本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適于離體保存過程中蕨類孢子滅菌方法及接種，
背景技術(shù)：
我國的蕨類資源十分豐富，約有2600種，占全世界的1/5，其中很多是中國特有。蕨類植物不僅在生物進(jìn)化和植物系統(tǒng)發(fā)育的研究中起著重要作用，也與人類生活聯(lián)系密切，許多蕨類植物在藥用、觀賞等眾多方面具有重要價值?？梢?，關(guān)于蕨類的商品化生產(chǎn)和栽培育種的開發(fā)具有廣闊前景。蕨類植物組織培養(yǎng)過程中，以孢子作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)具有不損害母株、繁殖系數(shù)大等優(yōu)點，是蕨類植物生產(chǎn)上使用最廣泛的繁殖途徑。蕨類孢子非常微小，呈粉塵狀，在進(jìn)行無菌播種時，常用的方法有濾紙包裹或置于離心管等器皿中，再用次氯酸鈉或氯化汞消毒，無菌水多次沖洗后接種。由于蕨類孢子過于微小，在多個物種同時接種時，包裹法容易將孢子漏出造成混種，而多層的濾紙包裹又可能導(dǎo)致滅菌不充分；而離心滅菌法的操作過程中，其廢液去除困難，容易將孢子吸走，或因消毒液殘留而潛在延長滅菌時間，進(jìn)而導(dǎo)致孢子失活。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，借助當(dāng)前普遍可得的DNA純化柱(包含吸附柱和收集管)提供一種操作簡便，效率高，適于離體保存過程中的蕨類孢子滅菌及接種方法。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
收集孢子，把蕨類孢子葉裝入硫酸紙袋中，標(biāo)記代號后置于通風(fēng)干燥處，待孢子自由脫落；把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；用對折過的硫酸紙收集脫落在紙袋中的孢子，簡單的去除碎葉、環(huán)帶、鱗毛等雜質(zhì)后沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，并做好標(biāo)記，放置于離心管架上；在無菌條件下，加入600μl 75％乙醇，倒立純化柱1-2次，之后200-1200rpm離心20s。從加乙醇開始，直到完成離心，整個操作過程控制在30s左右；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下加入600μl無菌水，反復(fù)吸打溶液使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s，重復(fù)1-2次，洗脫乙醇；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min或2％次氯酸鈉消毒6-8min，反復(fù)吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下加入600μl無菌水，反復(fù)吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s，此操作重復(fù)3-4次，使消毒液徹底洗脫；再向離心之后的吸附柱中添加600μl無菌水，反復(fù)吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上，實現(xiàn)接種。
一種蕨類孢子的消毒及接種方法，該方法包括下述步驟：
步驟1：收集孢子，把蕨類孢子葉片裝入硫酸紙袋中，標(biāo)記代號后置于通風(fēng)干燥處，等孢子自由脫落；
步驟2：把DNA純化柱，規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；
步驟3：在對折過的硫酸紙片上鋪一層擦鏡紙，把自由脫落在硫酸紙袋中的孢子倒在擦鏡紙上，輕微抖動擦鏡紙進(jìn)行簡單的過濾，孢子可以通過擦鏡紙的孔隙，而碎葉、環(huán)帶、鱗毛等雜質(zhì)會留在擦鏡紙上達(dá)到簡單過濾的目的，然后把過濾后的孢子沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，做好標(biāo)記，放置于離心管架上；
步驟4：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立純化柱1-2次，在孢子消毒的同時，吸附柱內(nèi)部也得到滅菌，然后200-1200rpm離心20s，加乙醇，倒立純化柱，離心完成盡量控制在30s內(nèi)；
步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復(fù)吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s，重復(fù)1-2次；
步驟6：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架，在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min或2％次氯酸鈉消毒6-8min，反復(fù)吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s；
步驟7：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上，在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及孢子已經(jīng)過乙醇，氯化汞或次氯酸鈉消毒處于無菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復(fù)吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s；
步驟8：重復(fù)步驟7，3-4次；
步驟9：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，反復(fù)吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上；
步驟10：把培養(yǎng)物移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，再移至光照條件培養(yǎng)2周后孢子萌發(fā)。
所述的一種蕨類孢子的消毒及接種方法在蕨類離體保存過程中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所具備的優(yōu)益性在于：
1.本發(fā)明對蕨類植物生物進(jìn)化和植物系統(tǒng)發(fā)育的研究中起著重要作用，也與人類生活聯(lián)系密切，許多蕨類植物在藥用、觀賞等眾多方面具有重要價值。本發(fā)明對蕨類的商品化生產(chǎn)和栽培育種的開發(fā)的提供了科學(xué)性強(qiáng)的可操作的消毒及接種方法。
2.蕨類植物組織培養(yǎng)過程中，以孢子作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)具有不損害母株、繁殖系數(shù)大等優(yōu)點，是蕨類植物生產(chǎn)上使用最廣泛的繁殖途徑。蕨類孢子非常微小，呈粉塵狀，在進(jìn)行無菌播種時，常用的方法有濾紙包裹或置于離心管等器皿中，再用次氯酸鈉或氯化汞消毒，無菌水多次沖洗后接種。由于蕨類孢子過于微小，在多個物種同時接種時，包裹法容易將孢子漏出造成混種，而多層的濾紙包裹又可能導(dǎo)致滅菌不充分；而離心滅菌法的操作過程中，其廢液去除困難，容易將孢子吸走，或因消毒液殘留而潛在延長滅菌時間，進(jìn)而導(dǎo)致孢子失活。本發(fā)明克服了蕨類植物包裹法和離心滅菌法存在的不足。
3.本發(fā)明克服了蕨類植物孢子在消毒過程中易出現(xiàn)的滅菌不充分、混種及消毒液殘留的問題，可有效降低污染率，提高接種效率。
4.本發(fā)明能高效地進(jìn)行微量的蕨類孢子的消毒和接種，實驗器材易得、成本低廉、操作方便、接種效率高。
具體實施方式
下面用本發(fā)明的實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。
實施例1：
1、材料：金毛狗Cibotiumbarometz(Linnaeus)J.Smith。
2、實驗器材：超凈臺、離心機(jī)、離心管架、DNA純化柱、移液槍、1ml槍頭、滅菌鍋
3、操作步驟：
步驟1：收集孢子，把金毛狗長有孢子的葉片裝入硫酸紙袋中，標(biāo)記代號后置于通風(fēng)干燥處，等孢子自由脫落。
步驟2：把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用。
步驟3：在對折過的硫酸紙片上鋪一層擦鏡紙，把自由脫落在硫酸紙袋中的孢子倒在擦鏡紙上，輕微抖動擦鏡紙進(jìn)行簡單的過濾，孢子可以通過擦鏡紙的孔隙，而碎葉、環(huán)帶、鱗毛等雜質(zhì)會留在擦鏡紙上達(dá)到簡單過濾的目的。然后把過濾后的孢子沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，做好標(biāo)記，放置于離心管架上。
步驟4：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立純化柱1-2次，在孢子消毒的同時，吸附柱內(nèi)部也得到滅菌，然后200-1200rpm離心20s。加乙醇，倒立純化柱，離心完成盡量控制在30s內(nèi)。
步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復(fù)吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s。重復(fù)1-2次。
步驟6：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min，反復(fù)吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s。
步驟7：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及孢子已經(jīng)過乙醇，氯化汞或次氯酸鈉消毒處于無菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復(fù)吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s。
步驟8：重復(fù)步驟7，3-4次。
步驟9：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，反復(fù)吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上。
步驟10：把培養(yǎng)物移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，再移至光照條件培養(yǎng)一周后孢子萌發(fā)。
實施例2：
1、材料：三色鳳尾蕨Pterisaspericaulis var.tricolor(Linden)T.Moore ex E.J.Lowe。
2、實驗器材：超凈臺、離心機(jī)、離心管架、DNA純化柱、移液槍、1ml槍頭、滅菌鍋
3、操作步驟：
步驟1：收集孢子，把三色鳳尾蕨的孢子葉片裝入硫酸紙袋中，標(biāo)記代號后置于通風(fēng)干燥處，等孢子自由脫落。
步驟2：把DNA純化柱(規(guī)格：吸附柱1ml，收集管2ml)、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用。
步驟3：在對折過的硫酸紙片上鋪一層擦鏡紙，把自由脫落在硫酸紙袋中的孢子倒在擦鏡紙上，輕微抖動擦鏡紙進(jìn)行簡單的過濾，孢子可以通過擦鏡紙的孔隙，而碎葉、環(huán)帶、鱗毛等雜質(zhì)會留在擦鏡紙上達(dá)到簡單過濾的目的。然后把過濾后的孢子沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，做好標(biāo)記，放置于離心管架上。
步驟4：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立純化柱1-2次，在孢子消毒的同時，吸附柱內(nèi)部也得到滅菌，然后200-1200rpm離心20s。加乙醇，倒立純化柱，離心完成盡量控制在30s內(nèi)。
步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復(fù)吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s。重復(fù)1-2次。
步驟6：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min或2％次氯酸鈉消毒6-8min，反復(fù)吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s。
步驟7：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及孢子已經(jīng)過乙醇，氯化汞或次氯酸鈉消毒處于無菌狀態(tài)，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復(fù)吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s。
步驟8：重復(fù)步驟7，3-4次。
步驟9：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，反復(fù)吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養(yǎng)基上。
步驟10：把培養(yǎng)物移到溫度25±2℃暗培養(yǎng)3-5天，再移至光照條件培養(yǎng)2周后孢子萌發(fā)。