本發(fā)明涉及蟲體培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種廣州管圓線蟲體外培養(yǎng)基和體外培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

線蟲是地球上最為豐富的物種之一，廣泛分布于自然界中，其中寄生于人體并導(dǎo)致疾病的寄生線蟲有60余種。寄生線蟲具有復(fù)雜的生活史，既可以引起各種復(fù)雜的疾病，也是研究病原體致病基因或病原體-宿主相互關(guān)系的理想模型，但是線蟲的寄生特性和復(fù)雜的生活史，使得相關(guān)的研究工作進(jìn)展緩慢。

建立一種寄生線蟲體外培養(yǎng)的體系和方法，可以實現(xiàn)在體外條件下培養(yǎng)寄生線蟲，有助于運用現(xiàn)代的基因編輯技術(shù)進(jìn)行寄生蟲的功能基因研究，探討其致病機(jī)制，為抗寄生蟲藥物的開發(fā)提供條件和基礎(chǔ)。

廣州管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis）是一種可引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦脊髓膜炎的寄生線蟲。該疾病主要流行于東南亞地區(qū)、太平洋島嶼，我國主要在臺灣、廣東、浙江和黑龍江等地，若誤食感染廣州管圓線蟲的生或半生的螺類，感染期幼蟲（III期）經(jīng)消化道侵入體內(nèi)后，隨血液循環(huán)移行并侵入腦組織，從而引發(fā)該疾病。廣州管圓線蟲終宿主是大鼠，寄生在鼠肺動脈。成熟雌蟲產(chǎn)卵，卵在肺動脈內(nèi)孵出幼蟲（I期幼蟲），I期幼蟲穿過肺泡并進(jìn)入支氣管，最后入消化道，隨糞便排出體外。當(dāng)鼠糞被淡水螺或陸生螺吞食后，I期幼蟲可在螺體內(nèi)發(fā)育，經(jīng)過2 次蛻皮，發(fā)育到III期幼蟲（感染期）；當(dāng)大鼠吞食含有III期幼蟲的螺后，幼蟲在消化道內(nèi)穿過腸壁、侵入鼠體。人不是廣州管圓線蟲的適宜宿主，侵入腦內(nèi)的感染期幼蟲不能發(fā)育成熟，但可引起腦組織炎癥反應(yīng)。小鼠也是非適宜宿主，因此，小鼠是廣州管圓線蟲病研究的常用實驗動物。本專利申請人采用中間宿主藁桿雙臍螺和終宿主大鼠，在實驗室建立了廣州管圓線蟲的生活史，并在此基礎(chǔ)上建立了一種蟲卵和各期幼蟲體外培養(yǎng)方法，明確了蟲體培養(yǎng)的相關(guān)試劑和培養(yǎng)條件，從而實現(xiàn)了蟲體從蟲卵發(fā)育到I期幼蟲，以及各期幼蟲在體外的培養(yǎng)。本發(fā)明提供了一種簡單和高效的廣州管圓線蟲體外培養(yǎng)技術(shù)和方法，為寄生線蟲的新藥篩選、功能基因和致病機(jī)制研究提供了有效的研究基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種廣州管圓線蟲體外培養(yǎng)基。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種廣州管圓線蟲體外培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種廣州管圓線蟲體外培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括蟲卵培養(yǎng)基、I期幼蟲培養(yǎng)基、III期幼蟲培養(yǎng)基、IV期幼蟲培養(yǎng)基和V期幼蟲培養(yǎng)基，所述蟲卵培養(yǎng)基、I期幼蟲培養(yǎng)基、III期幼蟲培養(yǎng)基、IV期幼蟲培養(yǎng)基和V期幼蟲培養(yǎng)基中均含有兩性霉素B。

優(yōu)選地，所述兩性霉素B分別在蟲卵培養(yǎng)基、I期幼蟲培養(yǎng)基、III期幼蟲培養(yǎng)基、IV期幼蟲培養(yǎng)基和V期幼蟲培養(yǎng)基中的終濃度為0.5μg/mL。

優(yōu)選地，所述蟲卵培養(yǎng)基包含Ham’s F-12培養(yǎng)基和復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B。

優(yōu)選地，所述I期幼蟲培養(yǎng)基包含DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、膽固醇乙醇溶液、胎牛血清、螺組織提取液和復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B。

更優(yōu)選地，所述I期幼蟲培養(yǎng)基包含DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、0.1%的5 mg/ml膽固醇乙醇溶液、20%胎牛血清、1%螺組織提取液和0.1%復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B。

優(yōu)選地，所述III期幼蟲培養(yǎng)基、IV期幼蟲培養(yǎng)基、V期幼蟲培養(yǎng)基均包含Waymouth’s 培養(yǎng)基、胎牛血清、和復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B。

更優(yōu)選地，所述III期幼蟲培養(yǎng)基、IV期幼蟲培養(yǎng)基、V期幼蟲培養(yǎng)基均包含Waymouth’s 培養(yǎng)基、20%胎牛血清、和0.1%復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B。

優(yōu)選地，所述螺組織提取液的制備方法為：將螺清洗后，加入氯化鈉等滲溶液，經(jīng)組織破碎、離心后取上清，過濾即得。

本發(fā)明還提供一種廣州管圓線蟲蟲卵的分離培養(yǎng)方法，是將已感染廣州管圓線蟲60d的大鼠進(jìn)行解剖處理，挑出血管內(nèi)的成蟲，將成蟲清洗后放入蟲卵培養(yǎng)基中孵育，孵育一段時間后，挑出成蟲，剩余的蟲卵置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10d即可。

現(xiàn)有技術(shù)中對于在體外培養(yǎng)廣州管圓線蟲蟲卵發(fā)育至I期幼蟲的過程中，一般會選擇40d左右的已感染廣州管圓線蟲的大鼠，但是發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，選擇40d左右的已感染廣州管圓線蟲的大鼠的成蟲挑出的蟲卵孵育成I期幼蟲，孵化率很低，一般只有30%，但是選擇已感染廣州管圓線蟲60d的大鼠，在相同培養(yǎng)基中孵化，其蟲卵孵化為I期幼蟲的概率高很多。

本發(fā)明還提供一種廣州管圓線蟲的體外培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）蟲卵的分離培養(yǎng)：將已感染廣州管圓線蟲60d的大鼠進(jìn)行解剖處理，挑出血管內(nèi)的成蟲，將成蟲清洗后放入蟲卵培養(yǎng)基中孵育，孵育一段時間后，挑出成蟲，剩余的蟲卵置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10d即可；所述蟲卵培養(yǎng)基包含Ham’s F-12培養(yǎng)基和復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B；

（2）I期幼蟲的分離培養(yǎng)：按常規(guī)方法分離出I期幼蟲，并置于I期幼蟲培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可；所述I期幼蟲培養(yǎng)基包含DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、膽固醇乙醇溶液、胎牛血清、螺組織提取液和復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B；

（3）III期幼蟲的分離培養(yǎng)：按常規(guī)方法分離出III期幼蟲，并置于III期幼蟲培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可；所述III期幼蟲培養(yǎng)基包含Waymouth’s 培養(yǎng)基、胎牛血清、和復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B；

（4）IV期幼蟲的分離培養(yǎng)：按常規(guī)方法分離出IV期幼蟲，并置于IV期幼蟲培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可；所述IV期幼蟲培養(yǎng)基包含Waymouth’s 培養(yǎng)基、胎牛血清、和復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B；

（5）V期幼蟲的分離培養(yǎng)：按常規(guī)方法分離出V期幼蟲，并置于V期幼蟲培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可；所述V期幼蟲培養(yǎng)基包含Waymouth’s 培養(yǎng)基、胎牛血清、和復(fù)合抗生素，所述復(fù)合抗生素含有青霉素G鉀、硫酸鏈霉素和兩性霉素B。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供一種廣州管圓線蟲體外培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括蟲卵培養(yǎng)基、I期幼蟲培養(yǎng)基、III期幼蟲培養(yǎng)基、IV期幼蟲培養(yǎng)基和V期幼蟲培養(yǎng)基，所述蟲卵培養(yǎng)基、I期幼蟲培養(yǎng)基、III期幼蟲培養(yǎng)基、IV期幼蟲培養(yǎng)基和V期幼蟲培養(yǎng)基中均含有兩性霉素B；通過在廣州管圓線蟲培養(yǎng)中加入兩性霉素，可防止體外培養(yǎng)廣州管圓線蟲的污染，通過將已感染廣州管圓線蟲60d的大鼠進(jìn)行解剖處理，挑出血管內(nèi)的成蟲，將成蟲清洗后放入蟲卵培養(yǎng)基中孵育，孵育一段時間后，挑出成蟲，剩余的蟲卵置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10d，80%的蟲卵可成功發(fā)育為I期幼蟲，且體外培育的I期幼蟲，III期幼蟲，IV期幼蟲，V期幼蟲均可在體外長期存活，本發(fā)明的研究為廣州管圓線蟲的體外研究和應(yīng)用提供了堅實的基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為體外培養(yǎng)廣州管圓線蟲從蟲卵發(fā)育到I期幼蟲。

圖2為 I期和III期幼蟲培養(yǎng)不同天數(shù)后分別感染藁桿雙臍螺和大鼠的感染率。

具體實施方式

下面將結(jié)合說明書附圖和具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若無特別說明，實施例中所用的實驗方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法和技術(shù)，試劑或材料均為通過商業(yè)途徑得到，具體實施方式中所設(shè)計到的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。

實施例1

一、試劑及溶液的配制

復(fù)合抗生素：青霉素G鉀，硫酸鏈霉素，兩性霉素B，分別用無菌水配制，0.2μm濾膜過濾除菌，配制復(fù)合抗生素溶液，復(fù)合抗生素溶液中青霉素G鉀的終濃度為100,000 units/ml，硫酸鏈霉素的終濃度為50mg/ml，兩性霉素的終濃度為0.5mg/ml。

蟲卵培養(yǎng)基：按照1：1000的體積比將制備得到的復(fù)合抗生素溶液加入到Ham’F-12（GBICO）培養(yǎng)液中。

等滲氯化鈉溶液：2.8 mg/ml NaCl，0.043 mg/ml Na₂HPO₄·12H₂O，0.097 mg/ml KCl，0.42 mg/ml CaCl₂，0.325 mg/ml MgCl₂·6H₂O，配置500mL，0.22μm濾膜過濾除菌。

螺組織提取液：150只螺體的頭足部在等滲氯化鈉溶液中清洗，組織中加入4ml等滲氯化鈉溶液，用組織破碎儀破碎，再700×g 離心 5 分鐘，上清通過0.22μm 濾膜除菌，等滲氯化鈉溶液補(bǔ)足到10ml（測定濃度）。

膽固醇乙醇溶液：膽固醇粉末溶于100%乙醇中，配置成5mg/ml膽固醇溶液。

CBSS緩沖液：2.8g NaCl，0.15g KCl，0.07g Na₂HPO₄，0.45g MgSO₄·7H₂O，0.53g CaCl₂·2H₂O，0.05g NaHCO₃，上述成分溶解于滅菌水，調(diào)pH值至7.4， 0.22μm濾膜過濾除菌，定容至1L。

I期幼蟲培養(yǎng)基：DMEM/F12（GIBCO）+20%胎牛血清+1%螺組織提取液+0.1%的5mg/ml膽固醇乙醇溶液，再按照1：1000的體積比加入制備得到的復(fù)合抗生素溶液。

III期幼蟲培養(yǎng)基：Waymouth’s（GIBCO）+10%胎牛血清，再按照1：1000的體積比加入制備得到的復(fù)合抗生素溶液。

二、廣州管圓線蟲蟲卵分離純化培養(yǎng)

將已感染廣州管圓線蟲2個月的陽性大鼠，用10%的水合氯醛麻醉，待其眼球無反應(yīng)后，摘其眼球放血，之后置于超凈臺內(nèi)剖開腹部，將肺部連同心臟取出，放于干凈的培養(yǎng)皿中，用鑷子小心的撕開肺部血管，沿著血管挑出成蟲，成蟲主要集中于血管內(nèi)。

將挑出的20條雌性成蟲在含有抗生素的HBSS緩沖液中，清洗3次，清洗后的成蟲放入步驟一制備得到的蟲卵培養(yǎng)基中，37 ℃下孵育3小時。

3小時后將成蟲從皿中挑走，剩下的液體（含有蟲卵）全部均勻的轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μl，在顯微鏡下觀察，20條雌性成蟲約產(chǎn)出200顆蟲卵；之后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中，在37℃，8% CO₂下培養(yǎng)，至幼蟲孵出期間不需更換培養(yǎng)基；7天后開始有I期幼蟲孵出，10天后80%的蟲卵全部發(fā)育為I期幼蟲。

三、廣州管圓線蟲I期幼蟲分離純化培養(yǎng)

收集已感染廣州管圓線蟲80天的陽性大鼠的糞便20粒，200目篩網(wǎng)置于沉淀杯上，加入過濾水至液面略高于篩網(wǎng)，篩網(wǎng)上放置雙層擦鏡紙，取大鼠糞便平鋪于擦鏡紙上，室溫放置3h，棄去大部分上清，收集杯底的I期幼蟲于15ml離心管中，管口加上雙層篩網(wǎng)，倒扣于含有CBSS緩沖液（含復(fù)合抗生素）的培養(yǎng)皿中，室溫放置半小時，1000 rpm，5分鐘 離心，吸取沉淀，在體視顯微鏡下計數(shù)，約有10000條I期幼蟲，再加入10ml含復(fù)合抗生素的CBSS緩沖液。

按體積比1000：1.3加入13μl的次氯酸鈉，消毒10分鐘，1000 rpm，5分鐘離心，將沉淀用巴氏吸管吸出，加入到2ml的I期幼蟲培養(yǎng)基，均勻的轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1ml，平均每孔有500條I期幼蟲，在28℃，5% CO₂下培養(yǎng)，每隔兩天更換一次培養(yǎng)基。

I期幼蟲在體外培養(yǎng)過程中可存活1個多月以上的時間，通過顯微鏡的觀察，蟲體在體外培養(yǎng)的時間內(nèi)都有很好的活力，但蟲體感染螺體的能力會隨培養(yǎng)時間的延長而減弱。

四、廣州管圓線蟲III期幼蟲分離純化培養(yǎng)

將已感染廣州管圓線蟲21天的5只藁桿雙臍螺碾碎，每只螺放入含有1ml消化液（1.5mg胃蛋白酶溶于含有7μl濃鹽酸的1ml水）的EP管中，37℃下消化1小時。

1小時后，將消化液（含III期幼蟲）倒于培養(yǎng)皿中，加入2ml的生理鹽水，終止消化液的消化作用，在體視顯微鏡下對蟲子進(jìn)行計數(shù)，每只螺約有500條III期幼蟲，共有2500條III期幼蟲，將蟲子轉(zhuǎn)移到10ml含有抗生素的CBSS緩沖液中。

按體積比1000：1.3加入13μl的次氯酸鈉，消毒10分鐘，1000 rpm，5分鐘 離心，加入5ml的III期幼蟲培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1ml，平均每孔500條III期幼蟲，在28℃，5% CO₂下培養(yǎng)，每隔兩天換一次培養(yǎng)基。

體外培養(yǎng)的III期幼蟲可在體外存活1月多以上的時間，并可以保持很好的活力，而且感染老鼠的能力不會有所減弱。

五、廣州管圓線蟲IV期幼蟲分離純化培養(yǎng)

將已感染廣州管圓線蟲14 d的陽性大鼠，用10%的水合氯醛麻醉，待其眼球無反應(yīng)后，摘其眼球放血，之后置于超凈臺內(nèi)取出大鼠腦部，放于含有HBSS（含復(fù)合抗生素）的干凈培養(yǎng)皿中，用鑷子小心的撕開腦組織，肉眼挑出IV期幼蟲，每只大鼠感染50條廣州管圓線蟲，共收集35條IV期幼蟲。

將挑出的35條IV期幼蟲在含有抗生素的HBSS緩沖液中，清洗3次，清洗后的幼蟲放入IV期幼蟲培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1ml培養(yǎng)基，平均每孔5條IV期幼蟲，在28℃，5% CO₂下培養(yǎng)，每隔兩天換一次培養(yǎng)基。在體外培養(yǎng)的條件下，蟲體可以存活1個月左右時間，期間可保持較好的活力。

六、廣州管圓線蟲V期幼蟲分離純化培養(yǎng)

將已感染廣州管圓線蟲28 d的陽性大鼠，用10%的水合氯醛麻醉，待其眼球無反應(yīng)后，摘其眼球放血，之后置于超凈臺內(nèi)取出大鼠腦部，放于含有HBSS（含復(fù)合抗生素）的干凈培養(yǎng)皿中，用鑷子小心的撕開腦組織，肉眼挑出V期幼蟲，每只大鼠感染50條廣州管圓線蟲，共收集34條V期幼蟲。

將挑出的34條V期幼蟲在含有抗生素的HBSS緩沖液中，清洗3次，清洗后的幼蟲放入V期幼蟲培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1ml培養(yǎng)基，平均每孔5條V期幼蟲，在28℃，5% CO₂下培養(yǎng)，每隔兩天換一次培養(yǎng)基。V期幼蟲可在體外存活1個月左右時間，期間可保持較好的活力。

對比例1

實驗方法同實施例1中步驟二的廣州管圓線蟲蟲卵分離純化培養(yǎng)，唯一不同的是：將已感染廣州管圓線蟲40d的陽性大鼠用于成蟲蟲卵的收集。

結(jié)果顯示：從40 d的陽性大鼠中獲取的成蟲，有較弱的體外排卵能力，卵的質(zhì)量較差，不容易在體外發(fā)育成I期幼蟲，且會有畸形卵的排出，相對而言，60 d的陽性大鼠中的成蟲有很好的排卵能力，且排卵數(shù)量相對較多，蟲卵質(zhì)量也很好，可保證80%的蟲卵發(fā)育。

對比例2

實驗方法同實施例1中廣州管圓線蟲各個時期的分離純化培養(yǎng)，唯一不同的是，蟲卵培養(yǎng)基為 Ham’F-12（GBICO）培養(yǎng)液；I期幼蟲培養(yǎng)基為DMEM/F12（GIBCO）+20%胎牛血清+1%螺組織提取液+0.1%的5mg/ml膽固醇乙醇溶液；III期幼蟲培養(yǎng)基為Waymouth’s（GIBCO）+10%胎牛血清；IV期幼蟲培養(yǎng)基為Waymouth’s（GIBCO）+20%胎牛血清；V期幼蟲培養(yǎng)基為Waymouth’s（GIBCO）+20%胎牛血清。

結(jié)果顯示：無兩性霉素B的培養(yǎng)基容易發(fā)生污染，會影響到蟲卵的發(fā)育，菌類的生長使蟲卵的發(fā)育空間受限，攝取的營養(yǎng)也會減少，降低了蟲卵的發(fā)育能力。