本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備荔枝菌母種的組織分離方法。

背景技術(shù)：

荔枝菌(Litchi chinensis Bacterium)是生長(zhǎng)在廣東地區(qū)荔枝林潮濕白蟻窩上，經(jīng)過(guò)高溫多雨、驟出太陽(yáng)驟降大雨催谷，迅速生長(zhǎng)起來(lái)的食用菌，素稱為“菌中之王”。能冠宇如此稱號(hào)，是因?yàn)槔笾婢呷赓|(zhì)細(xì)嫩、口感清香、味道鮮甜等獨(dú)特風(fēng)味，加之其對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求十分苛刻，只生長(zhǎng)在荔枝林內(nèi)潮濕的白蟻窩上，無(wú)法人工培植，每年生長(zhǎng)周期只有短短20來(lái)天，愈加顯得荔枝菌的彌足珍貴。目前有關(guān)荔枝菌的研究集中在其菌絲體培養(yǎng)條件的篩選，尚無(wú)其母種分離技術(shù)的報(bào)道，而母種培育制種是實(shí)現(xiàn)荔枝菌人工培植的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，以期在最大限度保持野生荔枝菌菌株特性的同時(shí)獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)的荔枝菌菌種，為實(shí)現(xiàn)荔枝菌的人工高產(chǎn)栽培奠定基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為40～45％的幼嫩子實(shí)體，去雜，無(wú)菌水洗凈后用75～90％乙醇浸泡50～90s，無(wú)菌水沖洗3遍，再用3％NaClO、0.1％HgCl₂或0.1％2，4－己二烯酸鉀浸泡1.5min，無(wú)菌水沖洗3遍，無(wú)菌解剖刀輕輕切開(kāi)子實(shí)體，挑取其中大小為0.25～0.35cm³的中間組織接種即得純培養(yǎng)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述子實(shí)體為菌柄與菌蓋銜接處、菌蓋、菌褶、菌柄或擔(dān)孢子。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述中間組織的接種培養(yǎng)基按重量份包括荔枝殼粉50～60份、瓊脂粉20～25份、葡萄糖5～8份、馬鈴薯10～20份、白蟻巢浸提液25～35份。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述荔枝殼粉的粒度為60～100目。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基還含有濃度為60～90U/ml的鹽酸四環(huán)素。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述白蟻巢浸提液的提取方法為收集白蟻蟻巢，風(fēng)干，以1:1.2～1.5g/ml的比例加入冷水浸泡6～10min，煮沸12～15min后冷卻至室溫，過(guò)濾即得白蟻巢浸提液。

組織分離是利用菌體幼嫩的活組織在適宜的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件下由子實(shí)體發(fā)育階段回復(fù)到菌絲生長(zhǎng)階段，是獲得純菌種的一種方法，它比孢子培養(yǎng)法簡(jiǎn)便，培養(yǎng)時(shí)間短，不易污染雜菌，成活率高，能保持原菌株的特性，遺傳穩(wěn)定變異小，不僅適于孢子不易收集或萌發(fā)的食用菌，也適于穩(wěn)定優(yōu)良品種的遺傳性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用組織分離的方法制備荔枝菌母種，分離全過(guò)程均保持無(wú)菌操作，結(jié)合野生荔枝菌的生長(zhǎng)習(xí)性同時(shí)在培養(yǎng)基中添加適量抗生素，抑制雜菌生長(zhǎng)，能最大限度保持野生荔枝菌菌株特性，所獲得的母種菌絲健壯、顏色潔白、生長(zhǎng)迅速，為實(shí)現(xiàn)荔枝菌的人工高產(chǎn)栽培奠定了產(chǎn)業(yè)技術(shù)基礎(chǔ)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值大。

具體實(shí)施方式

為使本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

1.白蟻巢浸提液的提取

實(shí)施例1

收集白蟻蟻巢，風(fēng)干，以1:1.2g/ml的比例加入冷水浸泡6min，煮沸12min后冷卻至室溫，過(guò)濾即得白蟻巢浸提液。

實(shí)施例2

收集白蟻蟻巢，風(fēng)干，以1:1.35g/ml的比例加入冷水浸泡8min，煮沸13.5min后冷卻至室溫，過(guò)濾即得白蟻巢浸提液。

實(shí)施例3

收集白蟻蟻巢，風(fēng)干，以1:1.5g/ml的比例加入冷水浸泡10min，煮沸15min后冷卻至室溫，過(guò)濾即得白蟻巢浸提液。

2.接種培養(yǎng)基配方

實(shí)施例4

60目荔枝殼粉50份、瓊脂粉20份、葡萄糖5份、馬鈴薯10份、白蟻巢浸提液25份，鹽酸四環(huán)素的濃度為60U/ml。

實(shí)施例5

80目荔枝殼粉55份、瓊脂粉22.5份、葡萄糖6.5份、馬鈴薯15份、白蟻巢浸提液30份，鹽酸四環(huán)素的濃度為75U/ml。

實(shí)施例6

100目荔枝殼粉60份、瓊脂粉25份、葡萄糖8份、馬鈴薯20份、白蟻巢浸提液35份，鹽酸四環(huán)素的濃度為90U/ml。

3.組織分離法制備荔枝菌母種

實(shí)施例7

一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為40％的幼嫩菌柄與菌蓋銜接處子實(shí)體，去雜，無(wú)菌水洗凈后用75％乙醇浸泡50s，無(wú)菌水沖洗3遍，再用3％NaClO浸泡1.5min，無(wú)菌水沖洗3遍，無(wú)菌解剖刀輕輕切開(kāi)子實(shí)體，挑取其中大小為0.25cm³的中間組織接種至實(shí)施例4培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)4～6d，直至菌絲長(zhǎng)滿，菌絲濃密，粗壯，潔白狀態(tài)即得純培養(yǎng)物。

所得純培養(yǎng)物在1～4℃條件下保存?zhèn)溆茫蛘呒纯捎糜诜敝吃N。

實(shí)施例8

一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為42.5％的幼嫩菌蓋子實(shí)體，去雜，無(wú)菌水洗凈后用82.5％乙醇浸泡70s，無(wú)菌水沖洗3遍，再用0.1％HgCl₂浸泡1.5min，無(wú)菌水沖洗3遍，無(wú)菌解剖刀輕輕切開(kāi)子實(shí)體，挑取其中大小為0.30cm³的中間組織接種至實(shí)施例5培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)4～6d，直至菌絲長(zhǎng)滿，菌絲濃密，粗壯，潔白狀態(tài)即得純培養(yǎng)物。

所得純培養(yǎng)物在1～4℃條件下保存?zhèn)溆?，或者即可用于繁殖原種。

實(shí)施例9

一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為45％的幼嫩菌柄與菌蓋銜接處、菌蓋、菌褶、菌柄或擔(dān)孢子子實(shí)體，去雜，無(wú)菌水洗凈后用90％乙醇浸泡90s，無(wú)菌水沖洗3遍，再用0.1％2，4－己二烯酸鉀浸泡1.5min，無(wú)菌水沖洗3遍，無(wú)菌解剖刀輕輕切開(kāi)子實(shí)體，挑取其中大小為0.35cm³的中間組織接種至實(shí)施例6培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)4～6d，直至菌絲長(zhǎng)滿，菌絲濃密，粗壯，潔白狀態(tài)即得純培養(yǎng)物。

所得純培養(yǎng)物在1～4℃條件下保存?zhèn)溆?，或者即可用于繁殖原種。

顯然，上述9個(gè)實(shí)施例僅是本發(fā)明的部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例?；诒景l(fā)明的啟示，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所得到的所有其它實(shí)施方式，都屬于本方面所保護(hù)的范圍。