組織，其中無病毒的原理，通過組織培養(yǎng)實現(xiàn)脫除病毒的目的。但莖尖大小對成活率和脫毒率有很大的影響，莖尖越大，分化率和成活率越大，但脫毒率越低；反之，如果莖尖越小，雖然脫毒率提高了，但分化率和成活率又大大降低，往往外植體死亡，造成組織培養(yǎng)脫毒失敗。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決傳統(tǒng)的莖尖培養(yǎng)法培育脫毒苗時，由于外植體太小，外植體分化為組培苗的難度較大，成苗率自然很低，往往導致接種后的外植體死亡的問題，本發(fā)明提供一種植物組織培養(yǎng)脫毒外植體，使得組織培養(yǎng)脫毒操作變得更加簡單，大大提高分化率和成活率，使得脫毒的成功率提高。

從莖的結(jié)構(gòu)上看，分生區(qū)的形態(tài)學下方是伸長區(qū)，該區(qū)域為分生區(qū)和成熟區(qū)的過渡區(qū)，伸長區(qū)的組成既有成熟組織，也有分生組織。根據(jù)這一結(jié)構(gòu)的特殊性，可以認為伸長區(qū)與分生區(qū)具有相似性，因為其中也含有分生組織，故也可以參與植物脫毒苗的培育。發(fā)明人將莖尖的分生區(qū)與伸長區(qū)(甚至包括少部分成熟區(qū)的組織)結(jié)合在一起，稱其為莖尖plus。在發(fā)明人的研究中發(fā)現(xiàn)，莖尖plus作為外植體，采取誘導胚狀體的方式可以培育出脫毒苗。采用莖尖plus作為外植體時，首先要誘導出胚性細胞，然后誘導胚狀體和莖葉分化的培養(yǎng)，最后進行生根培養(yǎng)、馴化與移栽。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種植物組織培養(yǎng)脫毒的外植體，該外植體為植物莖尖plus，包括植物莖的分生區(qū)和伸長區(qū)。

采用上述植物組織培養(yǎng)脫毒的外植體脫毒方法，包括以下步驟：取植物莖尖plus作為外植體，將其滅菌處理后進行胚性細胞培養(yǎng)，在胚性細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，進行胚狀體誘導培養(yǎng)，在胚狀體誘導培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進行莖葉分化培養(yǎng)，然后取無根苗進行病毒檢測，挑選病毒陰性的無根苗繼續(xù)進行增殖培養(yǎng)，擴大繁殖量并進行生根培養(yǎng)，篩選適宜的根系馴化、移栽。

進一步的，上述方法包括以下步驟：

(1)將休眠季或生長季的植物莖尖plus作為外植體用流水清洗，放入30～50wt％大蒜水溶液中滅菌20～40min；

(2)滅菌后的外植體立即接種在最適胚性細胞培養(yǎng)基中，經(jīng)8～10周培養(yǎng)形成大量的胚性細胞團后，轉(zhuǎn)移到最適胚狀體誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

(3)經(jīng)4～6周培養(yǎng)形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，并將這些小塊置于最適莖葉分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

(4)待莖葉分化階段的無根苗達到較大數(shù)量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測，將檢測結(jié)果為陰性的無根苗繼續(xù)在莖葉分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，到一定數(shù)量后再將其轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，

(5)待長出良好的根系后馴化、移栽。

進一步的，所述的最適胚性細胞培養(yǎng)基包括：1.0～3.5mg/L 6-BA，0.1～0.8mg/L NAA。

進一步的，所述的最適胚狀體誘導培養(yǎng)基包括：0.5～4.0mg/L 6-BA。

進一步的，所述的最適莖葉分化培養(yǎng)基包括：0.01～0.05mg/L 6-BA。

進一步的，所述的生根培養(yǎng)基包括：0.2～3.5mg/L IBA。

所述的馴化為：將長出良好的根系轉(zhuǎn)移到珍珠巖和沙土上進行馴化。

進一步的，所述步驟(5)中，馴化后將根系移栽在中性土壤中。

本發(fā)明另一個目的是請求保護雙子葉植物莖尖plus在組織培養(yǎng)脫毒中的應用。

采用莖尖plus作為外植體，在脫除植物病毒方面具有如下優(yōu)勢：

1、操作方便。傳統(tǒng)的莖尖培養(yǎng)培育脫毒苗，由于所取外植體太小(一般外植體長度不超過1mm)，工作人員需要在體視顯微鏡下，才能獲取外植體。而且由于外植體太小，很難用鑷子夾住并將其接種到培養(yǎng)基上，導致操作速度慢，操作不便。采用莖尖plus作為外植體，由于外植體較大(分生區(qū)長度1mm左右，伸長區(qū)的長度為3～5mm，故莖尖plus的長度為4～6mm)，不存在上述操作難度大等問題，且無需體視顯微鏡也可以較為準確的切割外植體。

2、分化率和成活率很高，提高無毒苗培育率。傳統(tǒng)的莖尖培養(yǎng)培育脫毒苗，由于外植體太小，外植體分化為組培苗的難度較大，成苗率自然很低，往往導致接種后的外植體死亡，導致實驗研究失敗。采用莖尖plus作為外植體，由于外植體較大，分化率和成活率相對較高。

3、采用莖尖plus作為外植體，即使生成極少量的脫毒苗，也可以通過組培快速地繁殖起來，不影響脫毒培養(yǎng)。

附圖說明

圖1為蘋果主要病毒ACLSV RT-PCR產(chǎn)物電泳圖；

圖2為甜櫻桃主要病毒PNRSV RT-PCR產(chǎn)物電泳圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但本發(fā)明不以任何形式受限于實施例內(nèi)容。實施例中所述試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；如無特殊說明，所述試劑和生物材料，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1：

選雙子葉植物“紅富士”蘋果生長期的莖尖plus作為外植體，流水沖洗后，放入到30％大蒜水溶液滅菌30min，立即接種在最適胚性細胞培養(yǎng)基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經(jīng)8～10周培養(yǎng)形成大量的胚性細胞團后，轉(zhuǎn)移到最適胚狀體誘導培養(yǎng)基(LS+6-BA 2.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養(yǎng)，經(jīng)4～6周培養(yǎng)形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成0.3～1.0cm3小塊，并將這些小塊置于最適莖葉分化培養(yǎng)基(LS+BA 0.02mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養(yǎng)。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數(shù)量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測，如電泳圖圖1所示。本次檢測的病毒是蘋果主要病毒之一，即蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)。檢測結(jié)果為陰性，即圖1中沒有出現(xiàn)長度為358bp病毒特異性片段。然后將無根苗繼續(xù)在莖葉分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，到一定數(shù)量后再將其轉(zhuǎn)到適宜的生根培養(yǎng)基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中進行生根培養(yǎng)，至長出良好的根系后轉(zhuǎn)移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最后移栽在中性壤土中。脫毒成功率可達到3.5～5.6％。

實施例2：

選雙子葉植物“紅富士”蘋果休眠期的葉芽，流水沖洗后，剝?nèi)パ客饷娴镊[片，放入到50％大蒜水溶液滅菌30min，切取芽前端的莖尖plus作為外植體，立即接種在最適胚性細胞培養(yǎng)基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經(jīng)8～10周培養(yǎng)形成大量的胚性細胞團后，轉(zhuǎn)移到最適胚狀體誘導培養(yǎng)基(LS+BA2.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養(yǎng)，經(jīng)4～6周培養(yǎng)形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，并將這些小塊置于最適莖葉分化培養(yǎng)基(LS+BA0.02mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養(yǎng)。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數(shù)量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測。本次檢測的病毒是ACLSV。然后將檢測結(jié)果為陰性的無根苗繼續(xù)在莖葉分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，到一定數(shù)量后再將其轉(zhuǎn)到適宜的生根培養(yǎng)基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中進行生根培養(yǎng)，至長出良好的根系后轉(zhuǎn)移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最后移栽在中性壤土中，脫毒成功率可達到3.2～4.6％。

實施例3：

選雙子葉植物“佳紅”甜櫻桃生長期的葉片莖尖plus作為外植體，流水沖洗后，放入到30％大蒜水溶液滅菌30min，立即接種在最適胚性細胞培養(yǎng)基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經(jīng)7～8周培養(yǎng)形成大量的胚性細胞團后，轉(zhuǎn)移到最適胚狀體誘導培養(yǎng)基(LS+BA 1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養(yǎng)，經(jīng)4～5周培養(yǎng)形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，并將這些小塊置于最適莖葉分化培養(yǎng)基(LS+BA0.05mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養(yǎng)。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數(shù)量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測，如圖2所示。本次檢測的病毒是甜櫻桃主要病毒之一，即李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV)。檢測結(jié)果為陰性(即電泳圖中沒有出現(xiàn)長度為449bp病毒特異性片段)然后將檢測結(jié)果為陰性的無根苗繼續(xù)在莖葉分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，到一定數(shù)量后再將其轉(zhuǎn)到適宜的生根培養(yǎng)基中(1/2MS+IBA1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中進行生根培養(yǎng)，至長出良好的根系后轉(zhuǎn)移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最后移栽在中性壤土中，脫毒成功率可達到5.3～7.1％。

實施例4：

選雙子葉植物“佳紅”甜櫻桃休眠期的葉芽，流水沖洗后，剝?nèi)パ客饷娴镊[片，放入到50％大蒜水溶液滅菌30min，切取芽前端的莖尖plus作為外植體，立即接種在最適胚性細胞培養(yǎng)基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經(jīng)7～8周培養(yǎng)形成大量的胚性細胞團后，轉(zhuǎn)移到最適胚狀體誘導培養(yǎng)基(LS+BA 1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養(yǎng)，經(jīng)4～5周培養(yǎng)形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，并將這些小塊置于最適莖葉分化培養(yǎng)基(LS+BA0.05mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養(yǎng)。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數(shù)量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測。本次檢測的病毒是李屬壞死環(huán)斑病毒。然后將檢測結(jié)果為陰性的無根苗繼續(xù)在莖葉分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，到一定數(shù)量后再將其轉(zhuǎn)到適宜的生根培養(yǎng)基中(1/2MS+IBA1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中進行生根培養(yǎng)，至長出良好的根系后轉(zhuǎn)移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最后移栽在中性壤土中，脫毒成功率可達4.8～7.6％。

試驗例

一.“紅富士”蘋果ACLSV RT-PCR檢測技術(shù)體系：

1.總RNA的提取

⑴取50～100mg葉片(包括待檢測“紅富士”蘋果繼代組培苗、陰性和陽性指示植物GF305葉片)，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5mL Eppendorf管中，加入600μL RNA提取緩沖液(50mmol/L TrisCl、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS及2％PVP，用1‰DEPC水配制，pH8.0)，1μL RNasin混勻。4℃，12000rpm，離心15min。

⑵取上清，加入等體積氯仿：異戊醇(24∶1)溶液，混勻，4℃，12000rpm，離心10min。重復1～2次，直至不再出現(xiàn)蛋白層。

⑶取水相，加2.5倍體積的無水乙醇及1/10體積3mol/L NaAc(pH5.3)，混勻。-20℃靜置2h。取出后，于4℃，12000rpm，離心15min。

⑷棄上清，用200μL 70％無水乙醇洗沉淀，于4℃，12000rpm，5min，清洗多次，至沉淀為純白色。

⑸室溫下干燥后15min左右，溶于30μL 1‰DEPC水中，-20℃保存。

2.RT優(yōu)化體系及程序：

⑴反應體系：dNTPs 125μmol/L；5×Buffer 1.0μl；RNasin 8U；MgCl₂1.05mmol/L；Cl-Pc 0.60μmol/L；Mo-MLV RTase 50U；總RNA模板0.5μl；用DEPC水補足10μl。

⑵反應程序：37℃，1～1.5h；95℃，5min。

3.PCR優(yōu)化體系及程序：

⑴反應體系：dNTPs 100μmol/L；10×Buffer(10x)2.5μl；MgCl₂1.5mmol/L；Cl-Pc 0.6μmol/L；Cl-P_h 0.64μmol/L；TaqE 1U；RT產(chǎn)物10μl；用DEPC水補足25μl。

⑵反應程序：94℃1min；52℃2min；72℃2min；循環(huán)25～30次，最后一次延伸5min。

二.“佳紅”甜櫻桃PNRSV RT-PCR檢測技術(shù)體系：

1.總RNA的提取

⑴取50～100mg葉片(包括待檢測“佳紅”甜櫻桃繼代組培苗、陰性和陽性指示植物GF305葉片)，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5mL Eppendorf管中，加入600μL RNA提取緩沖液(50mmol/L TrisCl、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS及2％PVP，用1‰DEPC水配制，pH8.0)，1μL RNasin混勻。4℃，12000rpm，離心15min。

⑵取上清，加入等體積氯仿：異戊醇(24∶1v/v)溶液，混勻，4℃，12000rpm，離心10min。重復1～2次，直至不再出現(xiàn)蛋白層。

⑶取水相，加2.5倍體積的無水乙醇及1/10體積3mol/L NaAc(pH5.3)，混勻。-20℃置2h。取出后，4℃，12000rpm，離心15min。

⑷棄上清，用200μL 70％無水乙醇洗沉淀，4℃，12000rpm，5min，清洗多次，至沉淀為純白色。

⑸室溫下干燥后15min左右，溶于30μL 1‰DEPC水中，-20℃保存。

2.RT優(yōu)化體系及程序：

⑴反應體系：dNTPs 125μmol/L；RT Buffer 1μl；RNasin 8U；MgCl₂1.13mmol/L；Nr-Pc 0.496μmol/L；Mo-MLV RTase 50U；總RNA模板0.5μl。

⑵反應程序：37℃1～1.5h；95℃5min。

3.PCR優(yōu)化體系及程序：

⑴反應體系：dNTPs 100μmol/L；PCR Buffer 2.5μl；MgCl₂1.2mmol/L；Nr-Pc0.396μmol/L；Nr-P_h 0.456μmol/L；TaqE 1U；RT產(chǎn)物10μl，用DEPC水補足25μl。⑵反應程序：94℃30sec；54℃1min；72℃1min，循環(huán)25～30次，最后一輪延伸5min。

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